Name: Een netto schimmel gebaseerde methode van de steiger-free driedimensionale cardiale weefsel schepping (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Leer een mal-gebaseerde methode voor driedimensionale hartweefselcreatie zonder steiger met behulp van sferoïden. Deze techniek produceert kloppende weefsels met structurele integriteit en synchroon gedrag voor cardiaal onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs erkennen de volgende financieringsbron: het Fonds van de Magic dat de zaken voor cardiovasculair onderzoek.

1. bereiding van Cardiomyocytes
<ol><li>Jas 6-Wells-platen met kelder membraan matrix en cultuur mens-geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs)17zoals hiervoor is beschreven.</li>
	<li>Differentiëren hiPSCs in hiPSC-CMs met behulp van de eerder beschreven methoden18.</li>
	<li>Op 16-18 d na differentiatie, schorsen de cardiomyocytes door elk putje met 2 mL 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) spoelen zonder calcium of magnesium, gevolgd door incubatie met 1 mL/goed van trypsine of cel dissociatie reagens (Zie tabel van Materialen) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Neutraliseren van de trypsine of cel dissociatie-reagens (Zie Tabel van materialen) met behulp van een gelijk volume Roswell Park Memorial Instituut (RPMI) cel media aangevuld met B-27 (RPMI/B-27 cel media). Pipetteer omhoog en omlaag om het zelfklevend cellen los.</li>
	<li>De zwevende cardiomyocytes serologische Pipetteer 10 mL verzamelen en overbrengen naar een conische buis van 50 mL.</li>
	<li>Centrifugeer de celsuspensie bij 250 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur te verkrijgen van een cel-pellet.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet in 10 mL RPMI/B-27 cel media.</li>
	<li>20 µL celsuspensie combineren met een gelijke hoeveelheid van 0,4% Trypan blauwe oplossing en meng voorzichtig.</li>
	<li>Gebruik een handmatige hemocytometer te tellen en het verkrijgen van de concentratie en cel levensvatbaarheid van de celsuspensie.</li>
</ol>2. voorbereiding van de fibroblasten
<ol><li>Het initiëren van een cultuur van een lijn van de cel van menselijke cardiale fibroblast (HCF)-(volwassen ventriculaire type), zoals eerder beschreven16.</li>
	<li>Opschorten van de HCFs door aan het broeden ze met een passend bedrag van trypsine of cel dissociatie-reagens (Zie Tabel van materialen) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur16. Voor een T175 kolf, werd 10 mL trypsine of cel dissociatie reagens gebruikt.</li>
	<li>Neutraliseren van de trypsine of cel dissociatie-reagens (Zie Tabel van materialen) met behulp van een gelijk volume van medium, vervolgens het monster overbrengen in een conische buis van 50 mL en centrifugeer de celsuspensie bij 250 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur te verkrijgen een pellet.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet in 10 mL fibroblast groeimedium (Zie Tabel van materialen).</li>
	<li>20 µL van de celsuspensie HCF combineren met een gelijke hoeveelheid van 0,4% trypan blauwe oplossing en meng voorzichtig.</li>
	<li>Gebruik een geautomatiseerde cel teller of handmatige hemocytometer te tellen en de concentratie en cel levensvatbaarheid van de nieuwe celsuspensie te krijgen.</li>
</ol>3. voorbereiding van de endotheliale cellen
<ol><li>Het initiëren van een cultuur van een lijn van menselijke navelstreng ader endothelial cel (HUVEC), zoals eerder beschreven17. Opschorten van de HUVECs door aan het broeden ze met een passend bedrag van trypsine of cel dissociatie-reagens (Zie Tabel van materialen) gedurende 3 minuten op kamer temperatuur17. Neutraliseren van de trypsine of cel dissociatie-reagens (Zie Tabel van materialen) met behulp van een gelijk volume van medium, vervolgens overbrengen naar een conische buis van 50 mL en centrifugeer de celsuspensie bij 250 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur te verkrijgen van een pellet. Opmerking: Voor een T175 kolf, 10 mL trypsine of cel dissociatie reagens werd gebruikt.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet in 10 mL endothelial cel groeimedium (Zie Tabel van materialen).</li>
	<li>Combineer 20 µL van de HUVEC ophanging en vlek met een gelijke hoeveelheid van 0,4% Trypan blauwe oplossing en meng voorzichtig.</li>
	<li>Gebruik een geautomatiseerde cel teller of een handmatige hemocytometer te tellen en het verkrijgen van de concentratie en cel levensvatbaarheid van de celsuspensie.</li>
</ol>4. oprichting van opknoping Drop spheroïden
<ol><li>Plaats de opknoping drop apparaat dat 850 micropores (elk met een diameter van 350 µm) in steriele 6-Wells-platen bevat.</li>
	<li>Isoleren van de drie soorten cellen zoals hierboven beschreven: hiPSC-CMs, HCFs en HUVECs. Combineer ze in een verhouding van 70% iPSC-CMs, HCFs van de 15% en 15% HUVECs in een conische buis van 50 mL met RPMI/B-27 cel media bij een concentratie van 2,475,000 cellen per mL.</li>
	<li>Breng 4 mL van de celsuspensie (2,475,000 cellen per mL) aan elk putje van een ultra-lage gehechtheid systeem van de daling (met een schoon diameter van 350 µm) zitten in een 6-well-bord hangen.</li>
	<li>Spheroïden zal spontaan vormen binnen de 12 uur van de verstrekking van de celsuspensie in de opknoping drop apparaat. Cultuur voor een totaal van 72 uur (3 d) bij 37 ° C, 5% CO2, en 95% vochtigheid blijven voor de rijping van de spheroïden.</li>
	<li>Na 72 uur van cultuur, oogsten de spheroïden door de poriën aan de onderkant van het hangende drop systeem door het plaatsen van het apparaat in een schotel met medium en het zachtjes om vrij van de spheroïden van de ophanging te zwenken drop apparaat.</li>
</ol>5. 3D-Patch creëren met behulp van de roman netto schimmel
<ol><li>De base, vierkante bodemplaat onder netto en 10 gelaagde kant netten worden geassembleerd om de nieuwe mal maken met behulp van een paar steriel pincet. Eerst stapelen en uitlijnen van de basis, de vierkante bodemplaat en onderste net met behulp van de hoek posten. Vervolgens stapelen en laag van de netten van de 10 kant afwisselend instructies voor het maken van een net van fijne roestvrij stalen uitsteeksels.</li>
	<li>Spoel de basis met PBS of medium te verlagen de oppervlaktespanning, breng de geassembleerde schimmel op de vulling base vulling.</li>
	<li>Natte de netto schimmel holte met PBS of medium in dezelfde methode. Langzaam vullen van de spheroïden in de veronderstelde holte van de gewenste grootte (2 x 2 x 1 mm, 4 x 4 x 1 mm, of 6 x 6 x 1 mm). Opmerking: Zorg ervoor dat de 120% van de verwachte hoeveelheid spheroïden in de holte wordt gevoed, zodat de cel aggregaten in strakke verbinding worden en statisch blijven.</li>
	<li>Monteer de top netto en bovenste vierkante plaat op de hoek posten en veilig de stoppers en bedrijf buizen om te voorkomen dat een wegspoeling van de spheroïden.</li>
	<li>Het systeem gevuld netto schimmel overbrengen in een 6-well plaat met 6 mL RPMI/B-27 cel media of in een steriele container met genoeg medium ter dekking van de gehele geassembleerde schimmel.</li>
	<li>Incubeer de 6-well plaat met de gevulde mal-systeem op een swingende shaker voor 7-10 dagen bij 3.000-4.000 x g. Opmerking: De duur van de incubatie wordt bepaald door de grootte van de cardiale patches. Met grotere patches moet de incubatietijd voor cardiale patch rijping worden verhoogd.</li>
</ol>6. verwijdering van de Patch van de roman netto schimmel
<ol><li>Het systeem van de schimmel uit de media verwijderen en plaats deze op de mat gesteriliseerde behandeling in een steriele 10-cm schotel.</li>
	<li>Verwijder de buis bedrijf, stoppers, de bovenste vierkante plaat en het bovenste net. Schuif voorzichtig uit de gelaagde kant netten één voor één met een paar steriel pincet. Na decannulation, wordt een intact cardiale patch verkregen bovenop de bodem net.</li>
	<li>Pikken net onder met de patch steriel pincet gebruiken en breng de bodem net in een 35-mm schotel met 5 mL RPMI/B27 media. Voorzichtig los van de patch van de bodem net door langzaam zwenken van het net in de schotel, of met een steriele cel schraper. Na detachement van de bodem net, kan het cardiale weefsel met RPMI/B27 media worden gekweekt.</li>
	<li>Blijven broeden van de vrij zwevende 3D-cardiale patch in de 35-mm schotel. Functionele synchrone afstraffing kan zo spoedig 24 h na het verwijderen van de mal worden waargenomen.</li>
	<li>Na het verwijderen van de patch van de netto schimmel, observeren dat zijn vorm behouden blijft met de integriteit en de intensiteit van de verhogingen van de synchrone gewonnen met de tijd. Opmerking: De 3D-net schimmel gebaseerde cardiale patches tentoongesteld elektrische integratie van component cardiospheres na decannulation. We hebben vastgesteld dat een frequentie van de afstraffing variërend van 60 tot 80 slagen per minuut dat al meer dan 60 dagen duurt.</li>
</ol>

<ol><li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+Tissue+Engineering+With+Cells+Derived+From+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells+and+a+Native-Like%2C+High-Resolution%2C+3-Dimensionally+Printed+Scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Myocardial Tissue Engineering With Cells Derived From Human-Induced Pluripotent Stem Cells and a Native-Like, High-Resolution, 3-Dimensionally Printed Scaffold.</a> Circulation Research. 120 (8), 1318-1325 (2017).</li>
<li>Borovjagin, A. V., Ogle, B. M., Berry, J. L., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Microscale+Devices+to+3D+Printing%3A+Advances+in+Fabrication+of+3D+Cardiovascular+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">From Microscale Devices to 3D Printing: Advances in Fabrication of 3D Cardiovascular Tissues.</a> Circulation Research. 120 (1), 150-165 (2017).</li>
<li>Tandon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+stimulation+systems+for+cardiac+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Electrical stimulation systems for cardiac tissue engineering.</a> Nature Protocols. 4 (2), 155-173 (2009).</li>
<li>Duran, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+Medicine%2FCardiac+Cell+Therapy%3A+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Regenerative Medicine/Cardiac Cell Therapy: Pluripotent Stem Cells.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 66 (1), 53-62 (2018).</li>
<li>Lux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+maturation+of+large-scale+cardiac+patches+based+on+a+perfusable+starter+matrix+by+cyclic+mechanical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">In vitro maturation of large-scale cardiac patches based on a perfusable starter matrix by cyclic mechanical stimulation.</a> Acta Biomaterialia. 30, 177-187 (2016).</li>
<li>Eschenhagen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstitution+of+embryonic+cardiomyocytes+in+a+collagen+matrix%3A+a+new+heart+muscle+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstitution of embryonic cardiomyocytes in a collagen matrix: a new heart muscle model system.</a> The FASEB Journal. 11 (8), 683-694 (1997).</li>
<li>Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+the+Kenzan+Method+for+Robotic+Cell+Spheroid-Based+Three-Dimensional+Bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 23 (3), 237-244 (2017).</li>
<li>Sugiura, T., Hibino, N., Breuer, C. K., Shinoka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+cardiac+patch+seeded+with+human+induced+pluripotent+stem+cell+derived+cardiomyocytes+promoted+the+regeneration+of+host+cardiomyocytes+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiothoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered cardiac patch seeded with human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes promoted the regeneration of host cardiomyocytes in a rat model.</a> Journal of Cardiothoracic Surgery. 11 (1), 163(2016).</li>
<li>Caspi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+of+vascularized+cardiac+muscle+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering of vascularized cardiac muscle from human embryonic stem cells.</a> Circulation Research. 100 (2), 263-272 (2007).</li>
<li>Ong, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterial-Free+Three-Dimensional+Bioprinting+of+Cardiac+Tissue+using+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Biomaterial-Free Three-Dimensional Bioprinting of Cardiac Tissue using Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Cardiomyocytes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4566(2017).</li>
<li>Kelm, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+concept+for+scaffold-free+vessel+tissue+engineering%3A+self-assembly+of+microtissue+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks.</a> Journal of Biotechnology. 148 (1), 46-55 (2010).</li>
<li>Noguchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+three-dimensional+pre-vascularized+scaffold-free+contractile+cardiac+patch+for+treating+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Heart+and+Lung+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (1), 137-145 (2016).</li>
<li>Zuppinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+culture+for+cardiac+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">3D culture for cardiac cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (7 Pt B), 1873-1881 (2016).</li>
<li>Langenbach, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+differentiation+of+microtissues+from+multipotent+precursor+cells+for+use+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation and differentiation of microtissues from multipotent precursor cells for use in tissue engineering.</a> Nature Protocols. 6 (11), 1726-1735 (2011).</li>
<li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).</li>
<li>Agocha, A., Sigel, A. V., Eghbali-Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+adult+human+heart+fibroblasts+in+culture%3A+a+comparative+study+of+growth%2C+proliferation+and+collagen+production+in+human+and+rabbit+cardiac+fibroblasts+and+their+response+to+transforming+growth+factor-beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of adult human heart fibroblasts in culture: a comparative study of growth, proliferation and collagen production in human and rabbit cardiac fibroblasts and their response to transforming growth factor-beta1.</a> Cell Tissue Research. 288 (1), 87-93 (1997).</li>
<li>Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+isolation+and+culture+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells.</a> Nature Protocols. 2 (3), 481-485 (2007).</li>
<li>Pimentel, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+fabrication+of+thick+and+densely+populated+soft+constructs+with+complex+and+actively+perfused+channel+network%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional fabrication of thick and densely populated soft constructs with complex and actively perfused channel network.</a> Acta Biomaterialia. 65, 174-184 (2018).</li>
<li>Shimizu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysurgery+of+cell+sheet+grafts+overcomes+diffusion+limits+to+produce+thick%2C+vascularized+myocardial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Polysurgery of cell sheet grafts overcomes diffusion limits to produce thick, vascularized myocardial tissues.</a> The FASEB Journal. 20 (6), 708-710 (2006).</li>
<li>Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+three-dimensional+vascularized+cardiac+tissue+with+cell+sheet+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Construction of three-dimensional vascularized cardiac tissue with cell sheet engineering.</a> Journal of Controlled Release. 205, 83-88 (2015).</li>
<li>Ong, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+Cardiac+Tissue+Exhibiting+Mechanical+Integration+of+Spheroids+Using+3D+Bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting.</a> Journal of Visualized Experiments. 125 (e55438), (2017).</li>
<li>Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+number+per+spheroid+and+electrical+conductivity+of+nanowires+influence+the+function+of+silicon+nanowired+human+cardiac+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Cell number per spheroid and electrical conductivity of nanowires influence the function of silicon nanowired human cardiac spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 51, 495-504 (2017).</li>
<li>Karra, R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redirecting+cardiac+growth+mechanisms+for+therapeutic+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Redirecting cardiac growth mechanisms for therapeutic regeneration.</a> Journal of Clinical Investigation. 127 (2), 427-436 (2017).</li>
<li>Bartholoma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+reaggregates+of+embryonic+cardiomyocytes%3A+a+potential+model+system+for+monitoring+effects+of+bioactive+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro reaggregates of embryonic cardiomyocytes: a potential model system for monitoring effects of bioactive agents.</a> Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 814-822 (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het belang van deze methode ligt in de reproduceerbaarheid en de effectiviteit van het daaruit voortvloeiende meerdere lagen cardiale weefsel. Op het gebied van cardiale weefselengineering is één van de huidige doelstellingen het identificeren van een methode voor de bouw van slaand, meerdere lagen en functionele 3D-cardiale patches. Wij rapporteren een efficiënte en reproduceerbare methode van het creëren van meerdere lagen cardiale weefsels door directe handmatige zaaien van spheroïden samengesteld van cardiomyocytes, ...

Het doel van huidige cardiale weefselengineering is het ontwikkelen van een therapie te vervangen of repareren van de structuur en functie van gewonde myocardiale weefsel1. Methoden voor het maken van 3D-cardiale weefsel modellen tentoonstellen van de belangrijke eigenschappen van de contractiele en elektrofysiologische van inheemse cardiale weefsel hebben al snel groeiende2,3. Een verscheidenheid van strategieën zijn onderzocht en gebruikt in studies4,5. Deze verificatiemethoden variëren van het gebruik van specifieke synthetische en natuurlijke bioactieve hydrogels, zoals collageen, gelatine, fibrine en peptiden6, tot bio-inkt afzetting technologieën2 en bioprinting technologieën7.
Het is aangetoond dat de steiger-vrije methoden vergelijkbare weefsels als biomaterial gebaseerde methoden, zonder de nadelen van de integratie van buitenlandse steigers materiële8kunnen produceren. Oren Caspi et al. aangetoond dat de opname van verschillende soorten cellen in staat de generatie van zeer gevacuoliseerd menselijke gemanipuleerde cardiale weefsel9 stelt. Kin et al. ontwikkelde een 3D-afdrukmethode voor cardiale patch creatie van spheroïden. Resulterende patches zijn samengesteld uit cardiomyocytes en fibroblasten, endotheliale cellen in een 70:15:15 ratio10. Spheroïden hebben aangetoond dat effectieve "bouwstenen" van de steiger-vrije cardiale weefsel schepping, als ze resistent zijn tegen hypoxie en bezitten voldoende mechanische integriteit voor implantatie11,12. Eerdere studies hebben aangetoond dat verschillende fabricage methoden voor sferoïde creatie, met inbegrip van het gebruik van de opknoping drop methode, spinner kolven13, microfluidic systemen14en niet-aanhanger cultuur oppervlakken ongecoat of bekleed met agarose micro-mallen15. In dit protocol, gebruiken we de opknoping drop apparaat, waarin micropores voor condenserende honderden spheroïden in één keer.
Deze studie geeft een roman en efficiënte steiger-vrije methode voor cardiale weefsel creëren, waarin de spheroïden handmatig te zaaien in een vierkante mal Holte en broeden van het weefsel op een shaker voor rijping. Onder gebruikelijke statische kweekomstandigheden is zuurstof diffusie beperkt tot de uiterlijke aspecten van de constructie van weefsel, wat resulteert in centrale necrose. Echter met de netto schimmel, worden alle spheroïden die zaadjes in de mal ondergedompeld in de media met een constante fluidic beweging, rekening houdend met de toegenomen verspreiding van voedingsstoffen en zuurstof. Bovendien, deze schimmel gebaseerde methode zorgt voor de gelijktijdige oprichting van verschillen in de grootte weefsel patches met minimale handmatige inspanning en het resulterende weefsel kan gemakkelijk worden verwijderd uit de mal. Deze nieuwe methode zorgt voor de efficiënte en reproduceerbare oprichting van steiger-vrije, meerdere lagen cardiale patches.

<table><tbody><tr><td>Human Cardiac fibroblasts (HCF)</td><td>Sciencell</td><td>6310</td><td></td></tr><tr><td>FM-2 Bestaat uit basaal medium</td><td>Sciencell</td><td>2331</td><td>HCF-kweekmedium</td></tr><tr><td>Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)</td><td>Lonza</td><td>CC-2935</td><td></td></tr><tr><td>EGM+Bullet Kit&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>CC5035</td><td>HUVEC-kweekmedium</td></tr><tr><td>E8-medium&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1517001</td><td>HiPSC-kweekmedium</td></tr><tr><td>Geltrex&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1413202</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>12604013</td><td>Trypsine en celdissociatiereagens</td></tr><tr><td>RPMI-medium</td><td>Invitrogen</td><td>11875093</td><td>RPMI-medium met B-27-supplement is hiPSC-CM-kweekmedium</td></tr><tr><td>B-27 supplement (50x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td>RPMI-medium met B-27-supplement is hiPSC-CM-kweekmedium</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Novel net mal</td><td>TissueByNet Co.,Ltd</td><td>NM25-1</td><td></td></tr><tr><td>Hangende druppelplaat</td><td>Kuraray Co.,Ltd</td><td>MPc350</td><td></td></tr><tr><td>6-wellplaten&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS-3516</td><td></td></tr></tbody></table>

een netto schimmel gebaseerde methode van de steiger-free driedimensionale cardiale weefsel schepping

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

Dit protocol beschrijft een roman en eenvoudige netto schimmel gebaseerde methode om het maken van driedimensionale (3-D) cardiale weefsels zonder extra Steiger materiaal. Mens-geïnduceerde pluripotente stamcellen-cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs), menselijke cardiale fibroblasten (HCFs) en menselijke navelstreng ader endotheliale cellen (HUVECs) zijn geïsoleerd en gebruikt voor het genereren van een celsuspensie met 70% iPSC-CMs, HCFs van de 15% en 15% HUVECs. Ze zijn samen gekweekt in een ultra-lage "opknoping drop" verbindingssysteem, waarin micropores voor condenserende honderden spheroïden in één keer. De cellen samenvoegen en spontaan vormen kloppend spheroïden na 3 dagen van co cultuur. De spheroïden zijn geoogst, zaadjes in de holte van een nieuwe schimmel en gekweekt op een shaker in de incubator. De spheroïden uitgegroeid tot een volwassen functionele weefsel ongeveer 7 dagen na het zaaien. Het resulterende meerdere lagen weefsel bestaan uit gesmolten spheroïden met bevredigende structurele integriteit en synchrone kloppend gedrag. Deze nieuwe methode heeft veelbelovende potentieel als een reproduceerbare en kosteneffectieve methode maken van gemodificeerde weefsels voor de behandeling van hartfalen in de toekomst.

In onze experimenten gebruikt wij een celsuspensie van 70% iPSC-CMs, HCFs van de 15% en 15% HUVECs in RPMI/B-27 cel media bij een concentratie van 2,475,000 cellen per mL. Na het maken van de celsuspensie, afgezien we 4 mL van de celsuspensie aan elk putje van ultra-lage beslagleggingsbevel opknoping drop systeem, zoals beschreven in stap 4.3 van het protocol. Het gebruik van de opknoping drop systeem resulteerde in de spontane vorming van honderden verslaan spheroïden na 3 dagen van cult...

Dit protocol beschrijft een netto schimmel gebaseerde methode om te maken van driedimensionale steiger-vrije cardiale weefsels met bevredigende structurele integriteit en synchrone kloppend gedrag.

Een netto schimmel gebaseerde methode van de steiger-free driedimensionale cardiale weefsel schepping

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...

Dit protocol beschrijft een nieuwe en eenvoudige mal-gebaseerde methode voor het creëren van driedimensionale hartweefsel, die gebruik maakt van sferoïden als een hulpmiddel voor het creëren van scaffold-vrij hartweefsel. In onze experimenten werden drie soorten cellen, menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten, menselijke hartfibroblasten en menselijke navelveneuze endotheelcellen geïsoleerd en gebruikt om een celsuspensie te genereren. Met 70% cardiomyocyten, 15% fibroblasten en 15% endotheelcellen, in een 50ML conische buis.Vervolgens verdelen we de celsuspensie in elke put van een ultra-lage aanhechting hangende druppelsysteem, wat resulteert in de spontane vorming van honderden kloppende sferoïden na drie dagen. De sferoïden worden vervolgens geoogst en in een nieuwe malholte geplaatst. Het weefsel wordt vervolgens in een steriele container met medium bewaard, op een shaker in de incubator gedurende meerdere dagen.De mal wordt vervolgens verwijderd, wat resulteert in een scaffold-vrij weefselpatch met mechanische integriteit. Het hangende druppelapparaat is een herbruikbare, ultra-lage aanhechting put met 850 microporiën, elk met een diameter van 350 micron. De hangende druppel is compatibel met standaard zes-putten platen.Na het maken van de celsuspensie verdelen we vier milliliter celsuspensie met 10 miljoen cellen, in elke put van het hangende druppelsysteem. De apparaten worden gekweekt bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide en 95% vochtigheid. Na 72 uur wordt spontane vorming van kloppende sferoïden, met een gemiddelde diameter van 350 micron, waargenomen.De sferoïden worden geoogst door het hangende druppelapparaat in een andere schaal met medium te plaatsen en voorzichtig te zwieren om de sferoïden vrij te maken en ze door de poriën aan de onderkant van het hangende druppelsysteem te laten drijven. Dit is een schema van de nieuwe mal voor driedimensionale, scaffold-vrije, hartweefselcreatie. Het omvat de bedieningsmat, vulbasis en nieuwe mal.De nieuwe mal bestaat uit een basis, een onderste vierkante plaat, een onderste net, 10 lagen zijnetten gemaakt met fijne roestvrijstalen tanden. Een bovenste net, een bovenste vierkante plaat, de houdbuizen en stoppen. Het nieuwe Malsysteem kan verschillende weefselgroottes creëren, inclusief twee bij twee millimeter, vier bij vier millimeter en zes bij zes millimeter.De basis, onderste vierkante plaat en onderste net worden gestapeld en uitgelijnd met behulp van de hoeksteunen. 10 lagen zijnetten worden vervolgens in wisselende richtingen gestapeld om een net van fijne roestvrijstalen tanden te creëren, met behulp van een paar steriele pincetten. De vulbasis wordt vervolgens gespoeld met 1X fosfaatbufferoplossing, of PBS, om de oppervlaktespanning te verminderen voordat de sferoïden in de nieuwe mal worden geplaatst.Nadat de nieuwe malholte in dezelfde methaan is bevochtigd, worden de sferoïden in de vooropgestelde holte van de gewenste grootte geplaatst. Bij het plaatsen stroomt het overtollige medium door de netmal, waardoor de sferoïden de voorgedefinieerde holte kunnen vullen en de vorm kunnen aannemen. Het bovenste net en de bovenste vierkante plaat worden vervolgens op de hoeksteunen geassembleerd en de stoppen en de houdbuizen worden bevestigd om het wegspoelen van de sferoïden te voorkomen.Het gevulde nieuwe malsysteem wordt vervolgens overgebracht naar een zes-putten plaat, met zes millimeter B-27 aangevuld medium, en vervolgens gedurende zeven tot tien dagen in de incubator op een schommelende shaker gehouden, bij 30 tot 40 RPM. De duur van de incubatie kan worden aangepast, afhankelijk van de grootte van het hartweefsel. Na incubatie wordt het systeem eruit gehaald en worden de houdbuis, stoppen, de bovenste vierkante plaat en het bovenste net verwijderd.De gelaagde zijnetten worden vervolgens voorzichtig één voor één uitgeschoven, waarbij wordt gezorgd voor geen verstoring van het weefsel. Na verwijdering van alle zijnetten, wordt een intact hartweefsel verkregen bovenop het onderste net. Functioneel synchrone klop is waargenomen binnen 24 uur.Deze nieuwe mal-gebaseerde methode is een efficiënte en eenvoudige methode voor het creëren van driedimensionale scaffold-vrij hartweefsel, met minimale handmatige inspanning. De resulterende meerlagige weefsels bestaan uit versmolten sferoïden met bevredigende structurele integriteit en synchrone klopgedrag. Deze nieuwe mal-gebaseerde methode presenteert een kosteneffectieve en schaalbare alternatief voor de huidige bio-fabricagemethoden van geëngend weefsel.

a-net-mold-based-method-scaffold-free-three-dimensional-cardiac

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

In dit protocol demonstreren we de fabricage van biomimetische hartcelcultuursubstraten gemaakt van twee verschillende polymere materialen met behulp van capillaire krachtlitografie.  De beschreven methoden bieden een schaalbare, kosteneffectieve techniek om de structuur en functie van macroscopische hartweefsels voor in vitro en in vivo toepassingen te ontwerpen.

Capillaire Force Lithografie voor Cardiac Tissue Engineering

De generatie van uitgelijnde myocardiale weefsel is een belangrijke voorwaarde voor het aanpassen van de recente ontwikkelingen in de stamcel biologie om klinisch bruikbare doeleinden. Hierin beschrijven we een microcontact afdrukken benadering voor de nauwkeurige controle van cellulaire vorm en functie. Met behulp van zeer zuivere populaties van embryonale stamcellen afgeleid cardiale voorlopercellen, we dan het genereren van anisotrope functionele myocardium.

Generatie van Aligned Functionele myocardweefsel Door microcontact afdrukken

In deze studies geven we nieuwe methodologie voor neonatale muizen cardiale scaffolds voor gebruik in regeneratieve studies.

Neonatale Cardiac Steigers: Novel Matrices voor Regenerative Studies

Dit protocol beschrijft 3D bioprinting van hartweefsel zonder het gebruik van biomaterialen. 3D bioprinted cardiac patches vertonen mechanische integratie van component sferoïden en zijn zeer veelbelovend in hartweefselregeneratie en als 3D-modellen van hart-en vaatziekten.

Het creëren van cardiale weefsels die mechanische integratie van sferoïden tonen met behulp van 3D bioprinting

Het huidige protocol genereert mesh-vormige ontworpen cardiale weefsels met cardiovasculaire cellen afkomstig van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen om het onderzoek van celimplantatietherapie voor hartziekten mogelijk te maken.

Voorbereiding van mesh-vormige ontworpen cardiale weefsels afgeleid van menselijke iPS cellen voor In Vivo Myocardial Repair

Hier beschrijven we een eenvoudig te gebruiken methodologie om 3D zelfgeassembleerde cardiale microtissue-arrays te genereren die zijn samengesteld uit vooraf gedifferentieerde door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten, cardiale fibroblasten en endotheelcellen. Deze gebruiksvriendelijke en laagcellige techniek die nodig is om cardiale microtissues te genereren, kan worden geïmplementeerd voor ziektemodellering en vroege stadia van medicijnontwikkeling.

Fabricage van 3D cardiale microtissue arrays met behulp van menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten, cardiale fibroblasten en endotheelcellen

Gemanipuleerde weefsels zijn sterk afhankelijk van de juiste vasculaire netwerken om vitale voedingsstoffen en gassen te leveren en metabolisch afval te verwijderen. In dit werk creëert een stapsgewijs zaaiprotocol van endotheelcellen en ondersteunende cellen sterk georganiseerde vasculaire netwerken in een platform met hoge doorvoer voor het bestuderen van het ontwikkelen van vesselgedrag in een gecontroleerde 3D-omgeving.

Stapsgewijs cel zaaien opssellated steigers om ontkiemende bloedvaten te bestuderen

Het doel van dit protocol is om de ontwikkeling van een driedimensionaal (3D) microfluïdisch model van sterk uitgelijnd menselijk hartweefsel, samengesteld uit stamcel-afgeleide cardiomyocyten, samen met hartfibblasten (CFs) in een biomimetische, op collageen gebaseerde hydrogel, uit te leggen en aan te tonen, voor toepassingen in hartweefseltechniek, geneesmiddelenscreening en ziektemodellering.

Het ontwikkelen van 3D georganiseerd menselijk hartweefsel binnen een microfluïdisch platform

Patiëntspecifieke modellen verbeteren het vertrouwen van de chirurg en collega bij het ontwikkelen of leren van chirurgische plannen. Driedimensionale (3D) printers genereren voldoende details voor chirurgische voorbereiding, maar slagen er niet in om de haptische getrouwheid van weefsel te repliceren. Er wordt een protocol gepresenteerd met details over de creatie van patiëntspecifieke, siliconen cardiale modellen, waarbij 3D-printprecisie wordt gecombineerd met gesimuleerd siliconenweefsel.

Creatie van patiëntspecifieke siliconen cardiale modellen met toepassingen in pre-chirurgische plannen en hands-on training

Er wordt een reproduceerbare methode gepresenteerd om 3D-myocardiale weefsels te genereren die smelt-elektrospinnende schrijf- (MEW), polycaprolacton (PCL)-steigers en fibrinehydrogels combineren met hiPSC-afgeleide cardiomyocyten en fibroblasten. Deze techniek biedt nauwkeurige controle over de steigerarchitectuur en kan worden toegepast bij preklinische geneesmiddelentests en modellering van hartaandoeningen.

3D generatie van menselijk myocardweefsel met behulp van smeltelektrospinning schrijven van polycaprolactonsteigers en hiPSC-afgeleide hartcellen

Leer een mal-gebaseerde methode voor driedimensionale hartweefselcreatie zonder steiger met behulp van sferoïden. Deze techniek produceert kloppende weefsels met structurele integriteit en synchroon gedrag voor cardiaal onderzoek.

Een netto schimmel gebaseerde methode van de steiger-free driedimensionale cardiale weefsel schepping

Meer video's verkennen