Een netto schimmel gebaseerde methode van de steiger-free driedimensionale cardiale weefsel schepping

Dit protocol beschrijft een nieuwe en eenvoudige mal-gebaseerde methode voor het creëren van driedimensionale hartweefsel, die gebruik maakt van sferoïden als een hulpmiddel voor het creëren van scaffold-vrij hartweefsel. In onze experimenten werden drie soorten cellen, menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten, menselijke hartfibroblasten en menselijke navelveneuze endotheelcellen geïsoleerd en gebruikt om een celsuspensie te genereren. Met 70% cardiomyocyten, 15% fibroblasten en 15% endotheelcellen, in een 50ML conische buis.

Vervolgens verdelen we de celsuspensie in elke put van een ultra-lage aanhechting hangende druppelsysteem, wat resulteert in de spontane vorming van honderden kloppende sferoïden na drie dagen. De sferoïden worden vervolgens geoogst en in een nieuwe malholte geplaatst. Het weefsel wordt vervolgens in een steriele container met medium bewaard, op een shaker in de incubator gedurende meerdere dagen.

De mal wordt vervolgens verwijderd, wat resulteert in een scaffold-vrij weefselpatch met mechanische integriteit. Het hangende druppelapparaat is een herbruikbare, ultra-lage aanhechting put met 850 microporiën, elk met een diameter van 350 micron. De hangende druppel is compatibel met standaard zes-putten platen.

Na het maken van de celsuspensie verdelen we vier milliliter celsuspensie met 10 miljoen cellen, in elke put van het hangende druppelsysteem. De apparaten worden gekweekt bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide en 95% vochtigheid. Na 72 uur wordt spontane vorming van kloppende sferoïden, met een gemiddelde diameter van 350 micron, waargenomen.

De sferoïden worden geoogst door het hangende druppelapparaat in een andere schaal met medium te plaatsen en voorzichtig te zwieren om de sferoïden vrij te maken en ze door de poriën aan de onderkant van het hangende druppelsysteem te laten drijven. Dit is een schema van de nieuwe mal voor driedimensionale, scaffold-vrije, hartweefselcreatie. Het omvat de bedieningsmat, vulbasis en nieuwe mal.

De nieuwe mal bestaat uit een basis, een onderste vierkante plaat, een onderste net, 10 lagen zijnetten gemaakt met fijne roestvrijstalen tanden. Een bovenste net, een bovenste vierkante plaat, de houdbuizen en stoppen. Het nieuwe Malsysteem kan verschillende weefselgroottes creëren, inclusief twee bij twee millimeter, vier bij vier millimeter en zes bij zes millimeter.

De basis, onderste vierkante plaat en onderste net worden gestapeld en uitgelijnd met behulp van de hoeksteunen. 10 lagen zijnetten worden vervolgens in wisselende richtingen gestapeld om een net van fijne roestvrijstalen tanden te creëren, met behulp van een paar steriele pincetten. De vulbasis wordt vervolgens gespoeld met 1X fosfaatbufferoplossing, of PBS, om de oppervlaktespanning te verminderen voordat de sferoïden in de nieuwe mal worden geplaatst.

Nadat de nieuwe malholte in dezelfde methaan is bevochtigd, worden de sferoïden in de vooropgestelde holte van de gewenste grootte geplaatst. Bij het plaatsen stroomt het overtollige medium door de netmal, waardoor de sferoïden de voorgedefinieerde holte kunnen vullen en de vorm kunnen aannemen. Het bovenste net en de bovenste vierkante plaat worden vervolgens op de hoeksteunen geassembleerd en de stoppen en de houdbuizen worden bevestigd om het wegspoelen van de sferoïden te voorkomen.

Het gevulde nieuwe malsysteem wordt vervolgens overgebracht naar een zes-putten plaat, met zes millimeter B-27 aangevuld medium, en vervolgens gedurende zeven tot tien dagen in de incubator op een schommelende shaker gehouden, bij 30 tot 40 RPM. De duur van de incubatie kan worden aangepast, afhankelijk van de grootte van het hartweefsel. Na incubatie wordt het systeem eruit gehaald en worden de houdbuis, stoppen, de bovenste vierkante plaat en het bovenste net verwijderd.

De gelaagde zijnetten worden vervolgens voorzichtig één voor één uitgeschoven, waarbij wordt gezorgd voor geen verstoring van het weefsel. Na verwijdering van alle zijnetten, wordt een intact hartweefsel verkregen bovenop het onderste net. Functioneel synchrone klop is waargenomen binnen 24 uur.

Deze nieuwe mal-gebaseerde methode is een efficiënte en eenvoudige methode voor het creëren van driedimensionale scaffold-vrij hartweefsel, met minimale handmatige inspanning. De resulterende meerlagige weefsels bestaan uit versmolten sferoïden met bevredigende structurele integriteit en synchrone klopgedrag. Deze nieuwe mal-gebaseerde methode presenteert een kosteneffectieve en schaalbare alternatief voor de huidige bio-fabricagemethoden van geëngend weefsel.