Adipo-Clear: Een weefsel Clearing methode voor driedimensionale beeldvorming van vetweefsel
28 juli 2018
Als gevolg van het hoge vetgehalte, heeft adipeus weefsel is uitdagend om te visualiseren met behulp van traditionele histologische methoden. Adipo-Clear is een weefsel clearing techniek waarmee robuuste labeling en hoge resolutie volumetrische fluorescerende beeldvorming van vetweefsel. Hier beschrijven we de methoden voor de bereiding van de monsters, voorbehandeling, kleuring, clearing en montage voor imaging.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van Adipose Tissue Biology, zoals hoe verschillende componenten van vetweefsel interageren in een geheel weefsel. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de overtollige lipiden die in vetweefsel zijn opgeslagen volledig verwijdert terwijl het de driedimensionale architectuur behoudt. Hoewel deze methode inzicht kan geven in die driedimensionale organisatie van vetweefsel, kan deze ook algemeen worden toegepast op andere weefsels met een hoog lipidegehalte, zoals de geheugenklieren en lymfeklieren.
Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de delipidatie en de clearing stappen voldoende incubatietijden vereisen, wat moeilijk te bepalen kan zijn. Begin met het gebruik van een stompe pincet om de vetlap van belang te dissecteren van een vers geperfundeerde diermodel. Verwijder voorzichtig de hele vetlap zonder het weefsel te knijpen of uit te drukken of het gedissekteerde weefsel te besmetten met vacht.
Plaats de vetlap in ongeveer 10 milliliter fixeeroplossing in een conische buis van 15 milliliter en post fixeer hem bij vier graden Celsius overnacht. De volgende dag, na het wassen van het monster met PBS, verwijder voorzichtig eventueel puin van het monster onder een dissectiemicroscoop. Haar, pluisjes of ander vuil dat aan het monster is gehecht, veroorzaken schaduwen tijdens beeldvorming.
Breng het schone monster over naar een polypropyleen buis met ijskoud, 20 procent methanol B1N buffer. Plaats de buis met het monster horizontaal op een orbitale schudder, stel hem in op 100 RPM en schud gedurende 30 minuten tot 1 uur, afhankelijk van de grootte van het monster. Zorg ervoor dat de monsters zich vrij kunnen bewegen in de buis.
Ga door met het uitdrogen van de monsters door een gegradueerde reeks van 40 procent, 60 procent en 80 procent methanol in B1N buffer gevolgd door 100 procent methanol. Minimaliseer de overdracht van de oplossing. Na dehydratie, vervang de 100 procent methanol oplossing met 100 procent dichloromethaan of DCM om het monster te delipideren.
Herhaal de wassing twee keer volgens de incubatietijden die in tabel 2 staan vermeld. Het monster zou aan het eind van de tweede en derde DCM wassingen naar de bodem van de buis moeten zinken. Zo niet, verleng dan de incubatietijd om volledige delipidatie te garanderen.
Na delipidatie, was twee keer met 100 procent methanol gedurende de tijd die in tabel 2 is aangegeven. Rehydrateer het monster in een omgekeerde methanol B1N buffer reeks gedurende de tijden die in tabel 2 zijn aangegeven. Na rehydratatie, was het monster met PTXWH buffer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
Het monster is nu klaar voor immunokleuring of kan worden opgeslagen in PTXWH buffer bij 4 graden Celsius voor maximaal 1 jaar. Verdun eerst het primaire antilichaam in PTXWH buffer tot de aanbevolen concentratie. Centrifugeer vervolgens de verdunde antilichaamoplossing gedurende 10 minuten bij 20 duizend G om het introduceren van antilichaambreukjes of aggregaties te voorkomen.
Het is belangrijk om de juiste primaire antilichamen te kiezen die compatibel zijn met methanol en DCM behandeling. Nieuwe antilichamen moeten worden gevalideerd met kleine stukjes weefsel of met methanol behandelde weefselsecties. Incubeer het gedelipideerde monster met de primaire antilichaamoplossing gedurende 3 tot 5 dagen, afhankelijk van de grootte van het monster.
Na de primaire incubatie, was het monster met verschillende verversingen van PTXWH buffer. De volgende dag, verdun het secundaire antilichaam in PTXWH buffer tot de aanbevolen concentratie. Centrifugeer de verdunde antilichaamoplossing zoals voorheen.
Incubeer het monster met de secundaire antilichaamoplossing gedurende 3 tot 5 dagen, afhankelijk van de grootte van het monster. Was het monster opnieuw met PTXWH buffer in een reeks incubatiestappen zoals voorheen. De volgende dag, was het monster met 1XPBS gedurende 5 minuten, 10 minuten en vervolgens 30 minuten.
Inbed vetweefsel in agarose om de monstermontage voor lichtbladmicroscopie te vergemakkelijken. Bereid eerst de inbeddingsoplossing voor met 1 procent agarose in 1XPBS. Koel de inbeddingsoplossing af tot ongeveer 40 graden Celsius om blootstelling van het monster aan overmatige hitte te voorkomen.
Bij het vermijden van vloeistofoverdracht, plaats het schoongemaakte weefselmonster in een mal en rangschik het in de gewenste positie. Giet vervolgens voorzichtig de inbeddingsoplossing over het monster terwijl luchtbellen worden vermeden. Eventuele luchtbellen moeten naar de rand worden bewogen voordat de agarose stolt.
Zodra de agarose volledig is gestold, snijd een blok uit met het monster erin. Breng het monster over naar 25 procent methanol in water, bescherm het tegen licht en incubeer het met schudden gedurende de tijd die in tabel 2 is aangegeven. Ga door met het uitdrogen van het monster via een methanolgradiënt.
Incubeer het monster gedurende 1 uur in 100 procent DCM met schudden. DCM-behandelde monsters drogen gemakkelijk uit in de lucht, wat de helderheid van het monster zou beïnvloeden en zou resulteren in wazig beeld. Het is belangrijk om monsters snel over te brengen naar een verse oplossing om uitdroging te voorkomen.
Het monster zou aan het eind van elke DCM-was naar de bodem van de buis moeten zinken. Incubeer het monster gedurende de nacht in Dibenzylether of DBE met mild schudden om een overeenkomst van de brekingsindex te bereiken. Het monster zal uiteindelijk transparant worden, onzichtbaar licht.
De volgende dag, na het incuberen van het monster met verse DBE met mild schudden gedurende 2 uur, bewaar het monster bij kamertemperatuur in het donker of ga direct door naar beeldvorming. Om het monster met een lichtbladmicroscoop te beeldvormen die compatibel is met DBE, monteer het in agarose geïmbedde monster op een houder die beweging tijdens beeldvorming kan voorkomen. Om het monster met een omgekeerde confocale of twee-foton microscoop te beeldvormen, plaats het in agarose geïmbedde monster in een kamerplaat met een glazen bodem.
He
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie behandelt een kernvraag in de biologie van vetweefsel met betrekking tot de interactie tussen verschillende componenten binnen het vetweefsel. Met behulp van de Adipo-Clear-techniek kunnen onderzoekers vetweefsel in hoge resolutie visualiseren terwijl de driedimensionale architectuur behouden blijft, watten inzichten mogelijk maakt in de organisatie en interacties ervan.
Belangrijke Onderdeel van de Studie
Onderzoeksgebied
- Biologie van vetweefsel
- Technieken voor weefselverduistering
- 3D-beeldvorming van biologische weefsels
Achtergrond
- Vetweefsel heeft een hoog lipidengehalte, wat de visualisatie bemoeilijkt.
- Traditionele histologische methoden zijn niet effectief voor dergelijke weefsels.
- De behoefte aan robuuste beeldvormingstechnieken is essentieel voor het begrijpen van weefselinteracties.
Gebruikte methoden
- Adipo-Clear weefselverhelderingstechniek
- Gebruik van verse diermodellen voor nauwkeurige dissectie van monsters
- Light-sheet microscopie voor beeldvorming
Belangrijkste resultaten
- Adipose weefsels succesvol geklaard met behoud van de structurele integriteit.
- Compatibiliteit aangetoond met diverse primaire antilichamen.
- Gedetailleerde visualisatie van adipocyten en hun interacties mogelijk gemaakt.
Conclusies
- De methode biedt nieuwe wegen voor het bestuderen van de structuur van vetweefsel.
- Het is veelbelovend voor toepassingen bij het begrijpen van andere weefsels met een hoog lipidgehalte.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor executives
De biologie van vetweefsel is van centraal belang voor onderzoek naar metabole ziekten, maar de lipiderijke samenstelling beperkt een volledige 3D-visualisatie. Adipo-Clear maakt imaging van het volledige weefsel mogelijk door lipiden te verwijderen terwijl de architectuur behouden blijft, wat mechanische risicoreductie bij target-validatie en fenotypische screening ondersteunt. Deze aanpak verbetert het voorspellend vertrouwen in interacties tussen cellen in het vetweefsel en de analyse van de stromaal-vasculaire niche.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar de architectuur en cellulaire distributie van vetweefsel voor het testen van specifieke hypothesen.
- Operationele waarde: Levert volumetrische resultaten die de bemonsteringsbias van traditionele sectieering verminderen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde, lipidenvrije weefselplatforms die compatibel zijn met immunokleuring voor co-lokalisatie van biomarkers.
- Operationele waarde: Ondersteunt reproduceerbare monstervoorbereiding voor high-content imaging workflows.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert de modellering van ziekterelevante systemen door interacties tussen adipocyten, het immuunsysteem, vaten en zenuwen in intact weefsel te visualiseren.
- Operationele waarde: Maakt longitudinale tracking van weefselremodellering in preklinische modellen mogelijk.
Integratie van pipeline en workflow
Adipo-Clear past binnen het continuüm van ontdekking, van doelwitvalidatie tot preklinische beoordeling, door 3D-contextuele gegevens te verschaffen over de samenstelling en structuur van vetweefsel.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing over cellulaire organisatie en intercellulaire signalering in vetweefsel.
- Screening: Levert kwantitatieve, ruimtelijk opgeloste resultaten voor het evalueren van effecten van verbindingen op de weefselarchitectuur.
- Analytics: Maakt volumetrische metingen van celdichtheid, vatdichtheid en zenuwinnervatie mogelijk als beslissingswaardige read-outs.
- Translationeel onderzoek: Verbindt ontdekkingsbevindingen aan preklinische continuïteit via behouden weefselmorfologie en biomarkercompatibiliteit.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar clearing-protocol voor lipiderijke weefsels in metabole, immunologische en neurowetenschappelijke programma's.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in studies naar vetweefsel door middel van intacte 3D-visualisatie.
- Operationele waarde: Standaardiseert de weefselpreparatie voor reproduceerbaarheid op meerdere locaties bij beeldvormingsassays.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door off-target effecten op het adipose stroma of de vasculatuur te onthullen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van profielen van de interactie met vetweefsel.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in weefselverwerking, immunokleuring en optimalisatie van clearing-chemie.
- Is afhankelijk van toegang tot light-sheet- of compatibele confocale microscopie-infrastructuur.
- Maakt standaardisatie van delipidatie- en brekingsindex-matchingstappen tussen laboratoria noodzakelijk.
- Omvat aanpassingen voor menselijk versus muis adipose weefsel vanwege verschillen in lipiddichtheid.
- Houdt rekening met praktische beperkingen met betrekking tot gevaarlijke reagentia (DCM, DBE), waarvoor naleving van zuurkastgebruik en PBM is vereist.
