Reconstructie van de celcyclus oscillaties in Micro van cel-vrije Xenopus ei extracten

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van systeembiologie, zoals het regulerende mechanisme achter het mitotische netwerk en de dynamische eigenschappen en functies van de celcyclusklok. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een grote hoeveelheid druppels met meerdere celcycli in elk zal genereren, die ons een hoog doorvoerkader voor kwantitatieve manipulatie en analyse biedt. Om te beginnen, gooi partijen eieren met onduidelijke grenzen tussen dierlijke en plantaardige palen of onregelmatige witte vlekken op de top van dierlijke palen.

Selecteer vervolgens een geschikte partij eieren van een vrouwelijke kikker en breng de eieren over op een bekerglas van 600 milliliter. Giet een overmaat van 0,2 x MMR buffer, en voorzichtig cysteïne toe te voegen in 1x extract buffer aan de eieren. Schud hierna de beker krachtig met de hand om de geleilagen van de eieren te verwijderen.

Herhaal deze was drie keer met een totaal van 800 milliliter cysteïne buffer of totdat de eieren aggregaat en vestigen op de bodem van het bekerglas. Nadat de geleilaag is verwijderd, was de eieren vier keer in een liter 0,2x MMR-oplossing. Gebruik een glazen pipet op te halen en gooi de eieren die wit.

Giet de MMR buffer uit het bekerglas, en voeg 200 milliliter calcium ionofre oplossing in de eieren. Gebruik een glazen pipet om de eieren zachtjes te roeren totdat ze worden geactiveerd, en verwijder de calcium-ionofre oplossing. Het verlaten van de eieren in calcium ionofre oplossing te lang zal initiëren apoptose.

We roeren de eieren gedurende 1,5 minuten en controleren de activeringsefficiëntie. Als ze niet worden geactiveerd, hervatten roeren, en controleer vaker tot 90% activering is bereikt. Nadat de eieren zich op de bodem van het bekerglas hebben nestelen, controleert u de activeringsefficiëntie.

Goed geactiveerde eieren hebben ongeveer 25% van de dierenpaal en 75% van de plantaardige pool. Was vervolgens de eieren twee maal met een totaal volume van 50 milliliter extractbuffer aangevuld met proteaseremmers. Breng de eieren vervolgens voorzichtig over op een snap-cap microtube van 0,4 milliliter.

Centrifugeren de microbuis gedurende 60 seconden op 200 g en vervolgens op 600 g gedurende 30 seconden om de eieren te verpakken. Gebruik vervolgens een glazen Pasteur pipet om de overtollige buffer op de top van de eieren na elke stap te verwijderen. Na deze, plet de eieren op 15,000 g gedurende 10 minuten op vier graden Celsius.

Gebruik een scheermesje om de buizen te snijden om de drie lagen van geplette eieren te scheiden en houd de ruwe cytoplasma in de middelste laag. Breng vervolgens het ruwe cytoplasma over om ultracentrifugebuizen schoon te maken. Vul het cytoplasma aan met proteaseremmers en cytochalasine B met 10 microgram per milliliter per stuk.

Centrifuge het ruwe cytoplasma op 15, 000 g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Gebruik vervolgens een scheermesje om de buis te snijden en het cytoplasma in de middelste laag te houden. Leg de vers bereide extracten op ijs.

Voeg eerst securin-mCherry mRNA toe aan de voorbereide extracten. Voeg vervolgens 200 microliter van 2%PFPE-PEG fluorfactant toe aan het extract mRNA mengsel. Gebruik een vortex mixer om druppels te genereren, het aanpassen van de vortex snelheid en duur als dat nodig is.

Inspecteer vervolgens visueel de druppels om ervoor te zorgen dat ze uniform in grootte zijn. Met behulp van een pipet van 200 microliter breng je de druppels die op de bovenkant zweven en een gelijk volume oppervlakteactieve stoffen over naar een PCR-buis. Dompel een glazen buis in de druppellaag en wacht tot de druppeltjes ongeveer 75% van de buis vullen.

Duw vervolgens de buis in de oppervlakteactieve laag en vul de buis volledig. Vul vervolgens een schotel met glazen bodem met minerale olie. Gebruik vervolgens een fijne pincet om de met druppel gevulde buis in de olie onder te dompelen.

Gebruik een glazen pipet om zichtbaar vuil of gelekte druppels te verwijderen. Om beweging en lekkage van druppels te voorkomen, moet de met druppels gevulde glazen buis zorgvuldig onder minerale olie worden ondergedompeld. We kunnen de buis aan beide uiteinden met balans duwen of eerst een paar druppels minerale olie aan de uiteinden van de buis toevoegen.

Gebruik hierna een epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een gemotoriseerde xy-fase om de druppels in beeld te brengen. Neem time-lapse video's op in het heldere veld en meerdere fluorescentiekanalen om de zes tot negen minuten totdat de druppels hun activiteit verliezen. Met behulp van dit protocol werden mitotische oscillatie in zowel eenvoudige, kernvrije cellen als gecompliceerde cellen met kernen geproduceerd.

De nuclei-vrije druppels gegenereerd mitotische oscillatie tot 30 ongedempte cycli over 92 uur. Ook werd gekeken naar het vermogen van de mitotische oscillator om downstream mitotische gebeurtenissen te drijven. De zelfvoorzienende mitotische oscillator dreef de veranderingen van de nucleaire morfologie waargenomen door de autonome verandering van verschillende celcyclusfasen.

Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om de tijd bij het maken van het extract geest, want het is tijdgevoelig, en altijd houden de eieren en extract op ijs. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van systeembiologie om fundamentele principes van complexe klokeigenschappen te onderzoeken, zoals tunability en stochasticity in Xenopus laevis.