Immunohistochemische detectie van 5-Methylcytosine en 5-Hydroxymethylcytosine bij de ontwikkeling en Postmitotic muis Retina

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van DNA-methylatie, zoals veranderingen in chromatine tijdens de ontwikkeling van de retina in postmitotische retina. Het grote voordeel van deze techniek is dat deze robuust kan worden toegepast op alle secties van alle muisretinaweefsels die 5-methylcytosine, 5-hydroxymethylcytosine-verdeling dragen en die op een vergelijkbare manier zijn verwerkt. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de stappen voor het voorbereiden en kleuren van het weefsel moeilijk te leren zijn, want als er gebruik wordt gemaakt van bevroren histologische preparaten, kan waardevol organisatorisch en origineel weefsel verloren gaan.

De rest van de procedure zal worden gedemonstreerd door Pablo Diaz, onderzoeksmedewerker van ons laboratorium. Om deze procedure te starten, gebruik een 29 gauge halve inch naald om de ogen van een onthoofde, geëuthanasieerde muis aan de dorsale kant van de ogen te doorboren. Om oogbekers te verkrijgen, enucleeërt u de ogen onmiddellijk door rond de sclera te snijden met fijne oogheelkundige scharen om de hoornvlies en de lens te verwijderen.

Fixeer de oogbekers en E16 hele ogen in 4% paraformaldehyde of PFA in 1xPBS pH 8,0 gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Was ze twee keer in een milliliter 1xPBS bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Om de oogbekers en hele ogen te cryobeschermen, incubeer ze in 1xPBS pH 8,0 met 10% sucrose bij kamertemperatuur gedurende een uur.

Vervolgens in 20% sucrose in 1xPBS gedurende een uur. En ten slotte in 30% sucrose in 1xPBS bij 4 graden Celsius overnacht. Op de volgende dag bedden de oogbekers en ogen in een optimaal snijtemperatuurcompound, of OCT, in cryovormpjes.

Vries ze vervolgens snel in een droogijs-ethanolbad en bewaar ze bij 80 graden Celsius. Voordat u begint met cryosectie, verwijdert u de vormpjes met ingebedde oogbekers en ogen uit 80 graden Celsius. Plaats ze in een cryostathouder en laat ze gedurende een uur gelijkwaardig zijn aan 20 graden Celsius.

Gebruik een cryostat bij 20 graden Celsius om 12 micrometer dikke retinale dwarssecties te snijden die parallel zijn aan de temporonasal as door de kop van de nervus opticus. Monteer de secties op microscoopglazen en bewaar ze bij 80 graden Celsius. Om immunokleuring te starten, gebruik een hydrofobe barrièrepen om de retinale secties die op glijmiddelen zijn gemonteerd, te omcirkelen.

Was de secties eenmaal met 200 microliter 1xPBS gedurende 10 minuten. Maak de secties permeabel met 200 microliter PBST gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Denatureer ze vervolgens met 200 microliter vers bereide zorgvuldig getitreerde 2 Normale zoutzuur in 1xPBS gedurende 45 minuten bij 37 graden Celsius om het 5mC-signaal te optimaliseren.

Na denaturatie, voeg 100 microliter 0,1 Tris-HCl pH 8,3 toe aan de retinale secties, en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om ze te neutraliseren. Voeg vervolgens 500 microliter blokkeeroplossing toe. En incubeer de secties in een vochtigheidskamer bij kamertemperatuur gedurende een uur.

Voeg de geschikte antilichamen toe, verdund tot 1 op 500 in blokkeeroplossing, toe aan de secties en incubeer ze overnacht bij vier graden Celsius. Op de volgende dag was de secties drie keer gedurende 10 tot 15 minuten met 0,1% PBST. Voeg geschikte secundaire antilichamen toe die zijn verdund tot 1 op 1000 in blokkeeroplossing met DAPI-oplossing bij kamertemperatuur gedurende een uur.

Was vervolgens de glijmiddelen drie keer met een milliliter 0,1% PBST gedurende 10 minuten. Na de laatste wasbeurt, voegt u waterig montagemedium toe. Bedek met een dekglas.

En ga vervolgens verder met confocale microscopie. Na retinale immunokleuring bij E16, was het 5mC-signaal sterk in de chromocentra van de celkernen en aanwezig op een veel lagere niveau in de hele celkernen. 5hmC-kleuring werd uitsluitend gevonden in de celkernen en ontbrak in de chromocentra.

In P0-retina waren zowel 5mC- als 5hmC-signalen aanwezig in de buitenste neuroblastenlaag en de binnenste neuroblastenlaag. 5mC-signaal was sterk in de chromocentra en nucleaire periferie van de celkernen, en zwakker tussen de chromocentra van de celkernen. 5hmC-kleuring was beperkt tot de celkern.

In P15-retina, in de buitenste nucleaire laag, werd 5mC-signaal gedetecteerd in de chromocentra van de celkernen en nucleaire periferie. Terwijl 5hmC-signaal in de hele celkernen was, behalve in de chromocentra. In de binnenste nucleaire en ganglioncel-laag was 5mC-signaal sterk in de chromocentra van de celkernen en zwak in hele celkernen.

Terwijl het 5hmC-signaal werd gevonden in de hele celkernen, behalve in de chromocentra. In volwassen staaffotoreceptoren was het 5mC-signaal beperkt tot de chromocentra en nucleaire periferie, terwijl het 5hmC-signaal beperkt was tot de nucleaire periferie. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om histologische secties te behandelen met de optimale blootstelling aan HCl, namelijk 30 minuten.

Als de blootstelling minder of meer is, kunnen optimale resultaten niet reproduceerbaar zijn. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals hoogdrukkaschromatografie, massaspectrometrie worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals kwantificering van veranderingen bij het meten van 5-methylcytosine en 5-hydroxymethylcytosine. Na de ontwikkeling ervan, heeft deze techniek de weg geëffend voor onderzoekers op het gebied van neurale ontwikkeling om epigenetische veranderingen in chromatine te onderzoeken.

Vergeet niet dat het werken met HCl en PFA uiterst gevaarlijk kan zijn, en voorzorgsmaatregelen, zoals correcte verwijdering, moeten altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.