Adipo-Clear: Een weefsel Clearing methode voor driedimensionale beeldvorming van vetweefsel
July 28th, 2018
Als gevolg van het hoge vetgehalte, heeft adipeus weefsel is uitdagend om te visualiseren met behulp van traditionele histologische methoden. Adipo-Clear is een weefsel clearing techniek waarmee robuuste labeling en hoge resolutie volumetrische fluorescerende beeldvorming van vetweefsel. Hier beschrijven we de methoden voor de bereiding van de monsters, voorbehandeling, kleuring, clearing en montage voor imaging.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van Adipose Tissue Biology, zoals hoe verschillende componenten van vetweefsel interageren in een geheel weefsel. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de overtollige lipiden die in vetweefsel zijn opgeslagen volledig verwijdert terwijl het de driedimensionale architectuur behoudt. Hoewel deze methode inzicht kan geven in die driedimensionale organisatie van vetweefsel, kan deze ook algemeen worden toegepast op andere weefsels met een hoog lipidegehalte, zoals de geheugenklieren en lymfeklieren.
Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de delipidatie en de clearing stappen voldoende incubatietijden vereisen, wat moeilijk te bepalen kan zijn. Begin met het gebruik van een stompe pincet om de vetlap van belang te dissecteren van een vers geperfundeerde diermodel. Verwijder voorzichtig de hele vetlap zonder het weefsel te knijpen of uit te drukken of het gedissekteerde weefsel te besmetten met vacht.
Plaats de vetlap in ongeveer 10 milliliter fixeeroplossing in een conische buis van 15 milliliter en post fixeer hem bij vier graden Celsius overnacht. De volgende dag, na het wassen van het monster met PBS, verwijder voorzichtig eventueel puin van het monster onder een dissectiemicroscoop. Haar, pluisjes of ander vuil dat aan het monster is gehecht, veroorzaken schaduwen tijdens beeldvorming.
Breng het schone monster over naar een polypropyleen buis met ijskoud, 20 procent methanol B1N buffer. Plaats de buis met het monster horizontaal op een orbitale schudder, stel hem in op 100 RPM en schud gedurende 30 minuten tot 1 uur, afhankelijk van de grootte van het monster. Zorg ervoor dat de monsters zich vrij kunnen bewegen in de buis.
Ga door met het uitdrogen van de monsters door een gegradueerde reeks van 40 procent, 60 procent en 80 procent methanol in B1N buffer gevolgd door 100 procent methanol. Minimaliseer de overdracht van de oplossing. Na dehydratie, vervang de 100 procent methanol oplossing met 100 procent dichloromethaan of DCM om het monster te delipideren.
Herhaal de wassing twee keer volgens de incubatietijden die in tabel 2 staan vermeld. Het monster zou aan het eind van de tweede en derde DCM wassingen naar de bodem van de buis moeten zinken. Zo niet, verleng dan de incubatietijd om volledige delipidatie te garanderen.
Na delipidatie, was twee keer met 100 procent methanol gedurende de tijd die in tabel 2 is aangegeven. Rehydrateer het monster in een omgekeerde methanol B1N buffer reeks gedurende de tijden die in tabel 2 zijn aangegeven. Na rehydratatie, was het monster met PTXWH buffer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
Het monster is nu klaar voor immunokleuring of kan worden opgeslagen in PTXWH buffer bij 4 graden Celsius voor maximaal 1 jaar. Verdun eerst het primaire antilichaam in PTXWH buffer tot de aanbevolen concentratie. Centrifugeer vervolgens de verdunde antilichaamoplossing gedurende 10 minuten bij 20 duizend G om het introduceren van antilichaambreukjes of aggregaties te voorkomen.
Het is belangrijk om de juiste primaire antilichamen te kiezen die compatibel zijn met methanol en DCM behandeling. Nieuwe antilichamen moeten worden gevalideerd met kleine stukjes weefsel of met methanol behandelde weefselsecties. Incubeer het gedelipideerde monster met de primaire antilichaamoplossing gedurende 3 tot 5 dagen, afhankelijk van de grootte van het monster.
Na de primaire incubatie, was het monster met verschillende verversingen van PTXWH buffer. De volgende dag, verdun het secundaire antilichaam in PTXWH buffer tot de aanbevolen concentratie. Centrifugeer de verdunde antilichaamoplossing zoals voorheen.
Incubeer het monster met de secundaire antilichaamoplossing gedurende 3 tot 5 dagen, afhankelijk van de grootte van het monster. Was het monster opnieuw met PTXWH buffer in een reeks incubatiestappen zoals voorheen. De volgende dag, was het monster met 1XPBS gedurende 5 minuten, 10 minuten en vervolgens 30 minuten.
Inbed vetweefsel in agarose om de monstermontage voor lichtbladmicroscopie te vergemakkelijken. Bereid eerst de inbeddingsoplossing voor met 1 procent agarose in 1XPBS. Koel de inbeddingsoplossing af tot ongeveer 40 graden Celsius om blootstelling van het monster aan overmatige hitte te voorkomen.
Bij het vermijden van vloeistofoverdracht, plaats het schoongemaakte weefselmonster in een mal en rangschik het in de gewenste positie. Giet vervolgens voorzichtig de inbeddingsoplossing over het monster terwijl luchtbellen worden vermeden. Eventuele luchtbellen moeten naar de rand worden bewogen voordat de agarose stolt.
Zodra de agarose volledig is gestold, snijd een blok uit met het monster erin. Breng het monster over naar 25 procent methanol in water, bescherm het tegen licht en incubeer het met schudden gedurende de tijd die in tabel 2 is aangegeven. Ga door met het uitdrogen van het monster via een methanolgradiënt.
Incubeer het monster gedurende 1 uur in 100 procent DCM met schudden. DCM-behandelde monsters drogen gemakkelijk uit in de lucht, wat de helderheid van het monster zou beïnvloeden en zou resulteren in wazig beeld. Het is belangrijk om monsters snel over te brengen naar een verse oplossing om uitdroging te voorkomen.
Het monster zou aan het eind van elke DCM-was naar de bodem van de buis moeten zinken. Incubeer het monster gedurende de nacht in Dibenzylether of DBE met mild schudden om een overeenkomst van de brekingsindex te bereiken. Het monster zal uiteindelijk transparant worden, onzichtbaar licht.
De volgende dag, na het incuberen van het monster met verse DBE met mild schudden gedurende 2 uur, bewaar het monster bij kamertemperatuur in het donker of ga direct door naar beeldvorming. Om het monster met een lichtbladmicroscoop te beeldvormen die compatibel is met DBE, monteer het in agarose geïmbedde monster op een houder die beweging tijdens beeldvorming kan voorkomen. Om het monster met een omgekeerde confocale of twee-foton microscoop te beeldvormen, plaats het in agarose geïmbedde monster in een kamerplaat met een glazen bodem.
He
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie behandeld een sleutelvraag in de Biologie van Vetweefsel met betrekking tot de interactie van verschillende componenten binnen vetweefsel. Door gebruik te maken van de Adipo-Clear techniek, kunnen onderzoekers vetweefsel in hoge resolutie visualiseren terwijl ze de driedimensionale architectuur behouden, wat inzichten mogelijk maakt in de organisatie en interacties ervan.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Onderzoeksgebied
- Biologie van Vetweefsel
- Weefseldoorzichtigheidstechnieken
- 3D Beeldvorming van Biologische Weefsels
Achtergrond
- Vetweefsel bevat een hoog lipidegehalte, wat visualisatie bemoeilijkt.
- Traditionele histologische methoden zijn niet effectief voor dergelijke weefsels.
- De behoefte aan robuuste beeldvormingstechnieken is cruciaal voor het begrijpen van weefselinteracties.
Gebruikte Methoden
- Adipo-Clear weefseldoorzichtigheidstechniek
- Gebruik van verse diermodellen voor nauwkeurige monsterdissectie
- Lichtbladmicroscopie voor beeldvorming
Belangrijkste Resultaten
- Succesvol doorzichtig gemaakte vetweefsels met behoud van structurele integriteit.
- Gedemonstreerd compatibiliteit met verschillende primaire antilichamen.
- Maakte gedetailleerde visualisatie van adipocyten en hun interacties mogelijk.
Conclusies
- De methode biedt nieuwe paden voor het bestuderen van de structuur van vetweefsel.
- Het belooft toepassingen te hebben bij het begrijpen van andere weefsels met een hoog lipidegehalte.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Adipose tissue biology is central to metabolic disease research, yet lipid-rich composition limits comprehensive 3D visualization. Adipo-Clear enables whole-tissue imaging by removing lipids while preserving architecture, supporting mechanistic de-risking in target validation and phenotypic screening. This approach improves predictive confidence in adipose-resident cell interactions and stromal-vascular niche analysis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of adipose tissue architecture and cellular distribution for target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides volumetric readouts that reduce sampling bias from traditional sectioning.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, lipid-cleared tissue platforms compatible with immunostaining for biomarker co-localization.
- Operational Value: Supports reproducible sample preparation for high-content imaging workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant system modeling by visualizing adipocyte-immune, vascular, and nerve interactions in intact tissue.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of tissue remodeling in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
Adipo-Clear fits within the discovery continuum from target validation through preclinical assessment by providing 3D contextual data on adipose tissue composition and structure.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on cellular organization and intercellular signaling in adipose tissue.
- Screening: Delivers quantitative, spatially resolved outputs for evaluating compound effects on tissue architecture.
- Analytics: Enables volumetric measurements of cell density, vessel density, and nerve innervation as decision-grade readouts.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity via preserved tissue morphology and biomarker compatibility.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable clearing protocol for lipid-rich tissues across metabolic, immunology, and neuroscience programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in adipose tissue studies through intact 3D visualization.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation for multi-site reproducibility in imaging-based assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing off-target effects on adipose stroma or vasculature.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on adipose tissue engagement profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, immunostaining, and clearing chemistry optimization.
- Depends on access to light sheet or compatible confocal microscopy infrastructure.
- Necessitates standardization of delipidation and refractive index matching steps across laboratories.
- Involves adaptation considerations for human versus murine adipose tissue due to lipid density differences.
- Involves practical limitations related to reagent hazards (DCM, DBE) requiring fume hood and PPE compliance.
