Name: Een High-Throughput Luciferase Assay te evalueren proteolyse van de Single-omzet Protease-PCSK9 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Leer een high-throughput luciferase-assay om de proteolytische activiteit van PCSK9 te evalueren met HEK293 T-cellen. Deze methode biedt snelle, versterkbare aflezingen voor laagfrequente biochemische gebeurtenissen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs bedanken de gulle financiële steun van de NHLBI/NIH (K08 HL124068 en LRP HMOT1243), NCATS/NIH via de UCSF klinisch en translationeel Science Institute katalysator Program (UL1 TR000004), de UCSF academische Senaat, de Hellman Foundation, een Gilead Sciences Research Scholar Award, een Pfizer ASPIRE cardiovasculaire Award (alles aan John S. Chorba) en het Howard Hughes Medical Institute (aan Adri M. Galvan en Kevan M. Shokat).

1. plaats-geleide mutagenese van Protease Vector
<ol><li>Ontwerp en bestel aangepaste-gesynthetiseerd oligonucleotides te installeren van een mutatie van belang met behulp van een wijziging van de standaard plaats-geleide mutagenese protocollen12. Standaard ontzout inleidingen (zonder extra reiniging) zijn volkomen aanvaardbaar. Opmerking: Een algemene aanpak primer ontwerpen gaat om het creëren van gedeeltelijk overlappende inleidingen, zoals aangegeven in tabel 1, met behulp van een smelten temperatuur (Tm) rekenmachine die specifiek zijn voor de polymerase van belang.</li>
	<li>Instellen polymerase kettingreactie (PCRs) voor de plaats-geleide mutagenese op het ijs, zoals aangegeven in tabel 2.</li>
	<li>Cyclus de PCRs zoals aangegeven in tabel 3.</li>
	<li>2-5 µL van elke PCR uitvoeren op een 1% agarose gel en visualiseren van de producten ter bevestiging van een succesvolle versterking. Opmerking: Een succesvolle PCR is een enkele, prominent DNA-band zichtbaar bij het markeerteken van de geschatte omvang van de sjabloon (~7.8 kB).</li>
	<li>Voeg 0,5 µL (per 25-µL reactie) van DpnI en de monsters bij 37 ° C gedurende 1 uur uit te broeden.</li>
	<li>Transformeren 2 µL van de reactie in chemisch bevoegde Escherichia coli. Opmerking: Een stam E. coli snelgroeiende incubatie keer zal verminderen, maar klonen stam acceptabel zal zijn.</li>
	<li>Plaat de transformaties op Luria Bertani (LB) agar met 50-100 µg/mL carbenicillin. Incubeer de platen 's nachts bij 37 ° C.</li>
	<li>Selecteer 2-4 kolonies groeien in een kleinschalige cultuur (2-5 mL van LB medium met 50-100 µg/mL carbenicillin). Incubeer de cultuur bij 37 ° C bij 220 t/min, totdat het is troebel.</li>
	<li>Isoleren van de plasmide DNA van de cellen met behulp van een plasmide DNA zuivering (dat wil zeggen, "miniprep") kit volgens de instructies van de fabrikant. Kwantificeren van de concentratie van geëlueerd DNA met een spectrofotometer microvolume.</li>
	<li>Het volgnummer van de plasmide DNA uitgebreid met een service voor het rangschikken van Sanger (zoals een core of commerciële faciliteit). De DNA-monsters volgens de specificaties van de dienst voor te bereiden. Primers met succes gebruikt in voorafgaande sequencing reacties zijn vermeld in tabel 4. Opmerking: Als gevolg van de PCR versterking van het gehele plasmide, de volgorde van de hele PCSK9 codering regio wordt aanbevolen voor elke mutant.</li>
</ol>2. high-throughput Luciferase gebaseerde proteolyse Assay
<ol><li>
Cel beplating (dag 0)
	<ol>
<li>Lage-passage HEK293T cellen gebruiken voor experimenten en een cultuur in Dulbecco van gemodificeerde Eagle medium (DMEM) met 10% foetale runderserum (FBS). Uitvoeren van alle celopmaak onder steriele omstandigheden in de kap van een weefselkweek werk totdat u aan de activiteit luciferase assay. Schatten van het aantal putten en platen die nodig zijn voor het experiment, anticiperen op dat transfections in drievoud voor elke voorwaarde getest zal worden uitgevoerd.</li>
		<li>HEK293T cellen uit een bovenliggende kolf distantiëren door ze te behandelen met een minimaal volume van 0,05% trypsine-ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) ter dekking van de cellen. Inactivering van de trypsine-EDTA met 2 delen van DMEM aangevuld met 10% FBS en overdracht de cellen aan een steriele buis. Cellen tellen met behulp van een geautomatiseerde cel teller (en met trypan blauw kleuring). Centrifugeer de buis bij 500 x g gedurende 5 min om te herstellen van cellen.</li>
		<li>Gecombineerd trypsine bevattende medium en reconstrueren van de cellen in het kweekmedium tot een concentratie van 2 x 105 cellen/mL. Met behulp van een meerkanaalspipet, Breng 100 µL van de cellen aan elk putje van een wit (dekkend-onder) 96-wells-plaat, waardoor een seeding eindconcentratie van 2 x 104 cellen per putje. Opmerking: Voor de eerste experimenten, het wellicht nuttig om het zaad bovendien een zus, de clear-96-Wells bodemplaat, teneinde te controleren van de celgroei en aanhankelijkheid tijdens het protocol en de toekomstige problemen met gids.</li>
		<li>Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24 uur.</li>
		<li>Voorbereiding van een master plaat van plasmiden in een 96-Wells-indeling. Verdun elk plasmide in elutie buffer (Tris-HCl, pH 8,5) 50 ng/µL in een individuele put van een 96-wells-plaat.<ol>
<li>Elke 4 putten voorbereiden op de positieve controle (WT) plasmide8, negatieve controle (S386A) plasmide8en plasmide-vrije buffer (voor mock transfections). Als drugs of andere mobiele gebaseerde behandelingen worden gepland, dan de master plaat met de positieve controle (WT) plasmide in elk putje bereiden, wells samen met 4 elk van de plasmide negatieve controle (S386A) en de buffer plasmide-vrij.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transfectie (dag 1)
	<ol>
<li>De transfectie mengsel in een 96-wells-plaat-formaat met behulp van deep-well 96-wells-platen voor te bereiden. Voer de transfections in drievoud, controleren of het bereiden van genoeg reagentia ter verantwoording voor pipetteren en overdracht verliezen. Opmerking: De volgende berekeningen bereiden genoeg reagens te lopen een 96-wells-plaat in drievoud (conservatief geschat voor 420 putten).<ol>
<li>Het maken van een master mix van een verdunde lipide transfectiereagens, 50.4 µL van het reagens aan 2050 µL van verminderd-serum medium toe te voegen. Het maken van een master mix van een DNA precomplexation reagens, toevoegen van 33,6 µL van het reagens in 1730 µL van verminderd-serum medium.</li>
			<li>Met behulp van een meerkanaalspipet, aliquoot 16,8 µL van het verdunde mengsel van het reagens van de precomplexation van de DNA in elk putje van de plaat van de diep-well.</li>
			<li>Met behulp van een meerkanaalspipet, aliquoot 3.2 µL (160 ng) van elke plasmide van de master plaat in elk putje van de plaat van de diep-well.</li>
			<li>Met behulp van een meerkanaalspipet, aliquoot 20 µL van het mengsel verdunde lipide transfectie reagens voor elk goed van de plaat en meng de inhoud van elk goed met de meerkanaalspipet. Dekking van de platen en laat ze op kamertemperatuur (RT) zitten voor 10-15 min naar formulier lipide: DNA complexen. Opmerking: Bij de transfectie, de definitieve componenten per putje worden als volgt: 40 ng van DNA, 0,12 µL van transfectiereagens en 0,08 µL van DNA pre-kleurverandering reagens, en de inhoud van elk goed zullen 10 µL totaalvolume (verminderd-serum medium).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Zachtjes het medium van de 293T cellen in de 96-wells-platen met een meerkanaalspipet, verzorgen niet te verstoren de cellen uit te wisselen. Vervang het aanzuiging medium met 95 µL van DMEM aangevuld met 10% FBS. Opmerking: Dit zou een geschikte tijd voor de behandeling van de cellen met een drug van belang.</li>
		<li>Voeg 10 µL van het mengsel van de Transfectie aan elke passende goed via een meerkanaalspipet. Zachtjes swirl de plaat om te mengen van de inhoud in de putjes. Incubeer de plaat bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 24 uur. Let op: Het eindvolume van de putten komt tot 105 µL, ter verantwoording voor verdamping meer dan 24u.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Assay (dag 2)
	<ol>
<li>Bereiden van een stamoplossing voor coelenterazine reagentia: 3 M natrium ascorbaat [ontbonden in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), vers bereid], 5 M NaCl, 10 mg/mL bovien serumalbumine (BSA; opgeloste in PBS, vers bereid) en 2 mM coelenterazine (ontbonden aangezuurde methanol met 200 µL van 3 N HCl per 10 mL). Opmerking: De coelenterazine van 2 mM kan worden opgeslagen voor 2 weken wanneer het wordt bewaard bij-80 ° C en in de afwezigheid van licht.</li>
		<li>2 x coelenterazine reagentia voorbereiden door de luciferase uitlezing, met een aparte reagens, elk voor de cellen en medium, volgens tabel 5. Alle reagentia opslaan de coelenterazine eerst Meng, filtreer het mengsel door een 0,22 µm spuit filter en voegt u de coelenterazine. De reagentia beschermen tegen licht, totdat ze klaar om te worden toegevoegd aan de platen. Opmerking: Als gevolg van het verlies van de oplossing van filtratie, moet voldoende reagens ter verantwoording voor zowel het verlies van filtratie, alsmede van de overdracht. Tabel 5 geeft de uiteindelijke concentratie van de 2 x reagentia (evenals het bedrag van de stockoplossing toe te voegen om te lezen uit een 96-wells-plaat met een reagens).</li>
		<li>Verwijder de cellen uit de incubator 24u na de transfectie. Met behulp van een meerkanaalspipet, overdracht 50 µL van geconditioneerde medium van elk putje naar een frisse, witte bodem (dekkend) 96-wells-plaat.<ol>
<li>Label de platen over de vraag of ze gemiddeld of cellen bevatten. Als meer dan één 96-wells-plaat was transfected, label de platen om ervoor te zorgen dat elke plaat middellange-bevattende is gekoppeld aan de plaat van de bovenliggende cellen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Met behulp van een meerkanaalspipet, 50 µL van 2 x non-lytische coelenterazine reagens toevoegen aan de plaat met alleen geconditioneerde medium. Zachtjes rock of schud de plaat in de afwezigheid van licht voor 5-10 min op RT.</li>
		<li>Met behulp van een meerkanaalspipet, 50 µL van 2 x lytische coelenterazine reagens aan de plaat met de cellen toevoegen. Zachtjes rock of schud de plaat in de afwezigheid van licht voor 5-10 min op RT.</li>
		<li>Na de incubatie, lees de luminescentie van de middellange-alleen plaat in een afleesapparaat. Vervolgens leest de luminescentie van de cel-bevattende plaat in de dezelfde afleesapparaat.</li>
		<li>Negeren van de platen en opslaan van de bestanden voor data-analyse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. de gegevensanalyse
<ol><li>Een analyse van de eerste gegevens met behulp van spreadsheet-software uit te voeren. Maak een werkblad met de resultaten van de cel en de middellange platen.</li>
	<li>Handmatig controleren van de gegevens uit de cel platen te identificeren slecht transfected wells. Putten die Toon < 5% - 10% van de uitlezing van de plasmide negatieve controle (S386A) moet worden beschouwd als slecht transfected, de interpretatie van die gegevens verdachte.</li>
	<li>Bereken de gemiddelde achtergrond luminescentie van elke plaat uit de mock-transfected putten. Aftrekken van de achtergrond van elke plaat uit de waarden van die plaat. Opmerking: Deze waarde is mogelijk te verwaarlozen is afhankelijk van de lezer van de plaat gebruikt.</li>
	<li>Proces de gegevens door het berekenen van het aandeel van luciferase activiteit in het medium in vergelijking met de totale luciferase activiteit voor elk putje. Omdat de cel plaat beide geconditioneerde medium naast cellen bevat en de plaat alleen-medium evenveel van geconditioneerde medium als de plaat van de cel bevat, is het geschikt voor gebruik van de volgende vergelijking: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58265/58265eq1.jpg"> Hier, RLU = relatieve luminescentie eenheden, de achtergrond-afgetrokken uitlezing van de afleesapparaat.</li>
	<li>Bereken de gemiddelde secreted luciferase van de positieve controle (WT) en de negatieve controle (S386A)-wells.</li>
	<li>Het evalueren van de algehele kwaliteit van het experiment door berekening van een Z-factor13: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58265/58265eq2.jpg"> Opmerking: De actieve waarden komen uit de positieve controle (WT) en de inactieve waarden zijn afkomstig uit de putten van de negatieve controle (S386A). Waarden dichter naar 1 geven aan een hogere experimentele kwaliteit. Overweeg dan herhalen van het experiment of de workflow optimaliseren als de waarde lager dan 0 is.</li>
	<li>De gegevens van de spreadsheet-programma in de software van de analyse van de wetenschappelijke gegevens overbrengen.</li>
	<li>Normaliseren van de werkzaamheden van de secreted luciferase aan de gemiddelde waarden van de positieve controle (WT) en de negatieve controle (S386A), waarin de positieve controle als 1 en de negatieve controle als 0.</li>
	<li>Schoon de gegevens voor uitschieters methode regressie en uitbijter verwijdering (nederlaag), het instellen van het interval van de maximale valse ontdekking tot 1%.</li>
	<li>Evalueren voor statistisch significant verschillen door het vergelijken van de gegevens voor elke mutant voorwaarde (of mutant) aan het gemiddelde van de activiteit van de WT (genormaliseerd tot een waarde van 1). Uitvoeren van meerdere ongepaarde t-tests, corrigeren voor meerdere vergelijkingen met behulp van de Holm-Sidak methode en α = 0,05.</li>
</ol>

<ol><li>Park, S. W., Moon, Y. A., Horton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-transcriptional+regulation+of+low+density+lipoprotein+receptor+protein+by+proprotein+convertase+subtilisin%2Fkexin+type+9a+in+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Post-transcriptional regulation of low density lipoprotein receptor protein by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9a in mouse liver.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (48), 50630-50638 (2004).</li>
<li>Cohen, J. C., Boerwinkle, E., Mosley, T. H., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+variations+in+PCSK9%2C+low+LDL%2C+and+protection+against+coronary+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sequence variations in PCSK9, low LDL, and protection against coronary heart disease.</a> New England Journal of Medicine. 354 (12), 1264-1272 (2006).</li>
<li>Ridker, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+Efficacy+and+Safety+of+Bococizumab+in+High-Risk+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular Efficacy and Safety of Bococizumab in High-Risk Patients.</a> New England Journal of Medicine. 376 (16), 1527-1539 (2017).</li>
<li>Sabatine, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolocumab+and+Clinical+Outcomes+in+Patients+with+Cardiovascular+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Evolocumab and Clinical Outcomes in Patients with Cardiovascular Disease.</a> New England Journal of Medicine. 376 (18), 1713-1722 (2017).</li>
<li>Kazi, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost-effectiveness+of+PCSK9+Inhibitor+Therapy+in+Patients+With+Heterozygous+Familial+Hypercholesterolemia+or+Atherosclerotic+Cardiovascular+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Cost-effectiveness of PCSK9 Inhibitor Therapy in Patients With Heterozygous Familial Hypercholesterolemia or Atherosclerotic Cardiovascular Disease.</a> Journal of the American Medical Association. 316 (7), 743-753 (2016).</li>
<li>Kazi, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Updated+Cost-effectiveness+Analysis+of+PCSK9+Inhibitors+Based+on+the+Results+of+the+FOURIER+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Updated Cost-effectiveness Analysis of PCSK9 Inhibitors Based on the Results of the FOURIER Trial.</a> Journal of the American Medical Association. 318 (8), (2017).</li>
<li>Pettersen, D., Fjellström, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+modulators+of+PCSK9+-+A+literature+and+patent+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Small molecule modulators of PCSK9 - A literature and patent overview.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 28 (7), 1155-1160 (2018).</li>
<li>Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+processing+analyses+of+the+single-turnover+PCSK9+protease+reveal+its+substrate+sequence+specificity+and+link+clinical+genotype+to+lipid+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Stepwise processing analyses of the single-turnover PCSK9 protease reveal its substrate sequence specificity and link clinical genotype to lipid phenotype.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (6), 1875-1886 (2018).</li>
<li>Maxwell, K. N., Breslow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral-mediated+expression+of+Pcsk9+in+mice+results+in+a+low-density+lipoprotein+receptor+knockout+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Adenoviral-mediated expression of Pcsk9 in mice results in a low-density lipoprotein receptor knockout phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (18), 7100-7105 (2004).</li>
<li>Benjannet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NARC-1%2FPCSK9+and+its+natural+mutants%3A+zymogen+cleavage+and+effects+on+the+low+density+lipoprotein+%28LDL%29+receptor+and+LDL+cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the low density lipoprotein (LDL) receptor and LDL cholesterol.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48865-48875 (2004).</li>
<li>Cunningham, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+biophysical+studies+of+PCSK9+and+its+mutants+linked+to+familial+hypercholesterolemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural and biophysical studies of PCSK9 and its mutants linked to familial hypercholesterolemia.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 14 (5), 413-419 (2007).</li>
<li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+one-step+site-directed+deletion%2C+insertion%2C+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC Biotechnology. 8, 91(2008).</li>
<li>Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Hall, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+luciferase+reporter+from+a+deep+sea+shrimp+utilizing+a+novel+imidazopyrazinone+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate.</a> ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).</li>
<li>McNutt, M. C., Lagace, T. A., Horton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+activity+is+not+required+for+secreted+PCSK9+to+reduce+low+density+lipoprotein+receptors+in+HepG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Catalytic activity is not required for secreted PCSK9 to reduce low density lipoprotein receptors in HepG2 cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (29), 20799-20803 (2007).</li>
<li>Chorba, J. S., Shokat, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proprotein+convertase+subtilisin%2Fkexin+type+9+%28PCSK9%29+active+site+and+cleavage+sequence+differentially+regulate+protein+secretion+from+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) active site and cleavage sequence differentially regulate protein secretion from proteolysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (42), 29030-29043 (2014).</li>
<li>Benjannet, S., Rhainds, D., Hamelin, J., Nassoury, N., Seidah, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proprotein+convertase+%28PC%29+PCSK9+is+inactivated+by+furin+and%2For+PC5%2F6A%3A+functional+consequences+of+natural+mutations+and+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The proprotein convertase (PC) PCSK9 is inactivated by furin and/or PC5/6A: functional consequences of natural mutations and post-translational modifications.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30561-30572 (2006).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+loss-of-function+mutations+in+PCSK9+and+identification+of+a+compound+heterozygote%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of loss-of-function mutations in PCSK9 and identification of a compound heterozygote.</a> American Journal of Human Genetics. 79 (3), 514-523 (2006).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De experimentele procedures die hierboven beschreven presenteer een methode om te overwinnen de intrinsiek lage activiteit van de single-omzet protease PCSK9 en zijn proteolytische functie wordt geëvalueerd in een robuuste manier. Het sleutelbegrip van de bepaling is gebaseerd op het omzetten van een single-omzet-evenement in een enzymatisch versterkte uitlezing. De sterke punten van de bepaling zijn de relatief korte tijd-frame en gebruiksgemak van de luciferase verslaggever, evenals haar schaalbaarheid voor high-throug...

PCSK9 richt de LDL-receptor (LDL-R) voor afbraak, verhoging van LDL cholesterol (LDL-C) en rijden atherosclerotische hart-en vaatziekten1,2. Therapeutiek targeting PCSK9 krachtig lagere LDL-C en verbeteren van cardiovasculaire uitkomsten voor patiënten, zelfs wanneer toegevoegd aan een agressieve lipide-verlagende therapie met statines3,4. Momenteel goedgekeurde therapieën zijn beperkt tot antilichaam-gebaseerde benaderingen, echter, en lijden onder een gebrek aan kosteneffectiviteit5,6. U kunt dit probleem oplossen, zijn minder dure therapeutische alternatieven, een middel om het identificeren van patiënten kunnen profiteren van meer voordelen, of beide, nodig.
Kleine-molecuul benaderingen kunnen richten intracellulaire PCSK9, bieden een betere wijze van toediening en kostenverlaging, waardoor ze de "Heilige Graal" in dit gebied7. PCSK9 heeft echter bewezen moeilijk te drug door kleine moleculen. Als een protease is gericht op PCSK9 van Proteolytische functie een aantrekkelijke strategie, zoals zelf-proteolyse de snelheidslimieten stap in de PCSK9 maturatie8 is en vereist voor het maximale effect op de LDL-R9 is. Tot op heden echter deze strategie niet geslaagd, waarschijnlijk als gevolg van de PCSK9 van unieke biochemie: PCSK9 cleaves alleen zelf10, uitvoeren van een reactie van single-omzet, en na zelf-decolleté, de PCSK9 prodomain blijft gebonden in de actieve site als een auto-remmer11, voorkomen van de uitlezing van elke verdere protease-activiteit.
Dit artikel presenteert een methode om te evalueren van de Proteolytische functie PCSK9 in high-throughput mode8. Via plaats-geleide mutagenese, kunnen onderzoekers deze test gebruiken om de effecten van codering SNPs gevonden in de kliniek om te beoordelen voor effecten op proteolyse, de snelheidslimieten stap van PCSK9 rijping sonde. Bovendien, zal deze methode nuttig zijn in het ontwerp van hoge-doorvoer schermen te identificeren modulatoren van PCSK9 proteolyse, die worden verwacht om uiteindelijk het verstoren van de presentatie van PCSK9 de LDL-r (en moduleren van PCSK9 van hypercholesterolemic effect) . Ten slotte kan dit protocol worden aangepast aan andere proteasen met intrinsiek lage activiteit, mits i) een paar specifieke substraat-protease kan worden gevonden, en ii) een geschikt intracellulaire anker voor het substraat kan worden vastgesteld.

<table><tbody><tr><td>PCR Tubes</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2900</td><td>Voor PCR</td></tr><tr><td>Q5 Hot Start</td><td>New England Biolabs</td><td>M0493L</td><td>High-fidelity DNA Polymerase</td></tr><tr><td>Deoxynucleotide Solution Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td>dNTPs (voor PCR)</td></tr><tr><td>pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT</td><td>Auteurs</td><td>n/a</td><td>Beschikbaar bij auteurs</td></tr><tr><td>pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A</td><td>Auteurs</td><td>n/a</td><td>Beschikbaar bij auteurs</td></tr><tr><td>Agarose LE</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-201-100</td><td>Voor DNA gels</td></tr><tr><td>E-Gel Imager System met Blue Light Base</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4466612</td><td>Voor beeldvorming van DNA gels</td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33102</td><td>Voor DNA gels</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>Voor DNA gel running buffer</td></tr><tr><td>Glacial azijnzuur</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A38-500</td><td>Voor DNA gel running buffer</td></tr><tr><td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur oplossing</td><td>Millipore Sigma</td><td>3690</td><td>EDTA, voor DNA gel running buffer</td></tr><tr><td>1 kb DNA ladder</td><td>Gold Biotechnology</td><td>D010</td><td>DNA ladder</td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td>Beperkingsenzym</td></tr><tr><td>LB Agar platen met 100 &micro;g/mL carbencillin</td><td>Teknova</td><td>L1010</td><td>LB-Carb platen</td></tr><tr><td>One Shot Mach1 T Phaage-resistent Chemisch Competent E. coli</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C862003</td><td>Chemisch competente cellen</td></tr><tr><td>LB Broth, Miller</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP1426-2</td><td>LB</td></tr><tr><td>Carbenicilline</td><td>Gold Biotechnology</td><td>C-103-5</td><td>Selectief antibioticum</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I</td><td>Omega BioTek</td><td>D6942-02</td><td>DNA Zuivering Miniprep kit</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 Spectrofotometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-2000C</td><td>Spectrofotometer</td></tr><tr><td>293T Cellen</td><td>American Tissue Culture Collection (ATCC)</td><td>CRL-3216</td><td>HEK 293T cellen</td></tr><tr><td>DMEM, hoge glucose, pyruvaat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11995065</td><td>DMEM, zoogdiercel media</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Axenia Biologix</td><td>F001</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,05%), fenolrood</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300062</td><td>Trypsine, voor celdissociatie</td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Countess geautomatiseerde celteller</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10227</td><td>Geautomatiseerd celtelling</td></tr><tr><td>Countess celtelling kamer slides</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10228</td><td>Slides voor celtelling</td></tr><tr><td>CELLSTAR weefselkweek platen, Wit, Wit-onderkant, met deksel</td><td>Grenier Bio-One</td><td>655083</td><td>Witte, wit-onderkant 96 wel plate</td></tr><tr><td>TempPlate non-skirted 96-wel PCR plaat, natuurlijk</td><td>USA Scientific</td><td>1402-9596</td><td>96 wel plaat voor master plasmid plaat</td></tr><tr><td>Nunc 2,0mL DeepWell Plates</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>278743</td><td>96 wel deep well plaat</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000008</td><td>Lipide transfectie reagens, Lf3K</td></tr><tr><td>P3000 Reagens</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000008</td><td>DNA pre-complexatie reagens, geleverd met Lf3K</td></tr><tr><td>OptiMEM I Reduced Serum Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985062</td><td>Gereduceerd serum medium voor transfectie</td></tr><tr><td>(+)-Natrium L-ascorbaat</td><td>Millipore Sigma</td><td>A4034</td><td>Natrium ascorbaat</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9888</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Albumine, bovien serum, fractie V, laag zwaar metaalgehalte</td><td>Millipore Sigma</td><td>12659</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Methanol (HPLC)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A4524</td><td>MeOH</td></tr><tr><td>Zoutzuur</td><td>VWR</td><td>JT9535-2</td><td>Geconcentreerd HCl</td></tr><tr><td>Coelenterazine</td><td>Gold Biotechnology</td><td>CZ2.5</td><td>Luciferase substraat</td></tr><tr><td>Spuitfilter, sterieel</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>09-720-3</td><td>Sterieel filter, PVDF, 0,22 &micro;m porie</td></tr><tr><td>Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+</td><td>Rainin</td><td>17013810</td><td>Multikanaals pipet</td></tr><tr><td>Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+</td><td>Rainin</td><td>17013808</td><td>Multikanaals pipet</td></tr><tr><td>Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+</td><td>Rainin</td><td>17013807</td><td>Multikanaals pipet</td></tr><tr><td>Reagens reservoir</td><td>Corning</td><td>4870</td><td>Trog voor reagentia</td></tr><tr><td>Centrifuge tubes, 15 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>05-539-12</td><td>15 mL tubes</td></tr><tr><td>Centrifuge tubes, 50 mL</td><td>Corning</td><td>430829</td><td>50 mL tubes</td></tr><tr><td>Spark Microplate Reader</td><td>Tecan</td><td>N/a</td><td>Plate Reader</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>2016 voor Mac</td><td>Spreadsheet software</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad Software</td><td>v7</td><td>Wetenschappelijke dataanalyse software</td></tr></tbody></table>

een high-throughput luciferase assay te evalueren proteolyse van de single-omzet protease-pcsk9

A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is een single-omzet protease die serum low-density lipoprotein (LDL) niveaus regelt en, bijgevolg, hart-en vaatziekten. Hoewel PCSK9 proteolyse vereist voor het volledige hypercholesterolemic effect is, de evaluatie van zijn proteolytische functie is uitdagend: PCSK9 is alleen bekend dat het klieven zelf, ondergaat slechts een enkele omzet, en na proteolyse, behoudt zijn substraat in de actieve site als een auto-remmer. De hier gepresenteerde methoden beschrijven een bepaling die deze uitdagingen overwint. De test richt zich op intermoleculaire proteolyse in een cel-gebaseerde context en de succesvolle decollete koppelingen aan de secreted luciferase activiteit, die kan gemakkelijk worden voorgelezen in het geconditioneerde medium. Via opeenvolgende stappen van mutagenese, voorbijgaande transfectie en een luciferase uitlezing, de bepaling kan sonde PCSK9 proteolyse onder voorwaarden van genetische of moleculaire perturbation in zodanig hoge gegevensdoorvoer. Dit systeem is geschikt voor zowel de biochemische evaluatie van klinisch ontdekte missense single-nucleotidepolymorfisme (SNPs), alsook wat betreft de screening van kleine-molecuul remmers van PCSK9 proteolyse.

De high-throughput proteolyse bepaling berust op drie belangrijke uitdagingen te overwinnen. Eerst, om te overwinnen de intrinsiek lage output van een single-omzet PCSK9 protease, een PCSK9 protease ontbreekt de remmende prodomain wordt gebruikt, met de volgorde van de splitsing op de staart van de prodomain gekoppeld aan een luciferase die kan secreted14. Ten tweede, om te voldoen aan de behoefte aan de protease te vouwen in complexe met zijn remmende prodomain, d...

Dit protocol biedt een methode om te evalueren van de proteolytic activiteit van een intrinsiek laag-activiteit, één omzet protease in een cellulaire context. In het bijzonder is deze methode toegepast om te evalueren van de proteolytic activiteit van PCSK9, een belangrijke bestuurder van lipide metabolisme waarvan proteolytic activiteit vereist voor de ultieme hypercholesterolemic functie is.

Een High-Throughput Luciferase Assay te evalueren proteolyse van de Single-omzet Protease-PCSK9

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, ...

Deze methode kan helpen om sleutelvraagstukken in het PCSK9 Biochemie-gebied te beantwoorden, zoals welke geneesmiddelen of genetische veranderingen van invloed zijn op de proteolytische functie van PCSK9. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een snelle en versterkbare uitlezing van een intrinsiek laagfrequent biochemisch evenement mogelijk maakt. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot Atherosclerotische Hartziekte omdat de proteolytische functie van PCSK9 vereist is voor het uiteindelijke effect op de serumcholesterolwaarden.Hoewel deze methode inzicht kan bieden in PCSK9 zelf, kan deze ook worden toegepast op andere biochemische systemen, zoals andere Proteasen met intrinsiek lage proteolytische activiteit. Om te beginnen, zuigt Medium af van elke HEK293 T-cel. Was met PBS en behandel met het minimale volume van 0,5% Trypsin-EDTA.En incubeer gedurende twee tot vijf minuten bij 37 graden Celsius om de cellen los te maken van de ouderflas. Voeg twee volumes DMEM aan toe, gesupplementeerd met 10%FBS, om de Trypsin-EDTA te inactiveren. Pipetteer vervolgens de vloeistof in de fles om en om enkele keren, los de aanhangende cellen en breng de cellen ov

a-high-throughput-luciferase-assay-to-evaluate-proteolysis-single

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

The video demonstrates the luciferase assay used to quantify luciferase-tagged proteins. The assay uses an engineered luciferase enzyme composed of a large fragment that binds with the small fragment, which is conjugated with a protein of interest. The bound subunits form an active enzyme that, in the presence of the substrate, releases a luminescent signal. This signal is then quantified using a luminometer.

The Luciferase Assay: A High-Throughput Assay to Measure Luminescent Signals Using Engineered Nanoluciferase System-Based Bioreporters

This video demonstrates an assay to screen for the proteolytic activity of proteases using fluorogenic peptides. The protease recognizes its cleavage site on the peptide, cleaving it and separating the quencher from the fluorophore, enabling its fluorescence emission. The fluorescence signal is detected and analyzed to check for the cleavage efficiency of different peptide variants.

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen the Proteolytic Activity of Proteases

This video demonstrates the procedure of measuring γ-secretase activity in genetically modified human cells using a tetracycline-inducible system. The process involves inducing APP gene expression with tetracycline, generating amyloid-β peptides, and activating luciferase production. The bioluminescence resulting from the luciferase-substrate reaction is then measured, reflecting γ-secretase activity.

Luciferase Assay for Measuring &#947;-Secretase Activity in Human Cells

We presenteren een snelle en goedkope screening methode voor het identificeren van transcriptiefactoren met behulp van high-throughput robotachtige transfecties en een zelfgemaakte dual-gloed luciferasetest. Dit protocol snel genereert direct naast elkaar functionele data voor duizenden genen en is gemakkelijk aanpasbaar aan een gen van belang te richten.

High-throughput Functionele Screening met behulp van een zelfgemaakte Dual-gloed Luciferase Assay

Het bereiken van een systeemniveau begrip van cellulaire processen is een doel van de hedendaagse celbiologie. We beschrijven hier strategieën voor multiplexing luciferase reporters van verschillende cellulaire functie eindpunten naar gen-functie met behulp van genoom-schaal RNAi bibliotheken ondervragen.

Een Multiplexed Luciferase-gebaseerde screening Platform voor ondervragen Kanker-geassocieerde signaaltransductie in gekweekte cellen

Dit rapport beschrijft protocollen voor het meten van degradatiesnelheden van verkeerd gevouwen eiwitten door middel van western blot of fluorescentie-gebaseerde assays. De methoden kunnen worden toegepast op de analyse van andere verkeerd gevouwen eiwitten en voor high-throughput screening.

Assays voor de afbraak van Misfolded Eiwitten in Cellen

We hebben met succes twee substraat-specifieke γ-secretase tests gegenereerd. Zowel cel-gebaseerde testen hier gepresenteerd zijn ontworpen om het kwantificeren van de enzymatische activiteiten γ-secretase via de uitgang van firefly luciferase verslaggevers.

Kwantitatieve meting van de γ-Secretase-gemedieerde amyloïde Precursor proteïne en Notch decollete in cel-gebaseerde Luciferase verslaggever Assay platformen

Hier presenteren we een luciferase gebaseerde biosensor om te kwantificeren van het kinaseactiviteit van grote tumor suppressor (LATS)-een centrale kinase in de Hippo signalering traject. Deze biosensor heeft diverse toepassingen bij fundamenteel en translationeel onderzoek gericht op het onderzoeken van Hippo traject regelgevers in vitro en in vivo.

Controle van Hippo signalering Pathway activiteit met behulp van een Biosensor Luciferase gebaseerde grote Tumor Suppressor (LATS)

Hier presenteren we de gedetailleerde procedure van een onlangs ontwikkelde protease assay platform met behulp van N-terminal hexahistidine/maltose-bindend-proteïne en fluorescente proteïne-gesmolten recombinante substraten gekoppeld aan het oppervlak van nikkel-nitrilotriacetic zure magnetische agarose kralen. Een latere in-gel-analyse van de monsters van de assay gescheiden door elektroforese van het gel van natrium dodecyl sulfaat-polyacrylamide is ook gepresenteerd.

Gebruik van recombinante Fusion eiwitten in een fluorescerende Protease Assay Platform en hun In-gel renaturatie

We hebben een split-luciferase reassemblagetest opgezet om de contacten tussen endoplasmatisch reticulum en mitochondriën in levende cellen te monitoren. Aan de hand van deze test beschrijven we een protocol om het niveau van deze inter-organelkoppelingen in HEK293T cellen kwantitatief te meten, onder de voorwaarde van chemische behandeling.

Split-luciferase herassemblagetest om endoplasmatisch reticulum-mitochondriëncontacten in levende cellen te meten

Leer een high-throughput luciferase-assay om de proteolytische activiteit van PCSK9 te evalueren met HEK293 T-cellen. Deze methode biedt snelle, versterkbare aflezingen voor laagfrequente biochemische gebeurtenissen.

Een High-Throughput Luciferase Assay te evalueren proteolyse van de Single-omzet Protease-PCSK9

Meer video's verkennen