Een High-Throughput Luciferase Assay te evalueren proteolyse van de Single-omzet Protease-PCSK9
28 augustus 2018
Dit protocol biedt een methode om te evalueren van de proteolytic activiteit van een intrinsiek laag-activiteit, één omzet protease in een cellulaire context. In het bijzonder is deze methode toegepast om te evalueren van de proteolytic activiteit van PCSK9, een belangrijke bestuurder van lipide metabolisme waarvan proteolytic activiteit vereist voor de ultieme hypercholesterolemic functie is.
Deze methode kan helpen om sleutelvraagstukken in het PCSK9 Biochemie-gebied te beantwoorden, zoals welke geneesmiddelen of genetische veranderingen van invloed zijn op de proteolytische functie van PCSK9. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een snelle en versterkbare uitlezing van een intrinsiek laagfrequent biochemisch evenement mogelijk maakt. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot Atherosclerotische Hartziekte omdat de proteolytische functie van PCSK9 vereist is voor het uiteindelijke effect op de serumcholesterolwaarden.
Hoewel deze methode inzicht kan bieden in PCSK9 zelf, kan deze ook worden toegepast op andere biochemische systemen, zoals andere Proteasen met intrinsiek lage proteolytische activiteit. Om te beginnen, zuigt Medium af van elke HEK293 T-cel. Was met PBS en behandel met het minimale volume van 0,5% Trypsin-EDTA.
En incubeer gedurende twee tot vijf minuten bij 37 graden Celsius om de cellen los te maken van de ouderflas. Voeg twee volumes DMEM aan toe, gesupplementeerd met 10%FBS, om de Trypsin-EDTA te inactiveren. Pipetteer vervolgens de vloeistof in de fles om en om enkele keren, los de aanhangende cellen en breng de cellen over naar een steriele buis.
Vervolgens verwijdert u een kleine aliquot van cellen. Kleur met een gelijk volume Trypan Blue en breng de gekleurde cellen over naar een dia en gebruik een geautomatiseerde celteller om de cellen te tellen. Centrifugeer de buis gedurende vijf minuten bij 500 keer G om de cellen te herstellen.
Na dit aspiriërt u het Medium en reconstrueert u de cellen en Cultuur Medium tot de gewenste concentratie. Gebruik een multi-kanaals pipet en een steriele trog om 100 micrometer van de cellen in elk putje over te brengen naar een witte 96-welplate. Vervolgens incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide.
Bereid vervolgens de plaat met Plasmiden voor op de gewenste concentratie voor transfectie, inclusief vier putjes voor het positieve controle-plasmide, negatieve controle-plasmide en Plasmid-vrije Buffer. Bereid eerst een Master Mix van verdund Lipid Transfectie Reagens en een Master Mix van DNA Pre-complexatie Reagens. Gebruik vervolgens een multi-kanaals pipet en een steriele trog om 16,8 microliter van de verdunde DNA Pre-complexatie Reagens in elk putje van een Deep Well Plate af te geven.
Gebruik vervolgens de multi-kanaals pipet om 3,2 microliter van elk Plasmide van de Master Plate over te brengen naar elk putje van de Deep Well Plate. Gebruik vervolgens de pipet om 20 microliter van het verdunde Lipid Transfectie Reagensmengsel toe te voegen aan elk putje van de plaat en meng grondig. Bedek de platen en laat ze 10 tot 15 minuten bij kamertemperatuur staan om Lipid DNA Complexen te vormen.
Gebruik vervolgens de multi-kanaals pipet om het Medium voorzichtig te verwijderen uit de 293 T cellen in de 96-welplate. Vervolgens vervangt u het Medium door 95 microliter DMEM, gesupplementeerd met 10%FBS. Gebruik vervolgens de multi-kanaals pipet om 10 microliter van het Transfectiemengsel toe te voegen aan elk geschikt putje.
Vervolgens incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius met 5% Koolstofdioxide. Bereid eerst de Stockoplossingen voor die nodig zijn om het Double-Strength Coelenterazine Assay Reagens te maken, inclusief drie molaair natriumascorbinezuur in PBS, vijf molaair natriumchloride in gedestilleerd water, 10 milligram per milliliter BSA in PBS en twee millimolar Coelenterazine in gezuurd methanol. Bereid vervolgens voldoende Coelenterazine Reagents voor de Luciferase uitlezing.
Met een apart reagens voor de cellen in het Medium. Meng vervolgens alle reagentia behalve de Coelenterazine. Filter het mengsel door een 0,22 micrometer spuitfilter.
En voeg na filtratie de Coelenterazine toe. Verwijder de cellen 24 uur na de transfectie uit de incubator. Gebruik vervolgens de multi-kanaals pipet om 50 microliter geconditioneerd Medium uit elk putje over te brengen naar een nieuwe witte 96-Well Plate.
Gebruik de multi-kanaals pipet om 50 microliter Double-Strength Niet-lytisch Coelenterazine Reagens toe te voegen aan de plaat die alleen Geconditioneerd Medium bevat. Schud vervolgens voorzichtig de plaat in het donker gedurende vijf tot tien minuten bij kamertemperatuur. Herhaal vervolgens deze stap door het Double-Strength Lytisch Coelenterazine Reagens toe te voegen aan de plaat met de cellen.
Na de incubatie meet u de luminescentie van de Medium-only plaat en de Celbevattende plaat in een Plate Reader. Gooi ten slotte de platen weg en bewaar de bestanden voor verdere gegevensanalyse. Het is belangrijk om het Luciferase Reagens met de Medium-only Plaat en de Celbevattende Plaat gedurende dezelfde tijd te incuberen, omdat de gegevens voor deze platen direct worden vergeleken.
In dit protocol werd de Specificiteit van de Cleavagesequentie van de PCSK9 Protease op Substraatlocaties P6 tot P6 Prime geëvalueerd door een Luciferase Assay. De veranderingen in de Cleavagesequentie op posities P6 en P4 tot P1 Prime worden slecht verdragen door de Protease. Maar posities P5 en P2 Prime tot P6 Prime zijn flexibeler om te veranderen.
Bovendien tonen de resultaten aan dat de optimale Cleavagesequenties in wezen hetzelfde zijn als de Wild type Sequentie. De relatieve Cleavageactiviteit van een bibliotheek van missent snips gevonden in de kliniek werd vergeleken met de Wild type Protease. Van de 84 geëvalueerde snips, vertoonde meer dan de helft significante veranderingen in activiteit vergeleken met de Wild type Protease, wat suggereert dat veranderingen in Protease Activiteit frequent worden waargenomen in de klinische populatie.
Volgend op deze procedure kunnen andere methoden, zoals flowcytometrie of Cholesterol Opname Assays in hepatocyten, worden uitgevoerd om veranderingen in de proteolytische capaciteit van PCSK9 op het effect van PCSK9 op de LDL-receptor te evalueren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol presenteert een methode om de proteolytische activiteit van PCSK9 te evalueren, een belangrijke drijver van het lipidenmetabolisme. De techniek maakt een snelle uitlezing van biochemische gebeurtenissen met een lage frequentie mogelijk, wat cruciaal is voor het begrijpen van de rol van PCSK9 bij hypercholesterolemie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Biochemie
- Proteolytische enzymologie
- Lipidenmetabolisme
Achtergrond
- PCSK9 is essentieel voor de regulatie van serumcholesterolspiegels.
- Inzicht in de proteolytische functie ervan kan bijdragen aan de ontwikkeling van geneesmiddelen.
- De methode kan ook worden toegepast op andere proteasen met een lage activiteit.
- Dit onderzoek heeft implicaties voor atherosclerotische hartziekten.
Doel van de studie
- Om de proteolytische activiteit van PCSK9 in een cellulaire context te evalueren.
- Om de effecten van geneesmiddelen of genetische veranderingen op de functie van PCSK9 te bepalen.
- Om inzichten te verschaffen die toepasbaar zijn op andere biochemische systemen.
Gebruikte methoden
- Aspireer het medium van de HEK293 T-cellen.
- Was de cellen met PBS.
- Behandel de cellen met 0,5% Trypsine-EDTA.
- Maak gebruik van een methode die amplifyeerbare uitlezingen van proteolytische activiteit mogelijk maakt.
Belangrijkste resultaten
- De methode evalueert met succes laagfrequente proteolytische gebeurtenissen.
- De verkregen inzichten kunnen therapeutische strategieën voor cholesterolbeheer beïnvloeden.
- Potentiële toepassingen strekken zich uit tot andere proteasen.
Conclusies
- Deze techniek vergroot het inzicht in de rol van PCSK9 bij het lipidenmetabolisme.
- Het biedt een kader voor de bestudering van andere proteasen met een lage activiteit.
- De bevindingen kunnen bijdragen aan vorderingen in de behandeling van atherosclerotische hartaandoeningen.
Veelgestelde Vragen
Industriële Relevantie
Het evalueren van de proteolytische functie van single-turnover proteasen zoals PCSK9 is essentieel voor targetvalidatie bij de ontdekking van cardiovasculaire geneesmiddelen. Deze assay maakt high-throughput onderzoek naar genetische en farmacologische perturbaties mogelijk, wat bijdraagt aan mechanistische risicoreductie en voorspellend vertrouwen bij de identificatie van lead-verbindingen. Het slaat een brug tussen het biochemische mechanisme en het fenotypische resultaat door proteaseactiviteit te koppelen aan een luciferase-uitlezing van gesecreteerde eiwitten.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door te testen hoe genetische varianten of verbindingen de proteolytische functie van PCSK9 beïnvloeden.
- Operationele waarde: Maakt een snelle, amplificeerbare uitlezing van laagfrequente biochemische gebeurtenissen in een cellulaire context mogelijk.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de beoordeling van klinische missense SNP's en de effectiviteit van inhibitoren voor portfoliotriage.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Koppelt intermoleculaire proteolyse aan gesecreteerde luciferase-activiteit voor kwantitatieve, homogene detectie.
- Operationele waarde: Compatibel met het 96-wells formaat, wat screening van mutantenbibliotheken of collecties van kleine moleculen mogelijk maakt.
- Klaarheid voor assay: Maakt gebruik van geconditioneerd medium voor niet-lytische meting, waardoor variabiliteit wordt verminderd en kinetische profilering mogelijk wordt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Verbindt in vitro proteolytische activiteit met downstream effecten op de LDL-receptor en cholesterolopname in hepatocyten.
- Mechanische risicoreductie: Verduidelijkt structuur-functierelaties door aan te tonen welke substraatposities mutaties tolereren voor het ontwerp van inhibitoren.
- Voorspellende betrouwbaarheid: Toont aan dat meer dan de helft van de klinische SNP's de activiteit beïnvloedt, wat bijdraagt aan de interpretatie van varianten bij patiëntenstratificatie.
Integratie van Pipeline & Workflow
De assay past binnen de vroege ontdekkingsfase om targetmodulatie te evalueren voordat men overgaat naar cellulaire of fenotypische assays, waardoor een mechanistische brug wordt geslagen tussen target engagement en functionele gevolgen.
- Discovery Biology: Test hoe perturbaties de proteasefunctie beïnvloeden, ter ondersteuning van hypothese-gestuurde targetvalidatie.
- Screening: Maakt high-throughput evaluatie van genetische varianten of verbindingen mogelijk, waarbij luciferase-secretie wordt gebruikt als proxy voor proteolytische splitsing.
- Analytics: Genereert kwantitatieve luminescentie-metingen uit geconditioneerd medium, wat vergelijking tussen condities en normalisatie naar celgetal mogelijk maakt.
- Translationeel Onderzoek: Informeert vervolgassays, zoals cholesterolopname in hepatocyten, om de fysiologische relevantie van proteolytische veranderingen te beoordelen.
- Enterprise Hergebruik: Aanpasbaar aan andere proteases met lage activiteit, waardoor het dient als platform voor proteolytische targetvalidatie over verschillende therapeutische gebieden.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanische ambiguïteit door de proteolytische functie direct te meten in een fysiologisch relevante context.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde, reproduceerbare workflow met minimale handmatige tijd en schaalbare uitlezing via een plaatlezer.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door doelwitmodulatie te koppelen aan het biochemische mechanisme, waardoor het risico op falen in een laat stadium wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van PCSK9-gerichte therapeutica mogelijk op basis van proteolytische effectiviteit.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in zoogdiercelkweek, transiënte transfectie en luciferase-gebaseerde assays.
- Afhankelijk van een plaatlezer met luminescentiedetectie en de optimalisatie van de transfectie-efficiëntie in HEK293 T-cellen.
- Standaardisatie van de behandeling van geconditioneerd medium en de incubatietijden van reagentia is noodzakelijk voor een nauwkeurige vergelijking tussen lytische en niet-lytische signalen.
- Aanpassing aan andere proteasen vereist een herontwerp van het substraat en validatie van de koppeling van de luciferase-reporter aan het splitsingsproces.
- Beperkt tot proteasen waarbij splitsing kan worden gekoppeld aan luciferase-secretie; niet geschikt voor intracellulaire proteasen of proteasen met meerdere omzettingen zonder modificatie.
