Kracht-Clamp reometrie voor het karakteriseren van de Hydrogels op basis van eiwitten

De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het een PID gebruikt, wat staat voor een proportioneel integraal afgeleide systeem om gecontroleerde krachtprotocollen toe te passen op eiwithydrogel-monsters, en het gebruikt kleine monstervolumes. De protocollen voor de krachtklemmen staan een eenvoudige interpretatie van de gegevens toe, terwijl lage volumes cruciaal zijn bij het werken met moeilijk te produceren eiwitten die slechts in kleine hoeveelheden beschikbaar zijn. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot het ontwikkelen en karakteriseren van nieuwe biometrische materialen met duurzame elasticiteit, door gebruik te maken van de neervouwende, hervouwende overgangskarakteristiek van eiwitten.

Deze methode kan vragen beantwoorden in weefsel- en biomateriaalmechanica door het mogelijk te maken om miljarden eiwitmoleculen in één trek te meten en omgevingen te simuleren die overeenkomsten vertonen met biologische weefsels. Begin deze procedure met de bereiding van reagentoplossingen zoals beschreven in het tekstprotocol. Om het eiwit-gebaseerde hydrogel te synthetiseren, bevestigt u eerst een naald van 23 gauge op een spuit van één milliliter met een ingedrukte plunjer.

Snij vervolgens een polytetrafluorethyleen, of PTFE, buis van 10 centimeter met een scheermes. Bevestig de naald en spuit aan het ene uiteinde van de PTFE-buis. Plaats het tweede uiteinde van de buis in een silanisering en vul de buis door de spuitplunjer terug te trekken.

Laat de buis ongeveer 30 minuten staan. Verwijder vervolgens de silanisering en droog de buis met perslucht. Meng nu de eiwit-oplossing met APS en Tris(bipyridine)ruthenium(II)chloride in een buis van 1,5 milliliter met een constante volumeverhouding.

Vortex de fotoactieve oplossing totdat deze volledig gemengd is. Centrifugeer vervolgens het mengsel met maximale snelheid om eventuele luchtbellen uit de oplossing te verwijderen. Luchtbellen kunnen ontstaan bij het laden van het fotoactieve hydrogelmengsel in de Teflonbuis, wat tot beschadiging van het monster kan leiden.

Om luchtbelletjes te voorkomen, houdt u het uiteinde van de Teflonbuis tijdens het laadproces in de oplossingsmix en trekt u de spuitplunjer langzaam terug. Plaats het open uiteinde van de behandelde PTFE-buis in het fotoactieve mengsel en zuigt de oplossing in de buis door de spuitplunjer terug te trekken. Plaats nu de geladen buis ongeveer 10 centimeter van een 100 watt kwiklamp om verhitting te voorkomen en laat hem daar gedurende maximaal 30 minuten op kamertemperatuur staan.

Verwijder de buis van de naald en snijd de randen van de buis nabij de hydrogeluiteinden met een scheermes. Gebruik vervolgens een stompe naald van 24 gauge om het hydrogel in de Tris-oplossing te extruderen. Controleer visueel de gels op eventuele defecten die zich tijdens het extrusieproces of door luchtbellen kunnen vormen en gooi defecte gels weg.

Start het instrumentbesturingsprogramma en zet de voice coil-motor aan. Stel vervolgens de spoelpositie in op een waarde naar het einde van het bereik. Verplaats de haken in de Z-richting en lijn ze uit in de buiging in de X-richting.

Noteer vervolgens de waarden van de micrometerschroeven voor de X-richting. Maak nu een losse dubbele overhandse knoop aan het einde van de hechtdraad, zodat de diameter van de lus ongeveer vier millimeter is. Knip vervolgens de lus van de draad af.

Herhaal om een tweede lus te vormen. Plaats vervolgens de twee lussen op de haak verbonden met de krachtsensor. Vul de experimentele kamer met Tris-buffer en breng het hydrogelmonster over naar de gevulde kamer met behulp van medische pincetten.

Plaats de voice coil en de haakjes van de krachtsensor dicht bij het oplossingsoppervlak en lijn de haken in alle richtingen uit met behulp van de XYZ-positioneringsmanipulatoren. Hang met behulp van medische pincetten beide zijden van het eiwithydrogelmonster aan de haken die verbonden zijn met de voice coil en de krachtsensor. Een typische fout is het te strak aanhalen van de hechtlussen rond de hydrogelmonsters tijdens het bevestigingsproces.

Dit kan leiden tot de vorming van een inkeping en het snijden van het hydrogelmonster. Draai voorzichtig een hechtlus om het hydrogelmonster op de voice coilhaak door beide uiteinden van de hechtlus met medische pincetten vast te pakken en deze gelijktijdig te trekken. Herhaal deze stap voor de lus verbonden met de krachtsensor.

Trek de hechtlussen strak op de bochten van elke haak om verschuiving te voorkomen. Gebruik deze bochten als referentiepunten om de nulscheiding tussen de haken te vinden. Knip de overtollige lengtes van de hechtdraden af met medische schaar.

Verplaats het bevestigde hydrogel langs de Z-as naar de experimentele kamer met behulp van Z-manipulatoren om het hydrogel in de experimentele oplossing te dompelen. Lijn het hydrogelmonster in YZ uit met behulp van de manipulatoren zodat het gel niet onder enige stress staat. Nulleer de krachtsensor en scheid de twee haken met behulp van de X-micrometertrappen totdat het gel kracht begint te ervaren.

Zodra dit gebeurt, draai de micrometerschroef in de X-richting lichtjes terug. Noteer de positie van beide manipulatoren voor de voice coil-motor en de sensor. Gebruik vervolgens het verschil tussen deze waarden en de eerder gemeten waarden om de exacte scheiding tussen de verankeringshaken aan het begin van het experiment te berekenen.

Voer een krachtstijgingscyclus uit door de kracht te verhogen met de gewenste laadfrequentie, voer de start- en eindkrachtwaarden in, evenals de duur van het protocol, dat als een omgekeerde V verschijnt, gevolgd door een constante lage kracht gedurende ongeveer 200 seconden om de eiwitdomeinen de tijd te geven om zich te hervouwen voor de volgende cyclus. Voer een constant-krachtprotocol uit door een lage kracht gedurende 30 seconden toe te passen. Verhoog vervolgens de kracht tot een constante kracht gedurende een bepaalde tijd, gevolgd door het dempen van de kracht terug naar dezelfde lage waarde gedurende meer dan 300 seconden om de eiwitdomeinen te laten hervouwen en de gelelasticiteit te herstellen.

Voer ten slotte gegevensanalyse uit zoals beschreven in het tekstprotocol. El