Name: Immunohistochemische detectie van 5-Methylcytosine en 5-Hydroxymethylcytosine bij de ontwikkeling en Postmitotic muis Retina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Leer immunohistochemische detectie van 5mC en 5hmC in muizenretina tijdens ontwikkeling en postmitose. Deze methode maakt gedetailleerd onderzoek naar epigenetische veranderingen en chromatindynamica mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door een subsidie van SBIR (1R44EY027654-01A1).

Alle procedures met muizen werden uitgevoerd volgens protocollen door de Children's Hospital Oakland Research Institute dierlijke zorg en gebruik Comité goedgekeurde en vastgehouden aan de Association for Research in visie en oogheelkunde (ARVO) instructie voor het gebruik van dieren in Oogheelkunde en vision onderzoek.
1. de weefsels immunokleuring voorbereiding
<ol><li>Euthanaseren C57 BL/6J muizen op embryonale dag (E) 16, postnatale (P) 0, P15 en P90 door kooldioxide (CO2) gevolgd door onthoofding (E16 en P0 muizen).</li>
	<li>Onmiddellijk enucleate muis ogen doorboord met 29G 1/2 naald aan de dorsale zijde van het oog. Incubeer gedurende 5 minuten (min) in 1 mL 4% paraformaldehyde (PFA) in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (1 x PBS) pH 8,0 bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Om oog cups van P0, P15 en P90, ontleden uit hoornvlies en lens met fijne ophthalmic schaar terwijl ogen in de 4% PFA. Opmerking: Sla deze stap voor E16 ogen als de ogen zijn te klein.</li>
	<li>De eye cups (P0, P15 en P90) en de hele ogen (E16) vast te stellen in 4% PFA gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Daarna wassen de eye cups en de hele ogen tweemaal in 1 mL 1 x PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Cryoprotect het oog kopjes en hele ogen in 1xPBS, pH 8,0 met 10 gewichtspercenten sacharose gedurende 1 uur. Houd 20 gewichtspercenten sacharose in 1 x PBS voor 1 uur en dan verzadigd in 30% sacharose in 1 x PBS's nachts bij 4 ° C.</li>
	<li>De volgende dag, de oog-bekers en de hele ogen insluiten in optimale scherpe temperatuur compound (OCT), (500 µL) in cryomolds, module-freeze in een bad van droogijs/ethanol en opslaan bij-80 ° C.</li>
	<li>De mallen met ingesloten eye cups en hele ogen verwijderen-80 ° C en laat equilibreer tot-20 ° C gedurende 1 uur voor cryosectioning.</li>
	<li>Gesneden retinale kruissecties (12 µm dik) parallel aan de as van de temporonasal door het hoofd van de oogzenuw met behulp van een cryostaat bij-20 ° C.</li>
	<li>Monteren van retinale secties op Microscoop dia's53 en winkel bij-80 ° C.</li>
</ol>2. immunokleuring met 5-mC en 5-hmC antilichamen
<ol><li>Omcirkelen het netvlies secties gemonteerd op dia's met een hydrofobe barrière-pen. De hydrofobe barrière pen verlaagt het volume van antilichaam nodig om vlek van het weefsel.</li>
	<li>Wassen van de retinale secties eenmaal met 200 µL van 1 x PBS gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Het netvlies secties met 200 µL van 0,1% permeabilize Triton X-100 in 1 x PBS (PBS-T) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Denatureren retinale secties voor 30 min met 200 µL van vers gemaakte 2 door N zoutzuur (HCl) in 1 x PBS in een 37 ° C incubator. Opmerking: Voorzichtig wordt getitreerd HCl behandeling is nodig om het optimaliseren van het signaal van de 5mC.</li>
	<li>Omvat altijd biologische replicatieonderzoeken (3-4) terwijl het optimaliseren van 5mC signaal54. Opmerking: We deden antigeen ophalen op 4 tijd punten (15 min, 30 min, 1 h en 2 h) en gevonden 30 min incubatie is optimaal voor 5mC signaal. Langere incubatie met HCl degradeert de structuur van de kernen leidt tot onvermogen om te lokaliseren 5mC signaal naar de celkern.</li>
	<li>Na denaturatie, retinale secties te neutraliseren door toevoeging van 100 µL van 0,1 M Tris-HCl (pH 8.3) op het netvlies secties gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Incubeer de secties in 500 µL van het blokkeren van de oplossing (5% preimmune normale geit serum in 0,1% Triton X-100 in 1 x PBS) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een kamer vochtigheid.</li>
	<li>Na het blokkeren, het toevoegen van anti-5mC; anti-5hmC antilichamen verdund 1:500 oplossing voor de retinale secties te blokkeren.</li>
	<li>Incubeer retinal secties bij 4 ° C in de kamer vochtigheid overnacht.</li>
	<li>De volgende dag wassen, retinale secties 3 keer (10-15 min telkens) met 0,1% PBS-T en vervolgens uit te broeden in het blokkeren van de oplossing met de bijbehorende secundaire antilichamen (geit anti-konijn en geit-antimuis IgG, verdund; 1:1000), met DAPI (4', 6 - diamidino-2-phenylindole) oplossing (1 µg/mL) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur in het blokkeren van de oplossing. Opmerking: Vermijd drogen van secties tijdens alle stadia van de immunodetection.</li>
	<li>Wassen van de dia's drie keer met 1 mL 0,1% PBS-T.</li>
	<li>Na de laatste wash, mount de secties met waterige montage medium onder een dekglaasje aan en verzegel met kleurloze nagellak.</li>
</ol>3. confocal Immunohistochemistry
<ol><li>Oriënteren in de secties om de retinale pigment epitheel kant van de cup van de optiek altijd geconfronteerd met een manier (bijvoorbeeld omhoog) voor consistentie.</li>
	<li>Uitvoeren van Fotolader van immunostained retinale secties op 63 X (vergroting × van een objectief) met 2 X of 3 X zoom.</li>
	<li>Meerdere optische secties van elke geselecteerde afbeelding genereren (z-stapels) in alle 3 kanalen (rood, groen en blauw, RGB) met behulp van 0,35 µm stap. Opmerking: De laatste vergroting van een specimen gevisualiseerd bij 10-20 X (vergroting × van een objectief) zullen 63 X, respectievelijk, in combinatie met een (meestal tweedehands) 10 X oogbeschadigingen en/of lens. Visualiseren van gecomprimeerde optische stapel om te zoeken van het 5mC en 5hmC signaal</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Methylation van DNA en hydroxymethylation zijn dynamische en omkeerbare DNA wijzigingen, welke modulatethe breed scala aan biologische mechanismen in een ontwikkelingsland zo goed zoals in de postmitotic cellen. Hier beschrijven we een reproduceerbare techniek voor het opsporen van 5mC en 5hmC DNA wijzigingen in situ door immunohistochemische techniek (met behulp van anti-5mC en anti-5hmC antilichamen) in bevroren secties paraformaldehyde-vaste muis de vlek, en bieden richtsnoeren voor de verbetering en standaardisatie van de resultaten, met name bij het vergelijken van verschillende verschillende exemplaren. Wij eerder gebruikte deze methode om af te bakenen 5mC veranderingen in muis retina met retina-specifieke doelgerichtheid van Dnmt1, Dnmt3a en Dnmt3b DNA methyltransferase genen, en gemeld de (verwachte) uitputting van 5mC merken in hun netvlies7 .
De kritische stap in 5mC immunohistochemische detectie is optimalisatie van behandeling van histologische secties met HCl: minder dan 15 min voorbehandeling niet naar verwachting reproduceerbare resultaten opleveren, overwegende dat buitensporige behandeling met HCl vernietigt de nucleaire het platform. We vonden de beste resultaat na een incubatieperiode van 30 min met HCl. Het is raadzaam om altijd gebruik maken van vers verdunde HCl en versgemaakte 4% PFA oplossing voor DNA denaturatie- en retinale weefsel fixatie.
Voor het oplossen van de resultaten, is het raadzaam om op te nemen van drie tot vier biologische wordt gerepliceerd terwijl het optimaliseren van 5mC signaal. Terwijl elk individu van set immunohistochemische kleuring kan enigszins verschillende resultaten genereren (meer of minder helder hétérochromatique regio's), die naar verwachting in immunohistochemische methode, de 5mC en de 5hmC nucleaire distributie binnen de individuele set van secties zal naar verwachting worden zeer reproduceerbaar is, voor zo lang als het protocol wordt gevolgd.
Deze techniek heeft ook beperking zoals we consequent variabiliteit in 5mC distributie in de celkernen fotoreceptor binnen dezelfde sectie gezien. We vonden enkele kernen toonde sterke 5mC signaal terwijl aangrenzende celkernen geen 5mC-signaal toonde. Dit is te wijten aan de beperking in ontmaskeren 5mC antigeen door HCl behandeling in bevroren secties.
De betekenis van deze techniek kan 5mC lokalisatie zonder DNase en proteïnase K behandeling leidt tot beter behoud van chromocenters. Deze techniek wordt geacht te werken krachtig op geen secties uit alle gewervelde dierlijke weefsels, dragende 5mC 5hmC merken, en verwerkt met een soortgelijke aanpak, niet alleen muis netvlies, voor zolang het protocol wordt gevolgd.

Epigenetische regulatie van de ontwikkeling en postmitotic homeostase van muis netvlies is een spannende gebied van onderzoek, waarin beloftes om een nieuwe inzicht in biologische mechanismen beheersen van retinogenesis en cel lot bepaling, cell type-specifieke metabole functie, alsmede cel pathologieën, celdood en regeneratie1,2,3,4,5,6,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. chromatine ondergaat dynamische veranderingen in de ontwikkeling, evenals in reactie op variabele externe signalen of het benadrukken, metabole of cel dood stimuli6,14,15, 16 , 17 , 18. in muis kernen, chromatine is onderverdeeld in actieve euchromatine en inactieve heterochromatin6,19,20. In interfase kern, euchromatine bevindt zich in de binnenste regio van de kern overwegende dat heterochromatin de nucleaire perifirie en nucleolus lijnen. Dit patroon heet conventionele en is zeer geconserveerd in eukaryoten. In tegenstelling, hebben rod kernen in nachtdieren zoals muis en rat omgekeerde patroon waar de kern wordt ingenomen door de heterochromatin in het centrum omringd door euchromatine vormen de ultraperifere shell6,18, 20. Bij de geboorte hebben rod kernen conventionele nucleaire architectuur. Inversie van rod kernen optreedt tijdens de ontwikkeling door de verbouwing van het conventionele nucleaire platform. Tijdens dit proces, perifere heterochromatin scheidt van de nucleaire perifirie en chromocenters smelten samen tot vorm een enkele chromocenter in het centrum van de kern6,18.
Genomic DNA methylering neemt deel aan de beheersing van lokale chromatine conformatie21. Methylation van DNA optreedt bij de positie 5' van cytosine residuen van apr-dinucleotides die zijn verrijkt in de regio van de promotor van veel genen in muis genoom22,23,24,25,26 evenals in intergenic en intron regio's, waaraan de regelgevende elementen27. Methylation van CpG eilanden in proximale initiatiefnemers21,24 en CpG-sequenties in gen versterkers27,28 is belangrijk bij het reguleren van de dynamische toestand van bivalente chromatine, met veel Developmental genen/transcriptie factoren spelen belangrijke rol in de ontwikkeling, kanker en veroudering29,30,31,32,33,34 . Methylation van DNA tijdens muis ontwikkeling35deelnemen aan drie DNA methyltransferases (DNMTs). Alle drie DNMTs worden uitgedrukt tijdens muis retinale ontwikkeling36 en netvlies-specifieke veranderingen in Dnmt genen effect retinale ontwikkeling2,7. Hydroxymethylcytosine (5hmC) is de oxidatieve product van 5-methylcytosine (5mC) demethylatie. De drie tien-elf translocatie (TET) enzymen deelnemen aan 5mC demethylatie37,38,39. Hydroxymethyl-C wijziging is verrijkt met initiatiefnemers, gene organen en intergenic genomic opeenvolgingen binnen gene rijk en actief getranscribeerde regio's27,40.
Er is een verscheidenheid van beschreven methoden voor het bepalen van de veranderende patronen van de methylation van DNA in cellen41,42,43,44,45,46, sommige van hen schakelen kwantificeren van mondiale veranderingen van methylation van DNA terwijl anderen zich te concentreren op de precieze veranderingen in CpG-rijke regio's binnen de initiatiefnemers en versterkers. Methoden voor de opsporing en kwantificering van 5hmC werden ook gemeld47, met inbegrip van immunohistochemistry13. Immunohistochemische technieken, waarmee sprake is van een robuuste monitoring van 5mC en 5hmC veranderingen in de kernen van de ontwikkeling en postmitotic cellen, zijn zeer informatief voor uitgezet chromatine dynamiek in situ in reactie op externe of interne veranderingen invloed op de cellen4,13,48,49. Deze aanpak is echter gevoelig voor onderschatting van methylation van DNA en hydroxymethylation veranderingen als gevolg van technische problemen, opsporen van cytosine wijzigingen in histologische preparaten is gekoppeld. Dit is omdat de apolaire DNA bases, waaronder 5mC en 5hmC gemodificeerde cytosine, zijn verborgen in het midden van de double-stranded DNA helix50, en vereisen ontmaskering. Dit is vooral een uitdaging in bevroren histologische preparaten die snel informatieve organisatie van het oorspronkelijke weefsel verliezen kunnen wanneer harde behandeling wordt toegepast.
Het netvlies muis is een uitstekend model te ontleden de bijdrage van methylation van DNA tot neurale ontwikkeling en postmitotic homeostase. Er zijn slechts 6 soorten neuronen (rod en kegel researchdieren, amacrine, bipolaire, horizontale en ganglion cellen), één gliale celtype (Muller glia) en één neuroepithelial cell type (retinale pigment epitheel)51. Netvlies celtypes werden gemeld te hebben verschillende patronen van DNA methylering18,19, die onlangs is onderzocht op single-base resolutie1,5,9,12. Onlangs meldden we immunohistochemistry toepassing uitgezet 5mC patroon van spreiding in de kernen van netvlies cellen en veranderingen in de kernen van volwassen muis netvlies, waar alle drie DNA methyltransferases zijn verwijderd door het voorwaardelijke targeting 7. ten opzichte van een aantal verslagen, waar de aanwezigheid van methylation van DNA in netvlies cellen kan worden gezien alleen als een positief of negatief signaal in de hypermethylated cellen ondergaan apoptosis, onze aanpak ingeschakeld detecting specifieke chromatine regeling binnen de retinale celkernen, die we verscheidene groepen gerapporteerd en besproken eerder5,6,7,18,19,36 , 52. hier, beschrijven we de immunohistochemische (IHC) techniek voor het opsporen van 5mC en 5hmC in bevroren paraformaldehyde-vaste histologische secties in details evenals tonen de gegevens, die we konden reproduceren van onze oorspronkelijke verslag7 .

<table><tbody><tr><td>Benodigdheden</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>29G1/2 ULTRA-FINE</td><td>BD Biosciences</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Ophtalmisch schaar</td><td>Fine Science tools, Inc.&nbsp;</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>RPICORP.com</td><td>195505</td><td></td></tr><tr><td>Microslide Superfrost plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Reagens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscope Science</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Optical cutting compound (OCT)</td><td>VWR</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>6 N HCl</td><td>VWR analytical&nbsp;</td><td>BDH7204-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl pH 8.3</td><td>Teknova</td><td>T1083</td><td></td></tr><tr><td>Geitenserum</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>5mC</td><td>Genway Biotech&nbsp;</td><td>GWB-BD5190</td><td></td></tr><tr><td>5hmC</td><td>Active Motif</td><td>39791</td><td></td></tr><tr><td>LaminB1</td><td>Abcam</td><td>Ab16048</td><td></td></tr><tr><td>Cy2 AffiniPure Geiten Anti-Konijn IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-225-1444</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Geiten Anti-Muis IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-585-166</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICRM HM 550</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>388114</td><td></td></tr><tr><td>Confocale microscoop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

immunohistochemische detectie van 5-methylcytosine en 5-hydroxymethylcytosine bij de ontwikkeling en postmitotic muis retina

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

De epigenetica van retinale ontwikkeling is een goed bestudeerde onderzoeksterrein, die belooft te brengen van een nieuw niveau van inzicht in de mechanismen van een scala van menselijke netvlies degeneratieve ziekten en lokaliseren van nieuwe benaderingen van de behandeling. De nucleaire architectuur van muis netvlies is georganiseerd in twee verschillende patronen: conventionele en omgekeerd. Conventionele patroon is universeel, waar heterochromatin is gelokaliseerd aan de rand van de kern, terwijl actieve euchromatine in de nucleaire interieur woont. In tegenstelling, is omgekeerde nucleaire patroon uniek voor de volwassen staaf fotoreceptor celkernen waar heterochromatin lokaliseert aan de nucleaire centrum en euchromatine bevindt zich in de nucleaire perifirie. Methylation van DNA wordt voornamelijk waargenomen in chromocenters. Methylation van DNA is een dynamische covalente modificatie op de cytosine residuen (5-methylcytosine, 5mC) van apr-dinucleotides die zijn verrijkt in de gebieden van de promotor van vele genen. Methylation van DNA tijdens ontwikkeling deelnemen aan drie DNA-methyltransferases (DNMT1, DNMT3A en DNMT3B). Detecting 5mC met immunohistochemische technieken is zeer uitdagend, bij te dragen tot variabiliteit in resultaten, alle DNA-basen, met inbegrip van 5mC bewerkt basissen zijn verborgen in de double-stranded DNA-helix. Gedetailleerde afbakening van 5mC distributie tijdens de ontwikkeling is echter zeer informatief. Hier beschrijven we een reproduceerbare techniek voor robuuste immunohistochemische detectie van 5mC en een andere epigenetische DNA marker 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), die colocalizes met de "open", transcriptionally actieve chromatine in het ontwikkelen en postmitotic muis netvlies.

Om te bepalen van de verdeling van de 5-methylcytosine (5mC) en 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) tijdens de ontwikkeling van de retina en in postmitotic netvlies, wij immunostained C57BL/6J muis retinale sectie van E16, P0, P15 en P90 met antilichamen specifiek om te 5mC en 5hmC.
Bij E16 was de kleuring van de 5mC sterk in chromocenters van de celkernen terwijl zwakke kleuring werd waargenomen in de hele celkernen (Figuur 1a). De kleuring van de 5hmC werd beperkt tot de celkernen en afwezig was van de chromocenters (Figuur 1b).
In P0 netvlies, was het 5mC signaal gelokaliseerd op de chromocenters van de celkernen en nucleaire perifirie (Figuur 2a, pijl en pijlpunt). Wij merkte tevens zwakke kleuring van 5mC tussen de chromocenters van de celkernen. Het signaal van de 5hmC was sterk aanwezig in de celkernen met uitzondering van de chromocenters (Figuur 2b). We vonden dat meer kernen zijn gekleurd met 5mC en 5hmC in innerlijke neuroblast laag (INBL) (Figuur 2 c, stippellijn)
In P15 netvlies vonden we sterke verkleuring van de 5mC en 5hmC in nucleaire buitenlaag (ONL), nucleaire binnenlaag (l) en ganglion cellaag (GCL) (Figuur 3). In ONL (rod researchdieren) was het 5mC signaal aanwezig in de chromocenters van de celkernen en nucleaire perifirie (cijfers 3a-3 c, 3 g). Het 5hmC signaal werd gevonden in de hele celkernen met uitzondering van de chromocenters (cijfers 3d-3f). De transmissie-elektronenmicroscopie gedaan op P15 netvlies toont de verdeling van hétérochromatique domeinen in staaf celkernen vergelijkbaar met die gevonden met 5mC antilichaam signaal (figuren 3 h en 3i).
De kleuring van de 5mC in l en GCL was sterk in de chromocenters van de celkernen en zwakke kleuring werd ook waargenomen in hele celkernen (cijfers 3j-3 l en 3r-3t). In tegenstelling tot 5mC, was het 5hmC signaal gelokaliseerd op de hele celkernen met uitzondering van de chromocenters in l en GCL (cijfers 3 m-3o en 3u-3w). We waargenomen sterke 5hmC signaal aan de periferie van GCL celkernen.
In volwassen rod researchdieren was het 5mC signaal beperkt tot de chromocenter en de nucleaire perifirie van de celkernen (cijfers 4a-4 c) terwijl 5hmc signaal was beperkt tot de nucleaire perifirie (figuren 4 d-4f).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig1.jpg"> Figuur 1. Lokalisatie van 5-methylcytosine en 5-hydroxymethylcytosine in het netvlies van de muis ten embryonale dage 16. Immunokleuring van C57BL/6J netvlies met antilichamen tegen 5mC (rood, a) en 5hmC (groen, b). E16 is 5mC signaal zeer sterk in de chromocenters van de celkernen en ook aanwezig in de hele celkernen op veel lager niveau. 5hmC kleuring was uitsluitend beperkt tot de celkernen. Deelvenster c vertegenwoordigt samengevoegde 5mC en 5hmC afbeelding. Kernen zijn counterstained met de DAPI (blauw, c). Inzetstukken vertegenwoordigen vergroting van de ruimte die zijn genoemd met sterretje in de beelden. Schaal bar: 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig2.jpg"> Figuur 2. Immunohistochemische kleuring van 5-methylcytosine en 5-hydroxymethylcytosine in muis netvlies op postnatale dag 0. Immunolabeling van C57BL/6J netvlies met antilichamen tegen 5mC (rood, a) en 5hmC (groen, b). In P0 netvlies zijn 5mC en 5hmC aanwezig in zowel de buitenste neuroblast laag (ONBL) en de innerlijke neuroblast laag (INBL). a) 5mC signaal is sterk aanwezig in de chromocenters (pijl) en de nucleaire perifirie van de celkernen (pijlpunt). Zwakke kleuring van 5mC is ook waargenomen tussen de chromocenters van celkernen. b) 5hmC kleuring is beperkt tot de celkern en sterk signaal wordt waargenomen in INBL (stippellijn in deelvenster c). Deelvenster c vertegenwoordigt samengevoegde 5mC en 5hmC afbeelding. Kernen zijn counterstained met de DAPI (blauw, c). Inzetstukken vertegenwoordigen vergroting van de ruimte die zijn genoemd met sterretje in de beelden. Schaal bar: 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig3.jpg"> Figuur 3. 5-methylcytosine en 5-hydroxymethylcytosine distributie in muis netvlies op postnatale dag 15. Immunokleuring van C57BL/6J netvlies met anti-5mC en 5hmC antilichamen (a-g, j-y). In nucleaire buitenlaag (ONL) (rod researchdieren), 5mC signaal (rood, a) meestal samenvalt met de chromocenters van de celkernen (pijlpunt, b) en ook lokaliseert aan de nucleaire perifirie (pijl, b). Deelvenster b (rood) en c (grijs) vertegenwoordigen vergroting van de ruimte die zijn genoemd met sterretje in de afbeelding een. Het 5hmC signaal (groen, d) is beperkt tot de hele celkernen met uitzondering van de chromocenters. Paneel e (groen) en f (grijs) vertegenwoordigen vergroting van de ruimte die zijn genoemd met sterretje in de afbeelding d. Panel g samengevoegde 5mC en 5hmC afbeelding vertegenwoordigt. Kernen zijn counterstained met DAPI. Deelvenster h en ik zijn transmissie elektronenmicroscoop beeld van fotoreceptor kernen op postnatale dag 15 weergegeven: verdeling van de hétérochromatique domeinen. Zwarte pijlpunt in deelvenster h verwijst naar één staaf fotoreceptor nucleus in deelvenster i. uitgebreid met rode pijlpunten in deelvenster die ik wijs hétérochromatique domeinen binnen staaf fotoreceptor nucleus terwijl rode pijlen naar heterochromatin in de nucleaire perifirie wijzen. In l (j-q) en GCL celkernen (r-y), het 5mC signaal (rood) is gelokaliseerd op de chromocenters aanwezig in de periferie en ook in de rest van de celkernen zwakke kleuring wordt ontdekt. Deelvenster k (rood) en ik (grijs) vertegenwoordigen vergroting van de ruimte die zijn genoemd met sterretje in de afbeelding j. De 5hmC kleuring (groen) in l en GCL celkernen is beperkt tot de hele celkern. Opmerking sterke 5hmC vlekken in de nucleaire perifirie van GCL cellen. Deelvenster p en x vertegenwoordigen samengevoegde 5mC en 5hmC beeld terwijl deelvenster q en y vergroting van de ruimte die zijn genoemd met sterretje in de afbeelding p en x respectievelijk vertegenwoordigen. Kernen zijn counterstained met DAPI. Schaal bar: 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig4.jpg"> Figuur 4. 5-methylcytosine en 5-hydroxymethylcytosine distributie in staaf fotoreceptor kernen van C57BL/6J muis netvlies op postnatale dag 90. De kleuring van de 5mC (rood, een) is sterk aanwezig in de chromocenter van de celkernen en ook zwak heden in de nucleaire perifirie. Deelvenster b (rood) en c (grijs) vertegenwoordigen vergroting van de ruimte die zijn genoemd met sterretje in de afbeelding een. De 5hmC kleuring (groen, d) is uitsluitend beperkt tot de nucleaire perifirie paneel e (groen) en f (grijs) vertegenwoordigen vergroting van de ruimte die zijn genoemd met sterretje in de afbeelding d. Panel g samengevoegde 5mC en 5hmC beeld terwijl deelvenster h vertegenwoordigt is vergroting van de ruimte die zijn genoemd met sterretje in de afbeelding die g. kernen zijn counterstained met de DAPI (blauw). Schaal bar: 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Het doel van dit verslag is om te beschrijven van het protocol voor robuuste immunohistochemische detectie van epigenetische markers, 5-methylcytosine (5mC) en 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) bij de ontwikkeling en postmitotic muis netvlies.

Immunohistochemische detectie van 5-Methylcytosine en 5-Hydroxymethylcytosine bij de ontwikkeling en Postmitotic muis Retina

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van DNA-methylatie, zoals veranderingen in chromatine tijdens de ontwikkeling van de retina in postmitotische retina. Het grote voordeel van deze techniek is dat deze robuust kan worden toegepast op alle secties van alle muisretinaweefsels die 5-methylcytosine, 5-hydroxymethylcytosine-verdeling dragen en die op een vergelijkbare manier zijn verwerkt. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de stappen voor het voorbereiden en kleuren van het weefsel moeilijk te leren zijn, want als er gebruik wordt gemaakt van bevroren histologische preparaten, kan waardevol organisatorisch en origineel weefsel verloren gaan.De rest van de procedure zal worden gedemonstreerd door Pablo Diaz, onderzoeksmedewerker van ons laboratorium. Om deze procedure te starten, gebruik een 29 gauge halve inch naald om de ogen van een onthoofde, geëuthanasieerde muis aan de dorsale kant van de ogen te doorboren. Om oogbekers te verkrijgen, enucleeërt u de ogen onmiddellijk door rond de sclera te snijden met fijne oogheelkundige scharen om de hoornvlies en de lens te verwijderen.Fixeer de oogbekers en E16 hele ogen in 4% paraformaldehyde of PFA in 1xPBS pH 8,0 gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Was ze twee keer in een milliliter 1xPBS bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Om de oogbekers en hele ogen te cryobeschermen, incubeer ze in 1xPBS pH 8,0 met 10% sucrose bij kamertemperatuur gedurende een uur.Vervolgens in 20% sucrose in 1xPBS gedurende een uur. En ten slotte in 30% sucrose in 1xPBS bij 4 graden Celsius overnacht. Op de volgende dag bedden de oogbekers en ogen in een optimaal snijtemperatuurcompound, of OCT, in cryovormpjes.Vries ze vervolgens snel in een droogijs-ethanolbad en bewaar ze bij 80 graden Celsius. Voordat u begint met cryosectie, verwijdert u de vormpjes met ingebedde oogbekers en ogen uit 80 graden Celsius. Plaats ze in een cryostathouder en laat ze gedurende een uur gelijkwaardig zijn aan 20 graden Celsius.Gebruik een cryostat bij 20 graden Celsius om 12 micrometer dikke retinale dwarssecties te snijden die parallel zijn aan de temporonasal as door de kop van de nervus opticus. Monteer de secties op microscoopglazen en bewaar ze bij 80 graden Celsius. Om immunokleuring te starten, gebruik een hydrofobe barrièrepen om de retinale secties die op glijmiddelen zijn gemonteerd, te omcirkelen.Was de secties eenmaal met 200 microliter 1xPBS gedurende 10 minuten. Maak de secties permeabel met 200 microliter PBST gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Denatureer ze vervolgens met 200 microliter vers bereide zorgvuldig getitreerde 2 Normale zoutzuur in 1xPBS gedurende 45 minuten bij 37 graden Celsius om het 5mC-signaal te optimaliseren.Na denaturatie, voeg 100 microliter 0,1 Tris-HCl pH 8,3 toe aan de retinale secties, en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om ze te neutraliseren. Voeg vervolgens 500 microliter blokkeeroplossing toe. En incubeer de secties in een vochtigheidskamer bij kamertemperatuur gedurende een uur.Voeg de geschikte antilichamen toe, verdund tot 1 op 500 in blokkeeroplossing, toe aan de secties en incubeer ze overnacht bij vier graden Celsius. Op de volgende dag was de secties drie keer gedurende 10 tot 15 minuten met 0,1% PBST. Voeg geschikte secundaire antilichamen toe die zijn verdund tot 1 op 1000 in blokkeeroplossing met DAPI-oplossing bij kamertemperatuur gedurende een uur.Was vervolgens de glijmiddelen drie keer met een milliliter 0,1% PBST gedurende 10 minuten. Na de laatste wasbeurt, voegt u waterig montagemedium toe. Bedek met een dekglas.En ga vervolgens verder met confocale microscopie. Na retinale immunokleuring bij E16, was het 5mC-signaal sterk in de chromocentra van de celkernen en aanwezig op een veel lagere niveau in de hele celkernen. 5hmC-kleuring werd uitsluitend gevonden in de celkernen en ontbrak in de chromocentra.In P0-retina waren zowel 5mC- als 5hmC-signalen aanwezig in de buitenste neuroblastenlaag en de binnenste neuroblastenlaag. 5mC-signaal was sterk in de chromocentra en nucleaire periferie van de celkernen, en zwakker tussen de chromocentra van de celkernen. 5hmC-kleuring was beperkt tot de celkern.In P15-retina, in de buitenste nucleaire laag, werd 5mC-signaal gedetecteerd in de chromocentra van de celkernen en nucleaire periferie. Terwijl 5hmC-signaal in de hele celkernen was, behalve in de chromocentra. In de binnenste nucleaire en ganglioncel-laag was 5mC-signaal sterk in de chromocentra van de celkernen en zwak in hele celkernen.Terwijl het 5hmC-signaal werd gevonden in de hele celkernen, behalve in de chromocentra. In volwassen staaffotoreceptoren was het 5mC-signaal beperkt tot de chromocentra en nucleaire periferie, terwijl het 5hmC-signaal beperkt was tot de nucleaire periferie. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om histologische secties te behandelen met de optimale blootstelling aan HCl, namelijk 30 minuten.Als de blootstelling minder of meer is, kunnen optimale resultaten niet reproduceerbaar zijn. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals hoogdrukkaschromatografie, massaspectrometrie worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals kwantificering van veranderingen bij het meten van 5-methylcytosine en 5-hydroxymethylcytosine. Na de ontwikkeling ervan, heeft deze techniek de weg geëffend voor onderzoekers op het gebied van neurale ontwikkeling om epigenetische veranderingen in chromatine te onderzoeken.Vergeet niet dat het werken met HCl en PFA uiterst gevaarlijk kan zijn, en voorzorgsmaatregelen, zoals correcte verwijdering, moeten altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

immunohistochemical-detection-5-methylcytosine-5

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

De EpiMark 5-HMC en 5-mC Analysis Kit kan gebruikt worden om te analyseren en te kwantificeren 5-methylcytosine en 5-hydroxymethylcytosine binnen een spe cifieke locus. De kit onderscheidt vijf-mC van 5-HMC door de toevoeging van glucose aan de hydroxylgroep van 5-HMC via een enzymatische reactie gebruik te maken van β-glucosyltransferase (T4-BGT). Bij het 5-HMC vindt plaats in het kader van CCGG, deze wijziging zet een splitsbare MspI site om een ​​niet-splitsbare site.

Hoge gevoeligheid 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb / C hersenweefsel

Beschreven is een twee stappen proces labeling met β-glucosyltransferase (β-GT) een azide-glucose dragen aan 5-HMC, gevolgd door een klik chemie biotine linker gemakkelijk en dichtheid onafhankelijk verrijking brengen. Deze efficiënte en specifieke etiketteringsvoorschriften methode maakt het mogelijk verrijking van 5-HMC met extreem lage achtergrond en high-throughput epigenomisch mapping vinden plaats via next-generation sequencing.

Selectieve vangen van 5-hydroxymethylcytosine van genomisch DNA

This video describes the technique of dot-blot to determine the level of DNA methylation in human chondrocytes in vitro via the blotting of DNA samples on a nylon membrane and the subsequent visualization using monoclonal antibodies. This helps to determine the chondrocytes' phenotype at various stages in culture.

5-Methylcytosine Dot Blot to Determine the Extent of DNA Methylation

De neonatale muizen netvlies biedt een goed gekarakteriseerd fysiologisch model van angiogenese, die onderzoeken van de rol van de verschillende genen of medicijnen die angiogenese moduleren in een...

Hele Mount immunofluorescentiekleuring van de Neonatale Mouse Retina naar Angiogenese Onderzoek<em&gt; In vivo</em

Progenitorceltransplanten mitose is een kritische parameter van neurogenese. Veel van onze kennis van neurale voorlopercellen mitose is gebaseerd op de analyse van vaste weefsel. Live-beeldvorming in de embryonale hersenen plakjes is een veelzijdige techniek om mitose te beoordelen met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie in een gecontroleerde omgeving.

Live-Imaging van mitose in het ontwikkelen van muis embryonale Cortex

Bisulfiet amplicon sequentiebepaling (BSAS) is een methode voor het kwantificeren van cytosinemethylatie in gerichte genomische regio's van belang. Deze methode maakt gebruik van bisulfietconversie in combinatie met PCR-amplificatie van doelregio's vóór next-generation sequencing om absolute kwantificering van DNA-methylatie op een basisspecifiek niveau te produceren.

Gerichte DNA methylatie analyse van next-generation sequencing

Hier beschrijven we een gevoelige immunochemische methode voor het in kaart brengen van de ruimtelijke verdeling van 5mC-oxidatiederivaten op basis van het gebruik van peroxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen en tyramide-signaalversterking.

Detectie van gemodificeerde vormen van cytosine behulp Sensitive Immunohistochemie

Onlangs ontdekte geoxideerde vormen van 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) en 5-carboxylcytosine (5caC) kan verschillende DNA wijzigingen met unieke functionele rollen. Hier wordt een semi-kwantitatieve workflow voor visualisatie van oxi-mCs ruimtelijke verdeling, signaal intensiteit profilering en colocalization omschreven.

Immunokleuring voor DNA wijzigingen: computationele analyse van Confocal beelden

Hier presenteren we een protocol voor het opsporen van 5-hydroxymethylcytosine in cellen en hersenweefsels, met behulp van immunofluorescentie kleuring en DNA dot-Blot-methoden.

De detectie van 5-Hydroxymethylcytosine in neurale stamcellen en hersenen van muizen

Dit artikel beschrijft een protocol voor de snelle en efficiënte spatiotemporale monitoring van normale en afwijkende cytosinemethylatie in intacte zebravisembryo's.

Snelle en efficiënte spatiotemporale monitoring van normale en afwijkende cytosinemethylatie binnen intacte zebravisembryo's

Er wordt een protocol beschreven voor het voorbereiden van retinale cryosecties van muizen en het uitvoeren van immunokleuring op fotoreceptoren. Dit artikel stelt onderzoekers in staat om consequent bevroren secties van het netvlies van muizen te produceren met goed bewaarde morfologie en hoogwaardige immunokleuringsresultaten.

Cryosectie en immunokleuring van het netvlies van de muis

Leer immunohistochemische detectie van 5mC en 5hmC in muizenretina tijdens ontwikkeling en postmitose. Deze methode maakt gedetailleerd onderzoek naar epigenetische veranderingen en chromatindynamica mogelijk.

Immunohistochemische detectie van 5-Methylcytosine en 5-Hydroxymethylcytosine bij de ontwikkeling en Postmitotic muis Retina

Meer video's verkennen