Name: Efficiënt en schaalbare gestuurde differentiatie van klinisch hoornvlies Limbal epitheliale cellen van de stam van menselijke pluripotente stamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Leer een gedefinieerde feeder-vrije methode voor de differentiatie van klinische hoornvlies limbus epitheliale stamcellen uit menselijke pluripotente stamcellen. Deze techniek ondersteunt regeneratieve therapieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De studie werd ondersteund door de Academie van Finland (subsidie nummer 297886), het programma van de menselijke reserveonderdelen van Tekes, het Fins financiering agentschap voor technologie en innovatie, het Finse oog en weefsel Bank Foundation en de Finse Cultural Foundation. De auteurs bedanken het biomedische laboratorium technici Outi Melin, Hanna Pekkanen, Emma Vikstedt en Outi Heikkilä voor uitstekende technische bijstand en de bijdrage aan de celcultuur. Professor Katriina Aalto-Setälä is erkend voor het verstrekken van de gebruikte hiPSC-lijn en de BioMediTech Imaging Core faciliteit voor het verstrekken van uitrusting voor fluorescentie imaging.

<ol><li>Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+epithelial+crypts%3A+a+novel+anatomical+structure+and+a+putative+limbal+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche.</a> The British Journal of Ophthalmology. 89 (5), 529-532 (2005).</li>
<li>Yazdanpanah, G., Jabbehdari, S., Djalilian, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+and+corneal+epithelial+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Limbal and corneal epithelial homeostasis.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 348-354 (2017).</li>
<li>Di Iorio, E., Barbaro, V., Ruzza, A., Ponzin, D., Pellegrini, G., De Luca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoforms+of+DeltaNp63+and+the+migration+of+ocular+limbal+cells+in+human+corneal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isoforms of DeltaNp63 and the migration of ocular limbal cells in human corneal regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9523-9528 (2005).</li>
<li>Rama, P., Matuska, S., Paganoni, G., Spinelli, A., De Luca, M., Pellegrini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+stem-cell+therapy+and+long-term+corneal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).</li>
<li>Notara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+sickness+and+in+health%3A+Corneal+epithelial+stem+cell+biology%2C+pathology+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">In sickness and in health: Corneal epithelial stem cell biology, pathology and therapy.</a> Experimental Eye Research. 90 (2), 188-195 (2010).</li>
<li>Osei-Bempong, C., Figueiredo, F. C., Lako, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+limbal+epithelium+of+the+eye--a+review+of+limbal+stem+cell+biology%2C+disease+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%3A+News+and+Reviews+in+Molecular%2C+Cellular+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The limbal epithelium of the eye--a review of limbal stem cell biology, disease and treatment.</a> BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 35 (3), 211-219 (2013).</li>
<li>Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+clinical+implementation+of+corneal+epithelial+stem+cell+therapy+for+treatment+of+unilateral+limbal+stem+cell+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency.</a> Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).</li>
<li>Sangwan, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+outcomes+of+xeno-free+autologous+cultivated+limbal+epithelial+transplantation%3A+a+10-year+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Clinical outcomes of xeno-free autologous cultivated limbal epithelial transplantation: a 10-year study.</a> The British Journal of Ophthalmology. 95 (11), 1525-1529 (2011).</li>
<li>Basu, S., Mohan, S., Bhalekar, S., Singh, V., Sangwan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+limbal+epithelial+transplantation+%28SLET%29+in+failed+cultivated+limbal+epithelial+transplantation+%28CLET%29+for+unilateral+chronic+ocular+burns%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Simple limbal epithelial transplantation (SLET) in failed cultivated limbal epithelial transplantation (CLET) for unilateral chronic ocular burns.</a> The British Journal of Ophthalmology. , (2018).</li>
<li>Ahmad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+corneal+epithelial-like+cells+by+in+vitro+replication+of+the+corneal+epithelial+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial-like cells by in vitro replication of the corneal epithelial stem cell niche.</a> Stem Cells. 25 (5), 1145-1155 (2007).</li>
<li>Hanson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+human+embryonic+stem+cells+onto+a+partially+wounded+human+cornea+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Transplantation of human embryonic stem cells onto a partially wounded human cornea in vitro.</a> Acta Ophthalmologica. 91 (2), 127-130 (2013).</li>
<li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+corneal+epithelial+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells+derived+from+human+dermal+fibroblast+and+corneal+limbal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Generation of corneal epithelial cells from induced pluripotent stem cells derived from human dermal fibroblast and corneal limbal epithelium.</a> PLoS ONE. 7 (9), e45435(2012).</li>
<li>Hewitt, K. J., Shamis, Y., Carlson, M. W., Aberdam, E., Aberdam, D., Garlick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+epithelial+tissues+generated+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional epithelial tissues generated from human embryonic stem cells.</a> Tissue Engineering. Part A. 15 (11), 3417-3426 (2009).</li>
<li>Shalom-Feuerstein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cell+model+reveals+essential+roles+for+miR-450b-5p+and+miR-184+in+embryonic+corneal+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cell model reveals essential roles for miR-450b-5p and miR-184 in embryonic corneal lineage specification.</a> Stem Cells. 30 (5), 898-909 (2012).</li>
<li>Cieslar-Pobuda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+transdifferentiation+into+corneal+epithelial-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cell differentiation and direct transdifferentiation into corneal epithelial-like cells.</a> Oncotarget. 7 (27), 42314-42329 (2016).</li>
<li>Ludwig, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+in+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions.</a> Nature Biotechnology. 24 (2), 185-187 (2006).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li>
<li>Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+culturing+and+cloning+of+human+pluripotent+stem+cells+on+laminin-521-based+matrices+under+xeno-free+and+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions.</a> Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).</li>
<li>Mikhailova, A., Ilmarinen, T., Uusitalo, H., Skottman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+induction+promotes+corneal+epithelial+cell+differentiation+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Small-molecule induction promotes corneal epithelial cell differentiation from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 2 (2), 219-231 (2014).</li>
<li>Martinez Garcia de la Torre, R. A., Nieto-Nicolau, N., Morales-Pastor, A., Casaroli-Marano, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+Culture+Time+Point+to+Induce+Corneal+Epithelial+Differentiation+in+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Determination of the Culture Time Point to Induce Corneal Epithelial Differentiation in Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Transplantation Proceedings. 49 (10), 2292-2295 (2017).</li>
<li>Zhang, C., Du, L., Pang, K., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+corneal+epithelial+progenitor+cells+under+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial progenitor cells under defined conditions.</a> PLoS One. 12 (8), e0183303(2017).</li>
<li>Aberdam, E., Petit, I., Sangari, L., Aberdam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell-derived+limbal+epithelial+cells+%28LiPSC%29+as+a+cellular+alternative+for+in+vitro+ocular+toxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell-derived limbal epithelial cells (LiPSC) as a cellular alternative for in vitro ocular toxicity testing.</a> PLoS One. 12 (6), e0179913(2017).</li>
<li>Kamarudin, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+Activity+of+Endogenous+Bone+Morphogenetic+Protein+Signaling+Impact+on+the+Ability+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+to+Differentiate+to+Corneal+Epithelial-Like+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differences in the Activity of Endogenous Bone Morphogenetic Protein Signaling Impact on the Ability of Induced Pluripotent Stem Cells to Differentiate to Corneal Epithelial-Like Cells.</a> Stem Cells. 36 (3), 337-348 (2018).</li>
<li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+culturing+of+human+embryonic+stem+cells+on+laminin-521%2FE-cadherin+matrix+in+defined+and+xeno-free+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment.</a> Nature Communications. 5, 3195(2014).</li>
<li>Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xeno-+and+feeder-free+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+two+distinct+ocular+epithelial+cell+types+using+simple+modifications+of+one+method%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method.</a> Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 4(2017).</li>
<li>Skottman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+characterization+of+three+new+human+embryonic+stem+cell+lines+in+Finland%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology.+Animal%22%5BJournal%5D)">Derivation and characterization of three new human embryonic stem cell lines in Finland.</a> In vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 46 (3-4), 206-209 (2010).</li>
<li>Ahola, A., Kiviaho, A. L., Larsson, K., Honkanen, M., Aalto-Setälä, K., Hyttinen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video+image-based+analysis+of+single+human+induced+pluripotent+stem+cell+derived+cardiomyocyte+beating+dynamics+using+digital+image+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">Video image-based analysis of single human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocyte beating dynamics using digital image correlation.</a> Biomedical Engineering Online. 13, 39(2014).</li>
<li>Ojala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation-Specific+Phenotypes+in+hiPSC-Derived+Cardiomyocytes+Carrying+Either+Myosin-Binding+Protein+C+Or+%CE%B1-Tropomyosin+Mutation+for+Hypertrophic+Cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Mutation-Specific Phenotypes in hiPSC-Derived Cardiomyocytes Carrying Either Myosin-Binding Protein C Or α-Tropomyosin Mutation for Hypertrophic Cardiomyopathy.</a> Stem Cells International. 2016, 1684792(2016).</li>
<li>Ali, R. R., Sowden, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+medicine%3A+DIY+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regenerative medicine: DIY eye.</a> Nature. 472 (7341), 42-43 (2011).</li>
<li>International Stem Cell Initiative,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+ethnically+diverse+human+embryonic+stem+cells+identifies+a+chromosome+20+minimal+amplicon+conferring+growth+advantage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage.</a> Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).</li>
<li>Foster, J. W., Wahlin, K., Adams, S. M., Birk, D. E., Zack, D. J., Chakravarti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cornea+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cornea organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Scientific Reports. 7, 41286(2017).</li>
<li>Susaimanickam, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+minicorneal+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het verwachte resultaat van dit protocol is de generatie van het succesvolle en robuuste van LESCs uit een enkele celsuspensie van FF hPSC binnen ongeveer 3,5 weken. Zoals hoornvlies epitheel oppervlakte ectoderm €29 ontwikkelt, wordt de eerste stap van het protocol bedoeld om sturing van hPSCs naar deze bloedlijn. Een korte 24u inductie met transformeren groeifactor bèta (TGF-β) antagonist SB-505124, en bFGF worden gebruikt voor het opwekken van ectodermale differentiatie, gevolgd door 48 h mesod...

Het transparante hoornvlies aan de oculaire oppervlakte kunt licht in te voeren van het netvlies en biedt de meeste refractieve vermogen van het oog. De buitenste laag, de gestratificeerde hoornvlies epitheel, wordt voortdurend geregenereerd door limbal epitheliale cellen van de stam (LESCs). De LESCs bevinden zich in de basale laag van de limbal nissen in het corneoscleral junction1,2. LESCs geen specifieke en unieke markers, zodat hun identificatie een meer uitgebreide analyse van een aantal vermeende markeringen vereist. Epitheliale transcriptie factor p63, en met name N-terminaal afgeknotte transcript van de alpha isovorm van p63 (ΔNp63α), is voorgesteld als een relevante positieve LESC markeerdraad3,4. Asymmetrische verdeling van LESCs kan ze zelf vernieuwen, maar ook de productie van nakomelingen die centripetaal en anteriorly worden gemigreerd. Als de cellen vooruitgang richting het hoornvlies oppervlak ze geleidelijk verliezen hun stemness en ten slotte terminaal onderscheid maken naar oppervlakkige squamous cellen die voortdurend verloren gaan van het hoornvlies oppervlak.
Schade aan een van de lagen van het hoornvlies kan leiden tot ernstige visuele handicap, en hoornvlies gebreken zijn dus een van de belangrijkste oorzaken van zicht verlies wereldwijd. In de cel van de stam van de limbal-deficiëntie (LSCD), is de limbus vernietigd door ziekte of een trauma die tot conjunctivalization en troebelingen van het hoornvlies oppervlak en daaropvolgende verlies van visie5,6 leidt. Cel substitutietherapie met behulp van autologe of allogene limbal transplantaties biedt de strategie van een behandeling voor patiënten met LSCD4,,7,,8,9. Echter, oogsten van autologe transplantaten draagt een risico van complicaties voor het gezonde oog en donorweefsel is schaars. Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs), specifiek menselijke embryonale stamcellen (hESCs) en menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs), kan dienen als een onbeperkte bron van klinisch relevante celtypen, met inbegrip van hoornvlies epitheliale cellen. Zodoende, hPSC afkomstige LESCs (hPSC-LESCs) vormen een aantrekkelijke nieuwe cel voor oogbeschadigingen en/of cel substitutietherapie.
Traditioneel, hebben zowel de ongedifferentieerde hPSC cultuur-methoden en de protocollen van de differentiatie te LESCs vertrouwd op het gebruik van niet-gedefinieerde feeder cellen, dierlijke sera, geconditioneerde media of vruchtwater membranen10,11, 12 , 13 , 14 , 15. onlangs, streven naar veiligere cel therapie producten de zoektocht naar meer gestandaardiseerde en xeno-vrije cultuur en differentiatie protocollen hebben gevraagd. Dientengevolge, zijn verschillende gedefinieerde en xeno-gratis methoden voor langetermijnkweek van ongedifferentieerde hPSCs nu verkrijgbare16,17,18. Als een continuüm, gestuurde differentiatie protocollen te vertrouwen op moleculaire signalen bij hPSCs aan hoornvlies epitheliale lot onlangs geweest geïntroduceerd19,20,21,22, 23. Nog veel van deze protocollen beide ongedefinieerde, feeder gebaseerd hPSCs gebruikt als materiaal of complexe, XENOGENECELLEN groeifactor cocktail voor differentiatie wordt gestart.
Het doel van dit protocol is bedoeld als een robuuste, geoptimaliseerde, xeno- en feeder-vrije hPSC cultuur methode en latere differentiatie naar hoornvlies LESCs. Enkelgelaagde cultuur van pluripotente hPSCs op laminin-521 (LN-521) matrix gedefinieerd, albumine-gratis hPSC medium (specifiek essentiële 8 Flex) kunt snelle productie van homogene grondstof voor differentiaties. Daarna een eenvoudige, de strategie van de differentiatie van de twee stappen begeleidt hPSCs naar oppervlakte ectodermal lot in suspensie, gevolgd door aanhangend differentiatie naar LESCs. Een waar > 65% ΔNp63α express-celpopulatie wordt verkregen binnen 24 dagen. Het protocol xeno - en feeder-free is getest met verschillende hPSC lijnen (zowel hESCs als hiPSCs), zonder dat er gelden voor de cel specifieke optimalisering van de lijn. De protocollen voor het weekend-vrije onderhoud, passaging, cryostoring en hPSC-LESC fenotypering hier beschreven inschakelen productie van grote hoeveelheden van kwalitatief hoogwaardige LESCs voor klinische of onderzoek doeleinden.

<table><tbody><tr><td>Materiaal/Reagens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS met Ca2+ en Mg2+</td><td>Gibco</td><td>#14040-091</td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS zonder Ca2+ en Mg2+</td><td>Lonza</td><td>#17-512F/12</td><td></td></tr><tr><td>100 mm celcultuurschaal</td><td>Corning CellBIND</td><td>#3296</td><td>Cultuurvat formaat voor adherente hPSC-LESC differentiatie</td></tr><tr><td>12-well plate</td><td>Corning CellBIND</td><td>#3336</td><td>Cultuurvat formaat voor IF-monsters</td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Corning CellBIND</td><td>#3337</td><td>Cultuurvat formaat voor IF-monsters</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>#31350-010</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate, Ultra-Low attachment</td><td>Corning Costar</td><td>#3471</td><td>Cultuurvat formaat voor inductie in suspensiecultuur</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-muis Ig</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#A-21202</td><td>Secundaire antilichaam voor IF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-konijn Ig</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#A-21206</td><td>Secundaire antilichaam voor IF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 anti-geit Ig</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#A-11057</td><td>Secundaire antilichaam voor IF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 anti-muis Ig</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#A-10037</td><td>Secundaire antilichaam voor IF</td></tr><tr><td>Basic fibroblast growth factor (bFGF, humaan)</td><td>PeproTech Inc.</td><td>#AF-100-18B</td><td>Diervrijg Recombinant Humaan FGF-basis (154 a.a.)</td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Fixatie/Permeabilisatie Oplossing</td><td>BD Biosciences</td><td>#554722</td><td>Fixatie en permeabilisatie oplossing voor flowcytometrie</td></tr><tr><td>BD Perm/Wash Buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>#554723</td><td>Wasbuffer voor flowcytometrie</td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#B0560</td><td></td></tr><tr><td>Bote morphogenetisch proteïne 4 (BMP-4)</td><td>PeproTech Inc.</td><td>#120-05A</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#A8022-100G</td><td></td></tr><tr><td>Cytokeratine 12 antilichaam</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>#SC-17099</td><td>Primair antilichaam voor IF</td></tr><tr><td>Cytokeratine 14 antilichaam</td><td>R&amp;D Systems</td><td>#MAB3164</td><td>Primair antilichaam voor IF</td></tr><tr><td>Cytokeratine 15 antilichaam</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#MS-1068-P</td><td>Primair antilichaam voor IF</td></tr><tr><td>CnT-30</td><td>CELLnTEC Advanced Cell Systems AG</td><td>#Cnt-30</td><td>Cultuurmedium voor adherente hPSC-LESC differentiatie</td></tr><tr><td>Collageen type IV (humaan)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#C5533</td><td>Humaan placenta collageen type IV</td></tr><tr><td>CoolCell LX Bevriezingscontainer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#BCS-405</td><td></td></tr><tr><td>CryoPure buizen</td><td>Sarsted</td><td>#72.380</td><td>1.6 mL cryobuis voor hPSC-LESC cryopreservatie</td></tr><tr><td>Defined Trypsine Inhibitor</td><td>Gibco</td><td>#R-007-100</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Flex Medium Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#A2858501</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>#35050061</td><td></td></tr><tr><td>Laminine 521</td><td>Biolamina</td><td>#Ln521</td><td>Humaan recombinant laminine 521</td></tr><tr><td>&Delta;Np63&alpha; antilichaam</td><td>BioCare Medical</td><td>#4892</td><td>Primair antilichaam voor IF</td></tr><tr><td>OCT3/4 antilichaam</td><td>R&amp;D Systems</td><td>#AF1759</td><td>Primair antilichaam voor IF</td></tr><tr><td>p63&alpha; antilichaam</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#ACI3066A</td><td>Primair antilichaam voor IF</td></tr><tr><td>p63-&alpha; (D2K8X) XP Konijn mAb (PE Conjugaat)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#56687</td><td>p63-&alpha; PE-geconjugeerd antilichaam voor flowcytometrie</td></tr><tr><td>PAX6 antilichaam</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#HPA030775</td><td>Primair antilichaam voor IF</td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>Lonza</td><td>#17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#158127</td><td>Celfixatief voor IF</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant met DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#P36931</td><td>DAPI mountant voor harde montage voor IF</td></tr><tr><td>PSC Cryopreservatie Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#A2644601</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzym</td><td>Gibco</td><td>#12563-011</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium</td><td>Gibco</td><td>#10829018</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut SR XenoFree CTS</td><td>Gibco</td><td>#10828028</td><td></td></tr><tr><td>MEM niet-essentiële aminozuren</td><td>Gibco</td><td>#11140050</td><td></td></tr><tr><td>SB-505124</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#S4696</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#T8787</td><td>Permeabilisatiemiddel voor IF</td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Vector Laboratories</td><td>#H-1200</td><td>DAPI mountant voor vloeibare montage voor IF</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytocentrifuge, bijv. CellSpin II</td><td>Tharmac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flowcytometer, bijv. BD Accuri C6</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop, bijv. Olympus IX 51</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

efficiënt en schaalbare gestuurde differentiatie van klinisch hoornvlies limbal epitheliale cellen van de stam van menselijke pluripotente stamcellen

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Hoornvlies limbal epitheliale cellen van de stam (LESCs) zijn verantwoordelijk voor het continu vernieuwen het hoornvlies epithelium en dus behoud van hoornvlies homeostase en visuele helderheid. Menselijke pluripotente stamcellen (hPSC)-afgeleide LESCs bieden een veelbelovende cel bron voor hoornvlies cel substitutietherapie. Ongedefinieerde, XENOGENECELLEN cultuur en differentiatie voorwaarden variatie veroorzaken in de onderzoeksresultaten en de klinische vertaling van hPSC afkomstige therapeutics belemmeren. Dit protocol biedt een reproduceerbare en efficiënte methode voor hPSC-LESC differentiatie xeno- en voorwaarden feeder cel-vrij. Ten eerste serveert enkelgelaagde cultuur van ongedifferentieerde hPSC op recombinante laminin-521 (LN-521) en gedefinieerde hPSC medium als een fundament voor de robuuste productie van kwalitatief hoogwaardige grondstof voor differentiaties. In de tweede plaats levert een snelle en eenvoudige hPSC-LESC differentiatie methode LESC populaties in slechts 24 dagen. Deze methode omvat een vierdaags oppervlakte ectodermal inductie in suspensie met kleine molecules, gevolgd door aanhangend cultuur fase op LN-521/collageen IV combinatie matrix in gedefinieerde hoornvlies epitheliale differentiatie medium. Cryostoring en uitgebreide differentiatie verder zuivert de celpopulatie en kunt bankieren van de cellen in grote hoeveelheden voor cel therapie producten. De resulterende hoogwaardige hPSC-LESCs bieden een mogelijke nieuwe behandeling strategie voor hoornvlies oppervlakte wederopbouw voor de behandeling van de cel van de stam van de limbal deficiëntie (LSCD).

Van hPSCs naar hPSC-LESCs
Het hele proces van het inducerende differentiatie van FF hPSCs te cryostoring hPSC-LESCs duurt ongeveer 3,5 weken. Schematisch overzicht van de methode van de differentiatie markeren zijn belangrijke stappen is in figuur 1Agepresenteerd. Figuur 1B toont de typische morphologies van de cel populaties in verschillende fasen van het protocol. De geg...

Dit protocol introduceert een eenvoudige twee stappen methode voor het differentiëren van hoornvlies limbal epitheliale cellen van de stam van menselijke pluripotente stamcellen xeno- en voorwaarden feeder cel-vrije cultuur. De cel kweekmethoden gepresenteerde inschakelen kostenefficiënte en grootschalige productie van klinische kwaliteit cellen toepassing op hoornvlies cel therapie gebruik.

Efficiënt en schaalbare gestuurde differentiatie van klinisch hoornvlies Limbal epitheliale cellen van de stam van menselijke pluripotente stamcellen

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

Dit protocol introduceerde een gedefinieerde feedercel vrije methode voor het differentiëren van hoornvlies limbale epitheelstamcellen van menselijke pluripotente stamcellen. Limbale epitheelstamcellen zijn verantwoordelijk voor het vernieuwen van de hoornvlieseppilelial in het gezonde oog. Schade aan deze cellen leidt tot een aandoening die bekend staat als limbale stamceltekort, en tot het verlies van de helderheid van het hoornvlies.De hier getoonde celkweekmethoden maken een efficiënte productie van epitheelse stamcellen mogelijk voor toekomstige hoornvliescelvervangende therapieën. Om te beginnen, passage en onderhoud van de feeder vrije menselijke pluripotente stamcelcultuur zoals beschreven in het tekstprotocol. Zorg ervoor dat u alleen menselijke pluripotente stamcellen van hoge kwaliteit gebruikt als uitgangsmateriaal voor differentiaties.Wanneer klaar om embryoide lichaamvorming te induceren, verwarm alle benodigde materialen en reagentia op kamertemperatuur in een laminaire stroomkap. Maak de feeder vrije menselijke pluripotente stamcellen los aan de suspensie door 500 microliter xenovrije trypsin EDTA aan elke put toe te voegen. Een broeden op 37 graden Celsius, met 5%CO2.Na drie minuten verwijdert u de cellen uit de couveuse en controleert u de celmorfologie om de optimale fase voor trypsineverwijdering te bepalen. Observeer de cellen zorgvuldig om de optimale tijd te bepalen om de xenovrije tryspin EDTA te verwijderen, wanneer de cellen naar boven zijn afgerond, maar niet volledig zijn losgemaakt. Verwijder op het optimale moment de xenovrije trypsine EDTA uit de cellen.Voeg gedefinieerde trypsineremmer en voorzichtig pipet om de cellen los te maken. Verzamel de eencellige suspensie in een 50 milliliter centrifugebuis. Centrifuge op 300g gedurende vijf minuten.Verwijder vervolgens de supernatant en zet de cellen opnieuw op in één milliliter kweekmedium. Na het tellen van de cellen, distribueren twee tot drie miljoen cellen in drie milliliter van basale inductie medium aangevuld met vijf micromolar blebbistatine aan elke put van een lage bevestiging zes put plaat. Incubeer 's nachts bij 37 graden Celsius met 5%CO2.Controleer de volgende dag de kwaliteit van de embryonale lichamen onder een microscoop. Verwijder het medium, en vervang het door drie milliliter van basale inductie medium aangevuld met 10 micromolar SB-505124 en 50 nanogram per milliliter van menselijke basis glasvezel groeifactor. Blijf uitbroeden bij 37 graden Celsius met 5%CO2.De volgende twee dagen, verwijder het medium, en vervang het door drie milliliter van basale inductie medium, aangevuld met 25 nanogram per milliliter bot morfogenetische eiwit vier. Ga vervolgens verder met incubatie met de vorige voorwaarden. Op dag vier, bereid een mengsel van 0,5 microgram per vierkante centimeter laminin-521, en vijf microgram per vierkante centimeter van de menselijke placenta collageen type vier, verdund in DPBS met calcium twee en magnesium twee ionen.Met behulp van dit mengsel, de vacht van de 100 millimeter weefselkweek gerechten voor aanhangende differentiatie in de totale coating volume van vijf milliliter per schotel. Verzegel de borden en bewaar ze 's nachts op vier graden Celsius. Verwarm op dag vijf alle benodigde materialen en reagentia tot kamertemperatuur in een laminaire stroomkap.Verwijder hierna de coatingoplossing en voeg 10 milliliter voorverwarmd differentiatiemedium toe aan elk gerecht. Breng met behulp van een pipet de embryonale lichamen van één plaat goed over twee tot drie weefselkweekgerechten. Schud vervolgens voorzichtig elk kweekgerecht om de embryonale lichamen gelijkmatig te verdelen.Houd de cellen in aanhangende cultuur op 37 graden Celsius met 5%CO2 voor de komende twee en een half tot drie weken, ervoor te zorgen dat het medium te vervangen door 10 milliliter van verse differentiatie medium drie keer per week. Gebruik een fase contrastmicroscoop om regelmatig de cellen te controleren op het ontstaan van de juiste epitheelmorfologie. Om te beginnen, pre-warm alle benodigde materialen en reagentia op kamertemperatuur in een laminaire stroomkap, met uitzondering van de cryopreservatie medium, die moet worden voorgekoeld.Vervolgens los de menselijke pluripotente stamcel afgeleide limbale epitheelstamcellen aan eencellige suspensie door toevoeging van xeno vrije trypsin EDTA en incubatie bij 37 graden Celsius met 5% CO2. Verwijder na vijf minuten de cellen uit de couveuse en controleer de celmorfologie om de optimale fase voor trypsineverwijdering te bepalen. Observeer de cellen zorgvuldig om de optimale tijd te bepalen om de xenovrije trypsine EDTA te verwijderen, wanneer de cellen naar boven zijn afgerond, maar niet volledig zijn losgemaakt.Verwijder op het optimale moment de xenovrije trypsine EDTA uit de cellen en maak de cellen los zoals eerder beschreven. Na het tellen van de cellen, centrifugeren ze op 300g gedurende vijf minuten. Aspirate het medium, en resuspend de cellen in pre-gekoelde xeno vrije cryopreservatie medium.Breng met behulp van een pipet de eencellige suspensie over in cryobuizen, zodat elke cryobuis tussen de 500.000 en 1 miljoen cellen bevat in één milliliter cryopreservatiemedium. Plaats de buizen in een vriescontainer. Binnen vijf minuten, breng ze naar een vriezer bij negatieve 80 graden Celsius voor 's nachts opslag.De volgende dag, breng de buizen naar vloeibare stikstof voor langdurige opslag. Voordat u de cellen ontdooit, bedekt u alle benodigde borden en plaatputten met een mengsel van vijf microgram per vierkante centimeter menselijk placentacollage type vier en 0,5 microgram per vierkante centimeter LM-521 en verwarm alle benodigde materialen en reagentia voor op kamertemperatuur in de laminaire stroomkap. Verwijder vervolgens de coatingoplossing uit de afwas en de plaatputten en voeg het juiste volume van het voorverwarmde differentiatiemedium toe.Voeg voorverwarmd differentiatiemedium toe aan een conische buis van 15 milliliter. Ontdooi de cellen snel tot kamertemperatuur. Eenmaal ontdooid, breng je de celsuspensie onmiddellijk over op de conische centrifugebuis.Centrifuge op 300g gedurende vijf minuten. Aspirate het medium, en resuspend de cel pellet in differentiatie medium om een cryopreservatie medium te verwijderen. Plaat de cellen op voorgecoate gerechten in differentiatie medium bij een dichtheid van 40,000 tot 50.000 cellen per vierkante centimeter.Houd de cellen op 37 graden Celsius op 5%CO2, ter vervanging van de differentiatie medium drie keer per week. Op Laminin-521 vormen de ongedifferentieerde feedervrije menselijke pluripotente stamcellen van hoge kwaliteit eerst verschillende kolonies met scherpe randen, die op samenvloeiing op elkaars wijze tot homogene monolagen fuseren. Culturing in basale inductiemedium, aangevuld met vijf micromolar blebbistatin gedurende 24 uur produceert doorgaans een suspensie van strakke, regelmatige embryoloze lichamen van verschillende grootte, terwijl de embryoloze lichaamsmorfologie niet drastisch mag veranderen tijdens de oppervlakte ectodermale inductie in suspensie, koloniale uitgroei wordt gezien om te verschijnen kort nadat de embryoloze lichamen zijn verguld op het collageen type vier en Laminin-521 matrixcombinatie in medium differentiatie.Binnen 21 tot 25 dagen na differentiatie vormen de cellen vloeiende homogene lagen, met veelhoekige morfologie, die typisch is voor epitheelcellen. De cellen kunnen dan cryo worden opgeslagen voor later gebruik, omdat levensvatbaarheid en morfologie goed worden bewaard na het ontdooien. Op dag 24 van differentiatie, de overgrote meerderheid van de cellen uitgedrukt gepaarde doos eiwit, PAX6, de belangrijkste regulator van de ontwikkeling van de ogen, evenals p63 alpha, de algemeen erkende LESC marker.Delta Np63 is coexpressed in de meeste p63 alfa-positieve cellen, bevestiging van de meest hoornvlies specifieke delta Np63 alfa positieve cel fenotype. Andere markers worden gedeeltelijk uitgedrukt, terwijl anderen op dit punt niet op te sporen zijn, wat aangeeft dat differentiatie is gevorderd in de richting van de onepotente epitheliale epitheliale voorlopers, maar de terminale differentiatie in volwassen hoornvlies epitheelcellen is nog niet opgetreden. Gemiddeld genereert elke ongedifferentieerde feedervrije menselijke pluripotente stamcel 0,7 cellen per dag 25.Ten minste 65% delta Np63 alfa positieve cel populatie kan worden verwacht door dag 24. Cryopreservatie zuivert verder de celpopulatie. Over het algemeen zijn de hier gepresenteerde methoden relatief eenvoudig, maar er zijn een paar kritische punten voor succes.Hoge kwaliteit van het uitgangsmateriaal is essentieel, evenals zachte, vloeiende celkweektechnieken in het algemeen. Dit protocol biedt robuuste middelen om limbale epitheelstamcellen te produceren voor klinische toepassingen, evenals voor verschillende onderzoeksdoeleinden. Bovendien kan de methode gemakkelijk worden aangepast voor differentiatie van retinale pigment epitheelcellen.

efficient-scalable-directed-differentiation-clinically-compatible

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Stamcellenafgeleide retinale pigmentepitheel (RPE) cellen kunnen voor meerdere toepassingen worden gebruikt, waaronder cel-gebaseerde therapieën voor retinale degeneratie, ziektemodellering en geneesmiddelstudies. Hier presenteren we een eenvoudig protocol voor het reproduceerbaar verkrijgen van RPE uit stamcellen.

Efficiënte Afleiding van retinale pigment epitheel cellen uit stamcellen

Een voorbeeld van adenovirale gentherapie in humane diabetische orgaan-gecultiveerde hoornvliezen wordt gepresenteerd met als doel de normalisatie van vertraagde wondgenezing en een duidelijk verminderde expressie van epitheliale stamcelmarkers in deze hoornvliezen. Het beschrijft ook de optimalisering van dit proces in stamcel-verrijkte limbale epitheelculturen.

Adenovirale Gentherapie voor Diabetische keratopathie: Effecten op wondgenezing en Stem Cell Marker Expressie in Human Organ-gekweekte Corneas en Limbale epitheelcellen

Dit protocol wordt beschreven hoe retinale pigment epitheliale cellen (RPE) uit pluripotente stamcellen te produceren. De methode gebruikt een combinatie van factoren die de groei en de kleine molecules om direct de differentiatie van stamcellen in onvolwassen RPE in veertien dagen en volwassen, functionele RPE na drie maanden.

Snelle, gerichte differentiatie van de epitheliale cellen van de retinale Pigment van menselijke embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen

Dit protocol Details een monolayer, serum-vrije methode voor het efficiënt genereren van hepatocyte-achtige cellen van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) in 18 dagen. Dit omvat zes stappen als hpscs sequentieel differentiëren in tussenliggende celtypen zoals de primitieve streak, definitieve endoderm, posterieure foregut en lever Bud voor ouders voor het vormen van hepatocyte-achtige cellen.

Efficiënte differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in levercellen

Hier gepresenteerd is een protocol voor het genereren van een eencellige cultuur van menselijke embryonale stamcellen en hun daaropvolgende differentiatie in neurale voorlopercellen. Het protocol is eenvoudig, robuust, schaalbaar en geschikt voor geneesmiddelen screening en toepassingen voor regeneratieve geneeskunde.

Efficiënte Neurale differentiatie met behulp van eencellige cultuur van menselijke embryonale stamcellen

Met behulp van een zelforganiserende methode ontwikkelen we met de toevoeging van COCO een protocol dat de generatie van fotoreceptoren aanzienlijk zou kunnen verhogen.

Gerichte inductie van retinale organoïden uit menselijke pluripotente stamcellen

Hier wordt een eenvoudig protocol gepresenteerd voor de gerichte differentiatie van hemogene endotheelcellen van menselijke pluripotente stamcellen in ongeveer 1 week.

Gerichte differentiatie van hemogene endotheelcellen uit menselijke pluripotente stamcellen

Hier beschrijven we een geoptimaliseerd retinale organoïde inductiesysteem, dat geschikt is voor verschillende menselijke pluripotente stamcellijnen om retinale weefsels met een hoge reproduceerbaarheid en efficiëntie te genereren.

Retinale organoïde inductiesysteem voor afleiding van 3D retinale weefsels van menselijke pluripotente stamcellen

Hier presenteren we een protocol om de menselijke limbale nichecellen te isoleren en te identificeren.

Isolatie en identificatie van limbale nichecellen

Hier presenteren we een protocol om hoogwaardige single-cell suspensies uit hele muishoornvliezen te verkrijgen via sequentiële vertering met collagenase A en trypsine. Deze methode levert levensvatbare individuele cellen met hoge RNA-integriteit op, waardoor ze compatibel zijn met downstream-toepassingen zoals single-cell RNA-sequencing en flowcytometriey.

Een protocol voor het oogsten van single-cel suspensie uit muizenhoornvliezen

Leer een gedefinieerde feeder-vrije methode voor de differentiatie van klinische hoornvlies limbus epitheliale stamcellen uit menselijke pluripotente stamcellen. Deze techniek ondersteunt regeneratieve therapieën.

Efficiënt en schaalbare gestuurde differentiatie van klinisch hoornvlies Limbal epitheliale cellen van de stam van menselijke pluripotente stamcellen (Video) | JoVE Journal

Efficiënt en schaalbare gestuurde differentiatie van klinisch hoornvlies Limbal epitheliale cellen van de stam van menselijke pluripotente stamcellen

Meer video's verkennen