Efficiënt en schaalbare gestuurde differentiatie van klinisch hoornvlies Limbal epitheliale cellen van de stam van menselijke pluripotente stamcellen

Dit protocol introduceerde een gedefinieerde feedercel vrije methode voor het differentiëren van hoornvlies limbale epitheelstamcellen van menselijke pluripotente stamcellen. Limbale epitheelstamcellen zijn verantwoordelijk voor het vernieuwen van de hoornvlieseppilelial in het gezonde oog. Schade aan deze cellen leidt tot een aandoening die bekend staat als limbale stamceltekort, en tot het verlies van de helderheid van het hoornvlies.

De hier getoonde celkweekmethoden maken een efficiënte productie van epitheelse stamcellen mogelijk voor toekomstige hoornvliescelvervangende therapieën. Om te beginnen, passage en onderhoud van de feeder vrije menselijke pluripotente stamcelcultuur zoals beschreven in het tekstprotocol. Zorg ervoor dat u alleen menselijke pluripotente stamcellen van hoge kwaliteit gebruikt als uitgangsmateriaal voor differentiaties.

Wanneer klaar om embryoide lichaamvorming te induceren, verwarm alle benodigde materialen en reagentia op kamertemperatuur in een laminaire stroomkap. Maak de feeder vrije menselijke pluripotente stamcellen los aan de suspensie door 500 microliter xenovrije trypsin EDTA aan elke put toe te voegen. Een broeden op 37 graden Celsius, met 5%CO2.

Na drie minuten verwijdert u de cellen uit de couveuse en controleert u de celmorfologie om de optimale fase voor trypsineverwijdering te bepalen. Observeer de cellen zorgvuldig om de optimale tijd te bepalen om de xenovrije tryspin EDTA te verwijderen, wanneer de cellen naar boven zijn afgerond, maar niet volledig zijn losgemaakt. Verwijder op het optimale moment de xenovrije trypsine EDTA uit de cellen.

Voeg gedefinieerde trypsineremmer en voorzichtig pipet om de cellen los te maken. Verzamel de eencellige suspensie in een 50 milliliter centrifugebuis. Centrifuge op 300g gedurende vijf minuten.

Verwijder vervolgens de supernatant en zet de cellen opnieuw op in één milliliter kweekmedium. Na het tellen van de cellen, distribueren twee tot drie miljoen cellen in drie milliliter van basale inductie medium aangevuld met vijf micromolar blebbistatine aan elke put van een lage bevestiging zes put plaat. Incubeer 's nachts bij 37 graden Celsius met 5%CO2.

Controleer de volgende dag de kwaliteit van de embryonale lichamen onder een microscoop. Verwijder het medium, en vervang het door drie milliliter van basale inductie medium aangevuld met 10 micromolar SB-505124 en 50 nanogram per milliliter van menselijke basis glasvezel groeifactor. Blijf uitbroeden bij 37 graden Celsius met 5%CO2.

De volgende twee dagen, verwijder het medium, en vervang het door drie milliliter van basale inductie medium, aangevuld met 25 nanogram per milliliter bot morfogenetische eiwit vier. Ga vervolgens verder met incubatie met de vorige voorwaarden. Op dag vier, bereid een mengsel van 0,5 microgram per vierkante centimeter laminin-521, en vijf microgram per vierkante centimeter van de menselijke placenta collageen type vier, verdund in DPBS met calcium twee en magnesium twee ionen.

Met behulp van dit mengsel, de vacht van de 100 millimeter weefselkweek gerechten voor aanhangende differentiatie in de totale coating volume van vijf milliliter per schotel. Verzegel de borden en bewaar ze 's nachts op vier graden Celsius. Verwarm op dag vijf alle benodigde materialen en reagentia tot kamertemperatuur in een laminaire stroomkap.

Verwijder hierna de coatingoplossing en voeg 10 milliliter voorverwarmd differentiatiemedium toe aan elk gerecht. Breng met behulp van een pipet de embryonale lichamen van één plaat goed over twee tot drie weefselkweekgerechten. Schud vervolgens voorzichtig elk kweekgerecht om de embryonale lichamen gelijkmatig te verdelen.

Houd de cellen in aanhangende cultuur op 37 graden Celsius met 5%CO2 voor de komende twee en een half tot drie weken, ervoor te zorgen dat het medium te vervangen door 10 milliliter van verse differentiatie medium drie keer per week. Gebruik een fase contrastmicroscoop om regelmatig de cellen te controleren op het ontstaan van de juiste epitheelmorfologie. Om te beginnen, pre-warm alle benodigde materialen en reagentia op kamertemperatuur in een laminaire stroomkap, met uitzondering van de cryopreservatie medium, die moet worden voorgekoeld.

Vervolgens los de menselijke pluripotente stamcel afgeleide limbale epitheelstamcellen aan eencellige suspensie door toevoeging van xeno vrije trypsin EDTA en incubatie bij 37 graden Celsius met 5% CO2. Verwijder na vijf minuten de cellen uit de couveuse en controleer de celmorfologie om de optimale fase voor trypsineverwijdering te bepalen. Observeer de cellen zorgvuldig om de optimale tijd te bepalen om de xenovrije trypsine EDTA te verwijderen, wanneer de cellen naar boven zijn afgerond, maar niet volledig zijn losgemaakt.

Verwijder op het optimale moment de xenovrije trypsine EDTA uit de cellen en maak de cellen los zoals eerder beschreven. Na het tellen van de cellen, centrifugeren ze op 300g gedurende vijf minuten. Aspirate het medium, en resuspend de cellen in pre-gekoelde xeno vrije cryopreservatie medium.

Breng met behulp van een pipet de eencellige suspensie over in cryobuizen, zodat elke cryobuis tussen de 500.000 en 1 miljoen cellen bevat in één milliliter cryopreservatiemedium. Plaats de buizen in een vriescontainer. Binnen vijf minuten, breng ze naar een vriezer bij negatieve 80 graden Celsius voor 's nachts opslag.

De volgende dag, breng de buizen naar vloeibare stikstof voor langdurige opslag. Voordat u de cellen ontdooit, bedekt u alle benodigde borden en plaatputten met een mengsel van vijf microgram per vierkante centimeter menselijk placentacollage type vier en 0,5 microgram per vierkante centimeter LM-521 en verwarm alle benodigde materialen en reagentia voor op kamertemperatuur in de laminaire stroomkap. Verwijder vervolgens de coatingoplossing uit de afwas en de plaatputten en voeg het juiste volume van het voorverwarmde differentiatiemedium toe.

Voeg voorverwarmd differentiatiemedium toe aan een conische buis van 15 milliliter. Ontdooi de cellen snel tot kamertemperatuur. Eenmaal ontdooid, breng je de celsuspensie onmiddellijk over op de conische centrifugebuis.

Centrifuge op 300g gedurende vijf minuten. Aspirate het medium, en resuspend de cel pellet in differentiatie medium om een cryopreservatie medium te verwijderen. Plaat de cellen op voorgecoate gerechten in differentiatie medium bij een dichtheid van 40,000 tot 50.000 cellen per vierkante centimeter.

Houd de cellen op 37 graden Celsius op 5%CO2, ter vervanging van de differentiatie medium drie keer per week. Op Laminin-521 vormen de ongedifferentieerde feedervrije menselijke pluripotente stamcellen van hoge kwaliteit eerst verschillende kolonies met scherpe randen, die op samenvloeiing op elkaars wijze tot homogene monolagen fuseren. Culturing in basale inductiemedium, aangevuld met vijf micromolar blebbistatin gedurende 24 uur produceert doorgaans een suspensie van strakke, regelmatige embryoloze lichamen van verschillende grootte, terwijl de embryoloze lichaamsmorfologie niet drastisch mag veranderen tijdens de oppervlakte ectodermale inductie in suspensie, koloniale uitgroei wordt gezien om te verschijnen kort nadat de embryoloze lichamen zijn verguld op het collageen type vier en Laminin-521 matrixcombinatie in medium differentiatie.

Binnen 21 tot 25 dagen na differentiatie vormen de cellen vloeiende homogene lagen, met veelhoekige morfologie, die typisch is voor epitheelcellen. De cellen kunnen dan cryo worden opgeslagen voor later gebruik, omdat levensvatbaarheid en morfologie goed worden bewaard na het ontdooien. Op dag 24 van differentiatie, de overgrote meerderheid van de cellen uitgedrukt gepaarde doos eiwit, PAX6, de belangrijkste regulator van de ontwikkeling van de ogen, evenals p63 alpha, de algemeen erkende LESC marker.

Delta Np63 is coexpressed in de meeste p63 alfa-positieve cellen, bevestiging van de meest hoornvlies specifieke delta Np63 alfa positieve cel fenotype. Andere markers worden gedeeltelijk uitgedrukt, terwijl anderen op dit punt niet op te sporen zijn, wat aangeeft dat differentiatie is gevorderd in de richting van de onepotente epitheliale epitheliale voorlopers, maar de terminale differentiatie in volwassen hoornvlies epitheelcellen is nog niet opgetreden. Gemiddeld genereert elke ongedifferentieerde feedervrije menselijke pluripotente stamcel 0,7 cellen per dag 25.

Ten minste 65% delta Np63 alfa positieve cel populatie kan worden verwacht door dag 24. Cryopreservatie zuivert verder de celpopulatie. Over het algemeen zijn de hier gepresenteerde methoden relatief eenvoudig, maar er zijn een paar kritische punten voor succes.

Hoge kwaliteit van het uitgangsmateriaal is essentieel, evenals zachte, vloeiende celkweektechnieken in het algemeen. Dit protocol biedt robuuste middelen om limbale epitheelstamcellen te produceren voor klinische toepassingen, evenals voor verschillende onderzoeksdoeleinden. Bovendien kan de methode gemakkelijk worden aangepast voor differentiatie van retinale pigment epitheelcellen.