Name: Genereren van Homo- en Heterografts tussen watermeloen en fles pompoen voor de studie van koude-responsieve MicroRNAs (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Leer een efficiënte methode voor homo- en hetero-enten tussen watermeloen en flespompoen om koude-responsieve microRNAs te bestuderen. Deze techniek biedt inzicht in plantstressreacties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de nationale Natural Science Foundation van China (31772191), het onderzoeksproject voor algemeen belang in de provincie Zhejiang (2017C 32027), de sleutel Science Project van de plantenveredeling in Zhejiang (2016C 02051) en het nationale programma voor de steun van Top-notch jonge Professionals (P.X.).

1. Zaaimaterialen sterilisatie en de kiemkracht
<ol><li>Voor de sterilisatie van het oppervlak, geniet de fles pompoen zaden in een 500 mL-bekerglas gevuld met water op 58 ° C met af en toe roeren, totdat de temperatuur van het water tot 40 ° C. daalt</li>
	<li>Ondertussen, plaatsen van 3 kg van veengrond in een nylon zak en steriliseren, autoclaaf op 120 ° C/0.5 MPa gedurende 20 minuten.</li>
	<li>Houd de fles pompoen zaden voor 4-5 h meer met geen roeren inweken.<ol>
<li>Zodra het water kamertemperatuur bereikt, spoel de zaden 2 x - 3 x met gedestilleerd water.</li>
		<li>Afvoer van het overtollige water en laat de zaden te ontkiemen in een zak gaas bij 28 ° C in een zaal van de groei in het donker.</li>
		<li>Na kieming, zaaien in kunststof potten (6 cm diameter) gevuld met gesteriliseerde veengrond.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wanneer de fles kalebas zaailingen hebben ontwikkeld twee afgevlakte zaadlobben, herhaal stappen 1.1-1.3 met watermeloen zaden. Opmerking: Deze timemanagement zorgt ervoor dat de grootte van de scion en onderstam match goed voor succesvolle enting.</li>
</ol>2. zaailing groei en enten
<ol><li>Groeien de zaailingen in een zaal van de groei met een donker cyclus van 16 uur licht /8-h, houden van de temperatuur bij 28 ° C gedurende de dag (licht) en bij 22 ° C's nachts (donker). Bevloeiing van de zaailingen door toevoeging van water 1 x per dag in de late namiddag.</li>
	<li>Gebruik de methode knippen-enten22 maken van heterografts als de zaailingen van de fles kalebas (wortelstok) in de één ware-bladstadium zijn en de zaadlobben van de watermeloen (scion) opgedoken (niet nog afgevlakte).<ol>
<li>Snij de hypocotyls van de watermeloen zaailingen op 2-3 cm onder de zaadlobben en de bovenkant van de fles kalebas zaailingen op de site direct boven de ware verlaat.</li>
		<li>Gebruik een tandenstoker om een gat in de top van de schoongemaakte fles kalebas zaailingen. Plaats de bijgesneden watermeloen zaailingen in de gaten van de fles kalebas zaailingen te maken heterografts.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Een vergelijkbare methode gebruiken zoals beschreven in stap 2.2 te maken homografts. Nota: Combinaties van Homo- en heterografting moeten altijd worden gemaakt gelijktijdig (Figuur 1), die, in dit geval leidt tot het volgende: watermeloen/fles kalebas (WB, heterograft), watermeloen/watermeloen (WW, homograft) en fles kalebas sluitinstrument kalebas (BB, homograft).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58242/58242fig1.jpg"> Figuur 1: illustratie van het transplantaat combinaties en de geënte planten structuren. WB = watermeloen/fles kalebas heterografting; WW = watermeloen/watermeloen homografting; BB = fles pompoen/fles kalebas homo-enten; WB-S = scion bladeren van de watermeloen/fles kalebas heterografts die werden bemonsterd; WB-R = onderstam bladeren van de watermeloen/fles kalebas heterografts die werden bemonsterd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58242/58242fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
3. postgrafting beheer, koude behandeling en bemonstering
<ol><li>Wrap van de geënte zaailingen met transparant polyethyleen zakken houden van een relatief hoge vochtigheidsgraad voor en onderhouden ze 7 d onder milieuomstandigheden van 16 uur licht/8-h donkere cycli, houden van de temperatuur bij 28 ° C gedurende de dag (licht) en bij 22 ° C tijdens de nacht (donker).</li>
	<li>Ontdek de transparant polyethyleen zakken op de 7e dag. Laat die de planten groeien voor een extra 7-10 dagen onder dezelfde voorwaarden.</li>
	<li>Verdeel de gezonde uniforme zaailingen in twee groepen, één voor koud behandeling (gewezen) en één voor controle (niet-onderstreept). Voor de controlegroep, laat de zaailingen in de dezelfde groei zaal (bij 28 ° C) voor een extra 48 h, terwijl voor de koude-benadrukt-groep, de zaailingen overbrengen in een kamer van de groei met een constante temperatuur op 6 ° C, met licht/donker voorwaarden zoals beschreven in stap 2.1.</li>
	<li>Proef de bladeren van de scion en de wortelstok van de protheses (Figuur 1). De monsters onmiddellijk bevriezen in vloeibare stikstof en hen bij-70 ° C te bewaren tot gebruik.</li>
</ol>4. bibliotheek voorbereiding en High-throughput Sequencing
<ol><li>De bevroren monsters overbrengen in een 2-mL microcentrifuge buis in vloeibare stikstof.</li>
	<li>Een roestvrij stalen kraal (5 mm diameter) toevoegen aan elke buis met de weefsels.</li>
	<li>Meng de weefsels tot een fijn poeder met een kraal molen homogenizer voor 30 s.</li>
	<li>Voor elke praktijk combinatie, neem gelijke hoeveelheden (0,1 g) van gemalen monster van tien zaailingen en meng ze in een centrifugebuis van 10 mL. Het toevoegen van een juiste hoeveelheid guanidium hydrochloride reagens (Tabel of Materials) op basis van de fabrikant suggesties overeenkomt met het weefsel gewicht.<ol>
<li>Verwijderen van genomic DNA verontreinigingen door toevoeging van RNA-vrije DNase I tot en met 150 U/mL bij 37 ° C gedurende 1 uur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bepalen van de totale RNA hoeveelheid op een microcapillary elektroforese systeem om de integriteit van RNA nummer > 7.0. Opmerking: Een RIN > 7.0 zorgt voor een hoge integriteit van de RNA-monsters.</li>
	<li>Het bereiden van kleine RNA bibliotheken met behulp van een commerciële kit (Tabel of Materials) volgens instructies van de fabrikant. Gebruik 1 µg totaal RNA per monster op gang te brengen.<ol>
<li>Ontdooi bibliotheek normalisatie reagentia en adapters volgens de richtlijnen van de fabrikant. Kleine RNAs met de 5 ' en 3 ' adapters afbinden en elueer en zuiveren van hen. Vervolgens, omgekeerde transcriberen de 5 ' en 3' afgebonden kleine RNAs volgens de richtlijnen van de fabrikant.</li>
		<li>Uitvoeren van PCR versterking volgens protocol van de fabrikant. Het beoordelen van de kwaliteit en kwantiteit van de cDNA bibliotheken met behulp van een systeem van de Elektroforese van het microcapillary.</li>
		<li>Laden 1 µL van een RNA-bibliotheek op een microcapillary elektroforese systeem om ervoor te zorgen de RIN > 7.0.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Volgorde van de kleine RNA-bibliotheken op een high-throughput sequencing instrument zoals elders beschreven23.</li>
</ol>5. miRNA en Target Gene voorspelling
<ol><li>Voor elke praktijk combinatie, gebruik de open source UEA sRNA workbench 2.4-plant versie24 te ruimen van slechte kwaliteit sequenties en trim adapter-sequenties van het ruwe luidt als volgt. Negeren van de sequenties die kleiner dan 18 zijn nt of groter zijn dan 32 nt.</li>
	<li>Vergelijk de 'schone' sequenties van hoge kwaliteit aan de open source Rfam 11.0 database te herkennen en verwijderen leest van rRNA, tRNA, snoRNA en andere snRNAs.</li>
	<li>Hiermee lijnt u de resterende leest aan het genoom van de verwijzing met behulp van een reeks van korte-lezen uitlijning gereedschap25. Geen wanverhouding is toegestaan in deze stap. Opmerking: De vergadering van de "97103" genoom watermeloen V126 werd gebruikt voor de aanpassing aan het lezen van de scion en de fles kalebas "HZ" genoom vergadering V127 werd gebruikt voor leesbewerkingen van de onderstam.</li>
	<li>Vergelijk de resterende leest tegen bekende volwassen miRNAs in de open source miRBase 22,028. Leest die homoloog aan bekende miRNAs worden geclassificeerd als geconserveerde miRNAs.</li>
	<li>Vergelijk de sequenties die niet overeenkomen met de voorlopers van de bekende miRNA met het genoom. Gebruiken de MIREAP29 -algoritme voor het detecteren van mogelijke nieuwe miRNAs onder standaardinstellingen.</li>
</ol>6. differentiële expressie en Ontology van het gen analyse
<ol><li>Vergelijk de niveaus van de expressie van miRNAs op basis van hun Lees graven. miRNAs met een P-waarde (Fisher's exacte test) < 0,05 en een absolute log2 waarde > 2 worden beschouwd als differentieel worden uitgedrukt.</li>
	<li>Gebruik een antisense oligonucleotide doel site selectie tool (TargetFinder)30 te voorspellen van potentiële aanvullende mRNAs (miRNA doelgenen) naar de differentially uitgedrukte miRNAs onder standaardparameters.</li>
	<li>Gebruik het ontology van het gen (ga) verrijking analytisch hulpmiddel31 te onthullen de miRNA doel genen ontologie (GO) patronen onder een P- waardedrempel van 0,05 voor statistische significantie.</li>
</ol>

<ol><li>Schwarz, D., Rouphael, Y., Colla, G., Venema, J. H. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304423810004243">Grafting as a tool to improve tolerance of vegetables to abiotic stresses: Thermal stress, water stress and organic pollutants.</a> Scientia Horticulturae. 127, 162-171 (2010).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://journals.tubitak.gov.tr/havuz/bot-1404-115.pdf">Mechanisms of tolerance differences in cucumber seedlings grafted on rootstocks with different tolerance to low temperature and weak light stresses.</a> Turkish Journal of Botany. 39 (4), 606-614 (2015).</li>
<li>Li, C. H., Li, Y. S., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2468014116000030">Dynamic Expression of miRNAs and Their Targets in the Response to Drought Stress of Grafted Cucumber Seedlings.</a> Horticultural Plant Journal. 2 (1), 41-49 (2016).</li>
<li>Rouphael, Y., Cardarelli, M., Colla, G., Rea, E. <a target="_blank" href="http://hortsci.ashspublications.org/content/43/3/730.full">Yield, mineral composition, water relations, and water use efficiency of grafted mini-watermelon plants under deficit irrigation.</a> HortScience. 43 (3), 730-736 (2008).</li>
<li>Savvas, D., et al. <a target="_blank" href="http://hortsci.ashspublications.org/content/44/7/1978.full">Interactive effects of grafting and manganese supply on growth, yield, and nutrient uptake by tomato.</a> HortScience. 44 (7), 1978-1982 (2009).</li>
<li>Aloni, B., Cohen, R., Karni, L., Aktas, H., Edelstein, M. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304423810004115">Hormonal signaling in rootstock-scion interactions.</a> Scientia Horticulturae. 127, 119-126 (2010).</li>
<li>Rouphael, Y., Caradrelli, M., Rea, E., Colla, G. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11099-012-0002-1">Improving melon and cucumber photosynthetic activity, mineral composition, and growth performance under salinity stress by grafting onto Cucurbita hybrid rootstocks.</a> Photosynthetica. 50 (2), 180-188 (2012).</li>
<li>Louws, F. J., Rivard, C. L., Kubota, C. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304423810004462">Grafting fruiting vegetables to manage soilborne pathogens, foliar pathogens, arthropods and weeds.</a> Scientia Horticulturae. 127 (2), 127-146 (2010).</li>
<li>Asins, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+rootstock-mediated+nitrogen+%28N%29+uptake+and+root-to-shoot+signalling+at+contrasting+N+availabilities+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of rootstock-mediated nitrogen (N) uptake and root-to-shoot signalling at contrasting N availabilities in tomato.</a> Plant Science. 263, 94-106 (2017).</li>
<li>Yin, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.actahort.org/books/1086/1086_26.htm">Role of protective enzymes in tomato rootstocks to resist root knot nematodes.</a> Acta Horticulturae. 1086 (1086), 213-218 (2015).</li>
<li>Gaion, L. A., Carvalho, R. F. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00344-017-9759-6">Long-Distance Signaling: what grafting has revealed?</a> Journal of Plant Growth Regulation. 37 (2), 694-704 (2018).</li>
<li>Turnbull, C. G. Grafting as a research tool. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTurnbull%2C+CG+%22Plant+Developmental+Biology%22">Plant Developmental Biology</a>. Hennig, L., Köhler, C. , Humana Press. New York City, NY. 11-26 (2010).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grafting-responsive+miRNAs+in+cucumber+and+pumpkin+seedlings+identified+by+high-throughput+sequencing+at+whole+genome+level%5BTitle%5D)+AND+%22Physiologia+Plantarum%22%5BJournal%5D)">Grafting-responsive miRNAs in cucumber and pumpkin seedlings identified by high-throughput sequencing at whole genome level.</a> Physiologia Plantarum. 151 (4), 406-422 (2014).</li>
<li>Lakhotia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+miRNAome+in+root%2C+stem%2C+leaf+and+tuber+developmental+stages+of+potato+%28Solanum+tuberosum+L.%29+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing.</a> BMC Plant Biology. 14 (1), 6(2014).</li>
<li>Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Bartel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+and+their+regulatory+roles+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs and their regulatory roles in plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 57, 19-53 (2006).</li>
<li>Puzey, J. R., Kramer, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+conserved+Aquilegia+coerulea+microRNAs+and+their+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Genetic%22%5BJournal%5D)">Identification of conserved Aquilegia coerulea microRNAs and their targets.</a> Genetic. 448 (1), 46-56 (2009).</li>
<li>Matthewman, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR395+is+a+general+component+of+the+sulfate+assimilation+regulatory+network+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">miR395 is a general component of the sulfate assimilation regulatory network in Arabidopsis.</a> FEBS Letters. 586 (19), 3242-3248 (2012).</li>
<li>Ali, E. M., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s13562-015-0334-6">Transmission of RNA silencing signal through grafting confers virus resistance from transgenically silenced tobacco rootstocks to non-transgenic tomato and tobacco scions.</a> Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology. 25 (3), 245-252 (2016).</li>
<li>Li, Y. S., Li, C. H., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11738-016-2070-5">MicroRNA and target gene responses to salt stress in grafted cucumber seedlings.</a> Acta Physiologiae Plantarum. 38 (2), 1-12 (2016).</li>
<li>Pagliarani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+accumulation+of+miRNAs+differentially+modulated+by+drought+stress+is+affected+by+grafting+in+grapevine%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">The accumulation of miRNAs differentially modulated by drought stress is affected by grafting in grapevine.</a> Plant Physiology. 173 (4), 2180-2195 (2017).</li>
<li>Liu, N., Yang, J. H., Guo, S. G., Xu, Y., Zhang, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+and+comparative+analysis+of+conserved+and+novel+microRNAs+in+grafted+watermelon+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification and comparative analysis of conserved and novel microRNAs in grafted watermelon by high-throughput sequencing.</a> PLoS One. 8 (2), e57359(2013).</li>
<li>Song, G. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/294376070_Development_of_2JC-350_automatic_grafting_machine_with_cut_grafting_method_for_vegetable_seedling">Development of 2JC-350 automatic grafting machine with cut grafting method for vegetable seedling.</a> Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering. 22 (12), 103-106 (2006).</li>
<li>Kumar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+leaf+rust+responsive+miRNAs+in+wheat+%28triticum+aestivum+l.%29+using+high-throughput+sequencing+and+prediction+of+their+targets+through+degradome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Uncovering leaf rust responsive miRNAs in wheat (triticum aestivum l.) using high-throughput sequencing and prediction of their targets through degradome analysis.</a> Planta. 245 (1), 1-22 (2016).</li>
<li>Kohli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+wilt+and+salt+stress-responsive+microRNAs+in+chickpea+through+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of wilt and salt stress-responsive microRNAs in chickpea through high-throughput sequencing.</a> PLoS One. 9 (10), e108851(2014).</li>
<li>Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://sacan.biomed.drexel.edu/cmteditor/program/download?confname=ssdbm2013&pid=k2&file=paper">Computational challenges in next-generation genomics. International Conference on Scientific and Statistical Database Management.</a> ACM. 2, (2013).</li>
<li>Guo, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+draft+genome+of+watermelon+%28Citrullus+lanatus%29+and+resequencing+of+20+diverse+accessions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The draft genome of watermelon (Citrullus lanatus) and resequencing of 20 diverse accessions.</a> Nature Genetics. 45, 51-58 (2013).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gourdbase%3A+a+genome-centered+multi-omics+database+for+the+bottle+gourd+%28lagenaria+siceraria%29%2C+an+economically+important+cucurbit+crop%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Gourdbase: a genome-centered multi-omics database for the bottle gourd (lagenaria siceraria), an economically important cucurbit crop.</a> Scientific Reports. 8 (1), 306(2018).</li>
<li>Wang, X. F., Liu, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Curation+of+miRBase+Annotation+Using+Integrated+Small+RNA+High-Throughput+Sequencing+Data+for+C.+elegans+and+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Systematic Curation of miRBase Annotation Using Integrated Small RNA High-Throughput Sequencing Data for C. elegans and Drosophila.</a> Frontiers in Genetics. 2, 25(2011).</li>
<li>Mireap: MicroRNA discovery by deep sequencing. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://sourceforge.net/projects/mireap/">http://sourceforge.net/projects/mireap/</a> (2008).</li>
<li>Bo, X. C., Wang, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TargetFinder%3A+a+software+for+antisense+oligonucleotide+target+site+selection+based+on+MAST+and+secondary+structures+of+target+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">TargetFinder: a software for antisense oligonucleotide target site selection based on MAST and secondary structures of target mRNA.</a> Bioinformatics. 21 (8), 1401-1402 (2005).</li>
<li>Tang, H., et al. GOATOOLS: Tools for Gene Ontology. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://doi.org/10.5281/zenodo.31628">https://doi.org/10.5281/zenodo.31628</a> (2015).</li>
<li>Wang, L. P., Li, G. J., Wu, X. H., Xu, P. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304423815303794">Comparative proteomic analyses provide novel insights into the effects of grafting wound and hetero-grafting per se on bottle gourd.</a> Scientia Horticulturae. 200 (8), 1-6 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen. De kleine RNA sequencing gegevens wordt gestort in de GenBank de toetreding onder nummer SRP136842.

In dit protocol beschreven we in detail een zeer efficiënte en reproduceerbare methode om homo- en heterografts tussen watermeloen en fles kalebas te maken. Deze methode, waarvoor geen specifieke apparatuur, is zeer eenvoudig te bedienen en heeft doorgaans een zeer hoge overlevingskansen enten. De methode kan ook worden gebruikt om de protheses voor andere Cucurbitaceae met niet, zoals tussen watermeloen, komkommer en pompoen.
Het is vermeldenswaard dat de relatieve grootte (leeftijd) van de o...

Enten is lang werkzaam als een agrarische techniek om plantaardige productie en tolerantie aan biotische en abiotische stress1,2,3te verbeteren. In heterografting systemen, kunnen elite wijnstokdelen onder de grond betere opname van water en voedingsstoffen voor planten, versterken van weerstand tegen ziekteverwekkers van de bodem en beperken van de negatieve effecten van metalen toxiciteit4,5, waarin de protheses een verbeterde kan verlenen kracht van de groei en verhoogde tolerantie voor het milieu benadrukt. In veel gevallen, heterografting kan ook gevolgen hebben vrucht kwaliteiten in tuinbouw planten, wat leidt tot verbeterde fruit smaak en meer inhoud van gezondheidsgerelateerde verbindingen6,7. Het is gebleken dat de interlokale overdracht van fytohormonen, RNAs peptides en proteïnen tussen de onderstam en de scion is een fundamenteel mechanisme moduleren van de groei en ontwikkeling herprogrammering van scion planten8,9 ,10. Enten wijd gebruikt in studies van interlokale signalering en vervoer in verband met milieu aanpassing11. Praktijk experimenten zijn vooral krachtig voor ondubbelzinnige detectie van overdraagbare moleculen in het ontvangen van weefsel of vasculaire sap, en activering of onderdrukking van moleculaire targets te wijten aan de signaal overdracht12.
Non-codering RNAs, een grote klasse van RNA die uitoefenen van belangrijke regelgevende functies in cellen, zijn bij het spelen een rol bij het vergemakkelijken van de aanpassing van de plant aan de abiotische stress13gemeld. miRNAs zijn endogene klein niet-coderende RNAs van ongeveer 20-24 nt. Studies is gebleken dat de regelgevende rol van miRNAs in verschillende aspecten van de activiteiten van de plant, zulke zoals groei, schieten lateraal wortel vorming14,15,16, opname van voedingsstoffen, sulfaat metabolisme en homeostase17en reacties op biotische en abiotische stress18. Onlangs, is de uitdrukking van miRNAs en hun doelgenen hielden verband met zout stress tolerantie in heterografted komkommer zaailingen19. In de intervariety transplantaties van druivenmost, de reacties van miRNA expressie aan droogte stress bleken genotype-afhankelijke20.
De snelle ontwikkeling en het verminderen van de kosten van high-throughput sequencing technologie hebben een grote kans voor de studie van miRNA verordeningen in landbouwkundige planten verstrekt. Watermeloen (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.), een belangrijk cucurbit gewas geteeld over de hele wereld, is gevoelig voor lage temperaturen. Fles kalebas (Lagenaria siceraria [Molina] Standl.) is een klimaat-veerkrachtiger cucurbit vaak door boeren gebruikt om te enten met watermeloen. Het primaire doel van de huidige studie is om een standaard, efficiënt, en handige methode voor het maken van heterografts tussen watermeloen (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.) en fles kalebas (Lagenaria siceraria [Molina] Standl). Dit protocol biedt ook een gedetailleerde regeling van experimentele en analytische procedures voor de studie van het Reglement van miRNA expressies na enten, die is handig voor het openbaren van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de voordelen van de heterografting.
De materialen van de plant gebruikt in deze studie omvatten de cultivar watermeloen en de fles kalebas landras. Watermeloen cultivar is een commerciële cultivar met hoge opbrengst maar gevoelig voor lage temperaturen. Fles kalebas landras is een populaire onderstam voor enten met watermeloen, komkommer en fles kalebas, vanwege zijn uitstekende tolerantie van lage temperaturen21.

<table><tbody><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>RNA-free DNase I</td><td>Takara</td><td>D2270A</td><td></td></tr><tr><td>Truseq Small RNA sample prep Kit</td><td>Illumina</td><td>RS-200-0012</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bionalyser</td><td>Agilent</td><td>5067</td><td></td></tr><tr><td>DNA Polymerase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>UEA sRNA workbench 2.4-plant version&nbsp;(software)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/</td></tr><tr><td>Rfam 11.0 database&nbsp;(website)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>http://rfam.janelia.org</td></tr><tr><td>miRBase 22.0&nbsp;(website)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>http://www.mirbase.org/</td></tr><tr><td>MIREAP(software)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>https://sourceforge.net/projects/mireap/</td></tr><tr><td>TargetFinder&nbsp;(software)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>http://targetfinder.org/</td></tr></tbody></table>

genereren van homo- en heterografts tussen watermeloen en fles pompoen voor de studie van koude-responsieve micrornas

Generating Homo- and Heterografts Between Watermelon and Bottle Gourd for the Study of Cold-responsive MicroRNAs

MicroRNAs (miRNAs) zijn endogene klein niet-coderende RNAs van ongeveer 20-24 nt, bekend om te spelen een belangrijke rol in de ontwikkeling van planten en aanpassing. Er is een accumulatie bewijsmateriaal waaruit blijkt dat de uitingen van bepaalde miRNAs worden gewijzigd wanneer enten, een vaak gebruikt door landbouwers voor het verbeteren van gewas tolerantie voor biotische en abiotische stress landbouwpraktijken. Fles kalebas is een inherent klimaat-veerkrachtig gewas in vergelijking met vele andere belangrijke Cucurbitaceae met niet, met inbegrip van watermeloen, waardoor het een van de meest gebruikte onderstammen voor het laatste. De recente vooruitgang van high-throughput sequencing technologieën heeft grote kansen te onderzoeken van koude-responsieve miRNAs en hun bijdragen aan heterograft voordelen; Toch zijn voldoende experimentele procedures een voorwaarde voor dit doel. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het efficiënt genereren van homo- en heterografts tussen de koud-gevoelige watermeloen en de koude-tolerante fles kalebas, naast weefsel bemonsteringswijzen, gegevens generatie, en data-analyse. De gepresenteerde methoden zijn ook handig voor andere systemen met plant-enten, te ondervragen miRNA verordeningen onder verschillende milieu benadrukt, zoals warmte, droogte en zoutgehalte.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58242/58242fig2.jpg"> Figuur 2: fenotypes van verschillende enten bij kamertemperatuur en koude-benadrukte voorwaarden. (een) dit paneel toont homo- en heterografted zaailingen op kamertemperatuur als het besturingselement. (b) dit paneel toont homo- en heterografted zaailingen na 48u van koude behandeling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58242/58242fig2large.jpg...

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het efficiënt maken van homo- en heterografts tussen watermeloen en fles kalebas, naast de methoden van bemonstering van weefsel, generatie van de gegevens en data-analyse, voor het onderzoek van koude-responsieve microRNAs.

Genereren van Homo- en Heterografts tussen watermeloen en fles pompoen voor de studie van koude-responsieve MicroRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are endogenous small non-coding RNAs of about 20 - 24 nt, known to play important roles in plant development and adaptation. There is ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in miRNA reactie op het vermogen om te stressen in plantentransplantaten, zoals hoe miRNA worden gereguleerd onder koude stress in watermeloen fles kalebasts. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het zeer efficiënte en reproduceerbare methode is om homo en heterografts te maken. Het vereist geen specifieke apparatuur, het is zeer eenvoudig uit te voeren, en meestal resulteert in een zeer hoge overlevingskans van enten.Via deze methode, kan inzicht geven in miRNA reactie op koude stress in de watermeloen fles kalebas graft systeem. Het kan ook worden toegepast op andere moderne organismen voor het onthullen van de mechanismen van lokale en lange afstand miRNA transport. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang als de enting stappen zijn moeilijk te leren.Deze stap vereist geavanceerde vaardigheden en zijn de sleutel tot het voortbestaan van de geënte planten. Om te beginnen, weken fles kalebas zaden in een 500 milliliter bekerglas van 58 graden Celsius water. Roer de zaden af en toe tot de temperatuur van het water daalt tot 40 graden Celsius.Terwijl het water afkoelt, doe drie kilo veengrond in een nylon zak en autoclave het. Zodra het water op kamertemperatuur is, spoel de zaden twee tot drie keer in gedestilleerd water en giet het overtollige water af. Laat de zaden ontkiemen in een gaaszak bij 28 graden Celsius in de donkere groeikamer.Na ontkieming, zaai de zaden in plastic potten gevuld met de gesteriliseerde veengrond. Wanneer de fles kalebas zaailingen ontwikkelen twee afgeplatte cotyledons, herhaal dit proces met watermeloen zaden. Kweek de fles kalebas en watermeloen zaailingen in een groeikamer.Voeg 's middags één keer per dag water toe aan de zaailingen. Snijd vervolgens de hypocotyls van de watermeloenzaailingen twee tot drie centimeter onder de cotyledons. Snijd de bovenkant van de fles kalebas zaailingen aan de zijkant, direct boven de cotyledons.Gebruik dan een tandenstoker om een gat te maken in de bovenkant van de bijgesneden fles kalebas zaailingen. Steek de bijgesneden watermeloen zaailingen in het gat om heterografts te maken. Bereid hierna homografts voor met de eerder beschreven methode.Wikkel eerst de geënte zaailingen in transparante polyethyleenzakken om een relatief hoge luchtvochtigheid te behouden. Houd vervolgens de verpakte zaailingen zeven dagen in een groeikamer. Na de zevende dag, verwijder de zakken en laat de planten om te groeien onder dezelfde omstandigheden voor zeven tot 10 dagen.Verdeel de zaailingen in twee groepen, een voor koude behandelingen en een voor controle. Breng de controlezaaiers terug naar dezelfde omgevingsomstandigheden. Plaats de koud behandelde zaailingen in een groeikamer ingesteld op zes graden Celsius met dezelfde lichte donkere omstandigheden als de controlegroep.Laat na 48 uur de monsters van de telg en onderstammen van de grafts. Vries de monsters onmiddellijk in vloeibare stikstof en bewaar ze op min 70 graden Celsius. Breng het bevroren monster over op een twee milliliter microcentrifugebuis in vloeibare stikstof.Voeg een roestvrijstalen kraal toe aan elke monsterbuis en homogeniseer de weefsels tot een fijn poeder. Voor elke enting combinatie, neem gelijke hoeveelheden grondmonster van 10 zaailingen en meng ze in een 10 milliliter centrifuge buis. Voeg een passende hoeveelheid guanidiumhydrochloride reagens toe.Voeg vervolgens RNA-vrije DNase een tot 150 eenheden per milliliter bij 37 graden Celsius voor een uur. Bepaal vervolgens de totale RNA-hoeveelheid op een microcapillaire elektroforesesysteem. Ontdooi hierna de normalisatiereagentia en adapters van de bibliotheek.Dan ligate kleine RNase met de vijf prime en drie prime adapters, en elute en zuiveren. Reverse transcriberen de vijf prime en drie prime ligated kleine RNase volgens de richtlijnen van de fabrikant. Voer vervolgens PCR-versterking uit volgens het protocol van de fabrikant.Gebruik vervolgens het microcaillaire elektroforesesysteem om ervoor te zorgen dat het RNA-integriteitsnummer groter is dan zeven. Laad een microliter van een RNA-bibliotheek op het microcapillaire elektroforesesysteem om ervoor te zorgen dat het RNA-integriteitsnummer groter is dan zeven. Tot slot, sequentie de kleine RNA bibliotheken op een hoge doorvoer sequencing instrument.Met behulp van dit protocol werd een overlevingskans van 98% voor enten en de fenotypes voor kamertemperatuur en koude stress voorwaarden verkregen. sRNAs van 24 nucleotiden vormen de grootste klasse van sRNAs in alle entencombinatie, ongeacht de temperatuurbehandeling. Na 48 uur koude behandeling werden respectievelijk 30 en 268 microRNAs op en neer gereglementeerd.In de bladeren van de telg in heterografts, omgekeerd, in de bladeren van de onderstam, waren respectievelijk 31 en 12 microRNAs op en neer gereglementeerd. In de watermeloen-watermeloen homografts, 64 en 83 microRNAs werden op en neer geregeld, respectievelijk. Dit toonde aan dat heterografting diepgaande herprogrammering van de microRNA uitdrukkingen veroorzaakte.Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om de relatieve grootte en leeftijd van de dochter stengel herinneren en de telg is van cruciaal belang voor het maken van een succesvolle graft. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals lncRNA-sequencing, proteomische profilering worden uitgevoerd om de regulatie van lncRNA en eiwit en het coderingssysteem in het entingssysteem te onderzoeken. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoek op het gebied van plantaardige abiotische tolerantie om het mechanisme van het voordeel van plantent enten in Cucurbitaceae en daarbuiten te onderzoeken.Vergeet niet dat het werken met guanidinehydrochloride zeer gevaarlijk kan zijn en dat er altijd passende voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure.

generating-homo-heterografts-between-watermelon-bottle-gourd-for

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

Deze video beschrijft micro-injection, een veelgebruikte methode om transgene C. elegans stammen te creëren.  In het voorbeeld zien we micro-injection gebruikt om een ribonucleoproteïne (RNP) complex voor CRISPR-bases genbewerking te introduceren.

Gonad Microinjection: Een methode van samengestelde levering direct in de kiembaan van C. elegans

Met behulp van DNA assembly kunnen meerdere CRISPR vectoren parallel worden geconstrueerd in een enkele klonen reactie, waardoor de bouw van grote aantallen vectoren CRISPR een eenvoudige taak. Tomaat harige wortels zijn een uitstekend model systeem om CRISPR vectoren te valideren en het genereren van mutant materialen.

High-throughput CRISPR Vector Constructie en karakterisering van DNA Wijzigingen van Generation van Tomato Hairy Roots

De microinjectie van muis oocyten wordt vaak gebruikt voor zowel klassieke transgenese ( dwz de willekeurige integratie van transgenen) en CRISPR-gemedieerde gen targeting. Dit protocol beoordeelt de nieuwste ontwikkelingen in microinjectie, met speciale nadruk op kwaliteitscontrole en genotyping strategieën.

Generatie van genetisch gemodificeerde muizen via de microinjectie van oocyten

Dit protocol beschrijft de stappen voor het kloneren van meerdere single-guide RNA's in een RNA-concatemervector, die bijzonder geschikt is voor het creëren van multi-gen-knockouts met behulp van CRISPR / Cas9-technologie. De opkomst van dubbele knockouts in darmorganoïden wordt getoond als een mogelijke toepassing van deze methode.

Een protocol voor meerdere gene-knock-out in muizen, kleine darmorganen, met behulp van een CRISPR-concatemer

Hier presenteren we protocollen voor het verzamelen en microinjecting precellular westelijke maïs rootworm embryo's bestemd voor de uitoefening van functionele-genomic assays zoals germline transformatie en CRISPR/Cas9-genoom bewerken.

Microinjection van Western maïswortelboorder, Diabrotica virgifera virgifera, embryo's voor Germline transformatie of CRISPR/Cas9 genoom bewerking

Dit doel van dit protocol is het produceren van chimerische axolotls met haploïde voorpoten afgeleid van Cas9-mutagenized donorweefsel met behulp van embryonale weefsel enten technieken.

Generatie chimeric Axolotls met Mutant Haploid Ledematen door embryonale grafting

We presenteren een gedetailleerd protocol voor het op aardappelvirus X (PVX) gebaseerde microRNA-uitschakelingssysteem (VbMS) om endogene microRNA's (miRNA's) in aardappelen functioneel te karakteriseren. Target mimic (TM) moleculen van miRNA van belang worden geïntegreerd in de PVX-vector en tijdelijk uitgedrukt in aardappel om de doel miRNA- of miRNA-familie tot zwijgen te brengen.

Aardappelvirus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Aardappel.

Hier wordt een protocol gepresenteerd van Helicoverpa armigera (Hübner) embryo micro-injectie en knock-out mutant identificatie gemaakt door CRISPR / Cas9 genoombewerking. Gemuteerde insecten maken verder onderzoek naar genfunctie en interactie tussen verschillende genen in vivo mogelijk.

Embryo Microinjectie en Knockout Mutant Identificatie van CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (Hübner)

Een agrobacterium-based injection (agroinjectie) protocol wordt gepresenteerd voor de inenting van vossenstaart mozaïek virus en suikerriet mozaïek virusclones in maïs zaailingen. Inenting op deze manier leidt tot virale infectie, virus-geïnduceerde gen-uitschakeling van markergenen en virale overexpressie van GFP.

Directe agroinoculatie van maïszaailingen door injectie met recombinant vossenstaartmozaïekvirus en suikerrietmozaïekvirus Infectieuze klonen

Dit protocol beschrijft micro-injectie en in vivo elektroporatie voor regionaal beperkte CRISPR-gemedieerde genoombewerking in de eileider van de muis.

Somatische genoom-engineered muismodellen met behulp van in vivo micro-injectie en elektroporatie

Deze studie ontwikkelde een workflow voor het genereren en onderhouden van stabiele mutantlijnen voor de zoetwaterappelslak, Pomacea canaliculata. De protocollen omvatten het verzamelen van zygoten, hun micro-injectie met de CRISPR/Cas9-systeemcomponenten om genoombewerking te induceren, ex ovo-kweek van embryo's en genotypering na gecontroleerde kruisingen.

De gouden appelslak Pomacea canaliculata: Van zygoten tot stabiele mutantlijnen

Leer een efficiënte methode voor homo- en hetero-enten tussen watermeloen en flespompoen om koude-responsieve microRNAs te bestuderen. Deze techniek biedt inzicht in plantstressreacties.

Genereren van Homo- en Heterografts tussen watermeloen en fles pompoen voor de studie van koude-responsieve MicroRNAs

Meer video's verkennen