Gehumaniseerd knik/SCID/IL2rγ^null (hu-NSG) muis Model voor HIV-replicatie en Latency Studies

Deze zaken kunnen helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in hiv/aids-onderzoek, zoals het moleculaire mechanisme en de prognose van hiv-infectie, en hoe en waar het latentiereservoir is gevestigd. Het voordeel van deze techniek is dat het niet-invasief is, en vestigde een hu-NSG muizen die een multi-lineage ontwikkeling over getransplanteerde menselijke stamcellen die vatbaar zijn voor HIV-infectie en ontvankelijk zijn voor cART te behandelen. Begin met het filteren van een verteerd, menselijk, foetaal, leverweefsel, drijfmestmonster door een steriel, 70 micrometer, nylon, mesh-zeef om een enkele celsuspensie te verkrijgen en te verrijken voor CD34+HSCs door magnetische geactiveerde celsortering volgens de instructies van de fabrikant.

Na het tellen, opnieuw opschorten de HSC op een twee-keer-tien-tot-de-zevende levensvatbare cellen per milliliter concentratie in verse DPBS op ijs. Plaats vervolgens een hele neonatale menselijke NOD / SCID / gamma of NSG muis strooisel in een steriele, taart-vormige, bestraling kooi, en behandelen de dieren met 200 tot 250 centigrades van gammastraal uit een cesium-137 stralingsbron. Laad vervolgens de cellen in een op maat gemaakte, Hamilton 80508 50-microliter spuit uitgerust met een 30-gauge naald, en injecteer elk neonatale dier direct in de lever met vijf-keer-tien-tot-de-vijfde levensvatbare menselijke CD34 + HSCs en 25 microliters van DPBS.

Tien tot twaalf weken na infectie, spin down retro-orbitale, perifere, bloedmonsters van elke muis door centrifugatie, en breng de plasma supernates naar microcentrifuge buizen voor negatieve 80 graden Celsius opslag als experimenteel geschikt. Voor HSC engraftment validatie, opnieuw opschorten van de pellets met 200 microliters van rode bloedcel lyse buffer, en trek de cel suspensies in een 1,5 millimeter microcentrifuge buis voor een tien minuten incubatie bij kamertemperatuur. Verzamel vervolgens de resterende witte bloedcellen door centrifugatie voor twee wasbeurten in 0,5 milliliter verse, 0,01 procent runderserum albumine, of BSA, in DPBS per wasbeurt.

Na de tweede wasbeurt, blokkeer de cellen met 100 microliters van het blokkeren van cocktail gedurende twintig minuten op 4 graden Celsius, gevolgd door etikettering met de juiste anti-body cocktail van belang bij een 2 microliter anti-lichaam per een-keer-een-op-de-zesde cellen concentratie. Na 30 minuten bij 4 graden Celsius, was de cellen twee keer in verse DPBS plus BSA, en evalueer de perifere bloedmonsters door stroomcytometrie volgens standaardprotocollen om het percentage menselijke CD45+CD3+CD14+of CD19+cellen per monster te kwantificeren. Bereken vervolgens de verhouding van CD4+-cd8+T-cellen en beoordeel de virale belasting met in de plasmamonsters volgens standaard, kwantitatieve, omgekeerde transcriptase, PCR-protocollen.

Om de effecten van HIV-infectie te beoordelen, leveren HIV-baalvirus aan verdoofde, menselijke, NSG muizen met een meer dan 20 procent menselijke CD45 +cel populatie in hun perifere bloed, op een 200 nanogram P24 per muis concentratie via intraperitoneale toediening, het verzamelen van bloedmonsters via retro-orbitale bloeden om de twee weken, en analyseren zowel de CD4-to-CD8 verhouding en de plasma virale belasting , zoals aangetoond. Voor virale onderdrukking validatie leveren de geïnfecteerde, menselijke NSG dieren met verse, combinatorische, anti-retrovirale therapie, of cART, in gezoete water elke week gedurende 4 weken, het verzamelen van bloedmonsters via retro-orbitale bloeden om de twee weken en analyseren zowel de CD4-to-CD8 verhouding en het plasma virale belasting zoals aangetoond. Om de virale rebound te beoordelen wanneer de plasma virale belastingen onder de detectielimiet liggen en de CD4-naar-CD8-verhouding wordt hersteld tussen 1,5 en 2,5 perifere bloedmonsters verzamelen door middel van retro-orbitale bloedingen om de 2 weken na cART terugtrekking en evalueren van de monsters zoals aangetoond.

Tijdens de eerste validatie van engraftment moet het aantal menselijke CD45+-cellen variëren van 20 tot 80 procent en moeten de subsets van menselijke leukocyten worden weergegeven als afzonderlijke populaties door stromingscytometrische analyse. De verhouding van CD4+to-CD8+cellen blijft tussen 1,5 en 2,5 bij gezonde personen, terwijl significante CD4+T-celuitputting doorgaans wordt waargenomen bij virale infectie. Met name de gezonde verhouding wordt hersteld in reactie op cART-behandeling.

De detectie van plasma virale belastingen door kwantitatieve RT PCR in de loop van de infectie en het cART-regime kan worden uitgezet en gebruikt om de efficiëntie van de virale levering en de antivirale behandeling te evalueren. Hoewel deze methode inzicht kan geven in hiv/aids virologiestudies en therapeutische ontwikkeling, kan het ook worden toegepast op andere studies met betrekking tot menselijke ziekten, zoals kanker, diabetes en auto-immuunziekten. De ontwikkeling van het hu-NSG-muismodel maakte de weg vrij voor onderzoekers in immunologie en oncologie om een nieuwe disfunctie en pathologie bij de mens te onderzoeken, met name mechanistische en therapeutische studies gericht op chronische hiv-infecties en het latentiereservoir.