Fysische karakterisering van enkele metallische nanodeeltjes in hoge resolutie

Deze nanoporie-gebaseerde detectiemethode heeft aangetoond het potentieel om fysieke karakteriseren en identificeren van individuele moleculen. Werken met metallo-nanodeeltjes, wat het doel van deze video is, is een uitdaging voor ons begrip van wat de nauwkeurigheid en precisie van de meting beperkt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat dit apparaat een grotere bandbreedte heeft dan de traditionele lipide bilayer geheugenset-up, waardoor we snellere resultaten en meer reacties in nanopori kunnen zien.

Deze techniek werd mogelijk gemaakt omdat in de vroege jaren 1990 werd aangetoond dat gating in eiwit nanoporiën, dat wil zeggen, schakelen tussen verschillende staten, kan worden gecontroleerd en moleculen kunnen binden aan de porie wand. Deze techniek wordt ontwikkeld voor commerciële DNA-sequencing toepassingen omdat het gebruik maakt van minimale monsters. Het vereist geen fluorescerende etiketten en gebruikt veel langere leeslengtes dan conventionele methoden doen.

Deze techniek is ook ontwikkeld om onderscheid te maken tussen polymeren op basis van hun grootte met een grotere nauwkeurigheid en snelheid dan gel elektroforese en chromatografie. Bereid eerst 500 milliliter van een oplossing van een molaire natriumchloride en 10 millimolar mononatriumfosfaat in ultrazuiver water als elektrolyt. Het is het beste om nieuwe oplossingen en monsters te gebruiken met deze specifieke set-up.

Daarnaast ontdekten we dat hoogwaardig gedeïmiseerd water erg belangrijk is voor het succesvol vormen van membranen. Combineer vervolgens een milligram lyofphilized wild-type monomerische S.aureus alpha hemolysine poeder met een milliliter ultrazuiver water. Vergeet niet dat het werken met Staph aureus alpha hemolysine toxine eiwit gevaarlijk kan zijn.

Volg de voorzorgsmaatregelen in de MSDS bij het uitvoeren van deze procedure. Bereid vervolgens vier milliliter van vijf milligram per milliliter DPhyPC in endecaïne in een glazen scintillatie flacon. Sluit de flacon af met een met polytetrafluorethythythyleen omzoomde dop en bewaar het maximaal een maand op vier graden Celsius.

Los daarna 57,6 milligram 12-fosfootungsticaat in 10 milliliter van het elektrolyt op om een twee millimolar polyoxomeerolieoplossing te maken. Verdeel de POM-oplossing in twee porties van vijf milliliter. Gebruik natriumhydroxide met drie molaire mol om de pH van één POM-oplossing aan te passen op 5,5.

Om te beginnen met de voorbereiding voor de test, monteer de testcel van een vlakke lipide bilayer elektrofysiologie apparaat. Eerst, schuren een zilveren draad met 600-grit schuurpapier en weken in commercieel verkrijgbaar natrium hypochloriet gebaseerde bleekmiddel voor 10 minuten om de zilver-zilveren chloride draad elektrode te maken. Spoel en droog de draadelektrode voordat u deze in de kwartscapillaire van het apparaat plaatst.

Houd de elektrode in het kwarts-nanoporimembraan, of QNM, het scheiden van de capillaire en het reservoir. Plaats vervolgens een cilindrische zilver-zilverchloride pellet elektrode gemonteerd op een zilveren draad in het reservoir. Sluit beide elektroden aan op de versterker printplaat.

Open vervolgens het data-acquisitieprogramma en start de voeding op nul millivolts. Controleer of er geen gelijkstroom wordt gedetecteerd tussen de elektroden in de lege cel. Tijdens deze demonstratie is het belangrijk om te kijken hoe de transcapillaire druk de membraanvorming en de daaropvolgende nanoporievorming kan beïnvloeden.

Zonder deze twee stappen correct te doen, zullen de experimenten niet werken. Laad ongeveer een milliliter elektrolyt in een spuit en sluit deze aan op de vloeistoflijn die op het reservoir is aangesloten. Voeg elektrolyt toe aan het reservoir totdat het gezicht van de QNM is ondergedompeld, zoals aangegeven door de ionische stroom tussen de elektroden die de versterker verzadigen.

Als de versterker niet verzadigd is, ontstopt u de QNM door een popspanning van plus of min één volt toe te passen of de capillaire druk met ongeveer 300 millimeter kwik te verhogen. Gebruik beide technieken indien nodig. Zodra de versterker verzadigd is, trekt u elektrolyt uit het reservoir totdat de oplossingsniveaus onder de QNM dalen, zoals blijkt uit de huidige terugkeer naar nul.

Om te beginnen met de lipide bilayer vormingsproces, verhogen de elektrolyt oplossing niveau ruim boven het gezicht van de QNM en let op hoeveel oplossing die nam. Dompel vervolgens een pipettip van 10 microliter in de DPHyPC-oplossing en trek alle zichtbare lipide in de punt. Raak de punt van de pipet aan op het oppervlak van de elektrolytoplossing en laat de lipide uit de pipet over de luchtwaterinterface stromen.

Wacht twee tot vijf minuten tot de lipide gelijkmatig over de oplossing is verspreid. Trek vervolgens langzaam het elektrolyt terug totdat het oppervlak van de oplossing zich onder de QNM bevindt en voeg dan langzaam genoeg elektrolyt toe om de oplossing boven de QNM te verhogen om het isolerende lipidebilayermembraan te vormen. Als de bilayer zich niet vormt na drie pogingen, breng dan een ander deel lipide aan zoals eerder beschreven en herhaal het proces.

Zodra de bilayer lijkt te hebben gevormd, verhoging van de druk op de capillaire om de bilayer pop en vervolgens te hervormen door langzaam te verlagen en het verhogen van de oplossing niveau op dezelfde manier als voorheen. Herhaal dit proces meerdere malen om ervoor te zorgen dat de QNM niet verstopt is en een bilayer is gevormd. Ontdooi vervolgens een aliquot alfa hemolysine eiwit op ijs of bij kamertemperatuur.

Vul het reservoir met 250 nanogram monomerische alfa hemolysine eiwit en ongeveer 250 microliter van ultrazuiver water. Breng vervolgens een vooringenomenheid van 200 tot 400 millivolt toe om porievorming te induceren. Om de vorming van poriën te vergemakkelijken, verhoogt u de capillaire druk met 40 tot 200 millimeter kwik om de bilayer uit te breiden van de QNM.

Zodra een nanoporie zich vormt, vermindert u de toegepaste bias op de meetspanning en verlaagt u de druk tot ongeveer de helft van de invoegdruk. Om met de test te beginnen, past u de gelijkverschuivingsspanning aan om ervoor te zorgen dat er geen gemeten stroom is wanneer het toegepaste potentieel op nul is ingesteld. Vervolgens verwerf een ionisch huidig spoor voor een toegepast potentieel van 120 tot negatief 120 millivolt ten opzichte van het reservoir.

Bevestig dat er geen verontreinigingen zijn, wat zou worden aangegeven door spontane huidige blokkades. Voeg een tot zes microliters van pH 5.5 twee-millimolar POM cluster oplossing aan het reservoir. Breng ionische huidige tijdreeksmetingen toe bij een toegepaste spanning van negatieve 120 millivolt.

De beweging van individuele anionische fosfootungstische zuurmoleculen door het alfahemolysinkanaal veroorzaakte voorbijgaande blokkades die de gemiddelde open-porie ionische stroom met ongeveer 80% verminderden De duur en de blokkadestroom zijn beide direct gerelateerd aan de deeltjespoetische interactie, waardoor ionische soorten kunnen worden onderscheiden in histogrammen van de relatieve blokkadediepteverhoudingen. Bij pH 5.5, werden twee pieken waargenomen met diepteverhoudingen van ongeveer 0.06 en 0.16. Gebaseerd op fosfor NMR, de kleine piek was de zes-minus fosfosfrotistische soorten en de belangrijkste piek was de zeven-minus soorten.

Bij pH 7,5 verschoof de relatieve concentraties naar een hogere verhouding van de 6-minus soorten tot de zeven-min soorten. De 20-voudige afname van de blokkade gebeurtenissen ten opzichte van pH 5,5 werd toegeschreven aan afbraak aan vrij fosfaat en wolfraamionen. Het aanbrengen van de verblijfstijdverdelingen vereiste meerdere exponentiële functies, wat wijst op meerdere soorten deeltjes-porie interacties binnen elke ionische soort.

De kortere verblijfstijden bij pH 7.5 suggereerden zwakkere deeltjesporie-interacties dan pH 5.5, in overeenstemming met eerdere studies waaruit pH-afhankelijke veranderingen in het relatieve aantal vaste ladingen in of nabij het alfahemolysinekanaallumen aantoonden. Hoogzuiver gedeïsteerd water is cruciaal voor deze specifieke opstelling. Een gebruikte organische filter cartridge was de waarschijnlijke oorzaak van ons lab niet in staat om membranen te vormen op de QNMs voor maanden.

Individuen die nieuw zijn in deze specifieke versie van de methode kunnen ook worstelen omdat de membranen zo klein zijn en er een truc is om nanoporiën te laten vormen. Deze methode, die enkele decennia geleden werd geïnitieerd, is nuttig gebleken voor het analyseren van ionen, nucleïnezuren, synthetische polymeren en DNA-sequencing. Het kan ook toepassingen vinden in de biofysica en basiscelbiologie.

Deze procedure kan bijvoorbeeld worden gebruikt om de fysieke eigenschappen van synthetische polymeren en biopolymeren te bestuderen om hun grootte, interacties met andere moleculen en andere belangrijke vragen te onderzoeken.