Name: Wijzigen Baculovirus expressievectoren voor de productie van plantaardige eiwitten in Insect cellen uitgescheiden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Leer baculovirus-expressievectoren modificeren voor productie van plantaardige eiwitten in insectencellen. Deze kosteneffectieve methode ondersteunt structurele biologie en eiwitkristallisatieonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de nieuwe faculteit opstarten fondsen van de North Carolina State University voor Guozhou Xu.

Opmerking: Een insect cel/baculovirus systeem met gemodificeerde expressievectoren voor secretoire plantaardige eiwit expressie en kristallisatie wordt gebruikt.
1. wijziging van een Vector Baculovirus expressie met de GP67 signaal Peptide voor Plant eiwituitdrukking secretie
<ol><li>Synthetiseren van een fragment van DNA een 5' BglII snijden site13, de volgorde van GP67 secretie signaal en een multi-klonen site met kennisgevingen, BamHI, EcoRI, StuI, SalI, SpeI, XbaI, PstI en XhoI (figuur 1A). Opmerking: Aangezien zowel de BglII als de BamHI verteerd DNA resulteerde in de dezelfde zelfklevende uiteinden, de gelineariseerde vector naar het verteerd DNA-fragment kunt afbinden, terwijl zowel de BglII als de BamHI sites in de reeks van de ontharde afbinding zal worden gemuteerd in een reeks die niet cleavable door BglII of BamHI14.</li>
	<li>Digest 4 µg van het DNA met BglII en XhoI, en 4 µg voor een expressie vector DNA met BamHI en XhoI14. Meng 10 eenheden van elke restrictie-enzym met het DNA in een 1 x concentratie-reactie-buffer (Kaliumacetaat 50 mM, 20 mM Tris-acetaat, 10 mM magnesium acetaat en 100 µg/mL BSA, pH 7,9 bij 25 ° C) en laat het mengsel bij 37 ° C gedurende 4 uur inwerken.<ol>
<li>Het zuiveren van de verwijderde fragment van DNA en de gelineariseerde vector DNA door een DNA gel extractie kit15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mix 100 ng van de gelineariseerde vector DNA met 400 ng van het verteerd DNA fragment in een 10-µL afbinding reactiemengsel met 1 x T4 DNA ligase reactie buffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, ATP van 1 mM en 10 mM DTT, pH 7.5 bij 25 ° C) en 5 eenheden van T4 DNA Ligase. Incubeer het reactiemengsel bij 16 ° C voor 16 h.</li>
	<li>5 µL van het mengsel afbinding omvormen 100 µL van bevoegde cellen DH5α volgens een standaard transformatie-protocol en selecteer de resulterende kolonies op een ampicilline-LB agar plaat16. Pick up 5-10 kolonies en groeien elke kolonie in 2 mL zuiver LB opslagmedium met 100 µg/mL ampicilline bij 220 rpm en 37 ° C in een schudden incubator voor 16 h.</li>
	<li>Pak elk plasmide DNA met een DNA miniprep kit17 en het klonen bevestigen door DNA sequentiebepaling van een primer AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG.</li>
	<li>PCR-versterken het A. thaliana TDR gen fragment coderen residuen 30-642 van een synthetische TDR-gen construeren (toekomen primer: CATG GCGGCCGC CTCAAGTTTTCACCTCAACTCTTGTC, omgekeerde primer: GC GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTG ACCGTCTATATCTGCATTTCCGGC). Het versterken van het DNA voor 30 cycli in een polymerase van DNA reactie buffer met een 0.5 mM dNTP mix, 0,2 µM inleidingen, 0,1 µg sjabloon DNA, 0,4 mM MgCl2en 1 reactie-eenheid van de polymerase van DNA.<ol>
<li>Voor de PCR cyclus stappen, stelt u de initiële denaturatie bij 95 ° C gedurende 30 s en vervolgens 30 cycli van denaturatie bij 95 ° C gedurende 30 s, gloeien bij 55 ° C gedurende 30 s, en extensie bij 72 ° C gedurende 1 minuut, met een definitieve extensie bij 72 ° C gedurende 5 minuten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zowel het PCR fragment en de gemodificeerde vector met kennisgevingen en BamHI beperking endonuclease enzymen verteren. Het gen-fragment met de gelineariseerde vector afbinden. Mix 100 ng van de gelineariseerde vector DNA met 400 ng van het verteerd DNA fragment in een 10-µL afbinding reactiemengsel met T4 DNA ligase reactie buffer en 5 eenheden van T4 DNA ligase. Incubeer het reactiemengsel bij 16 ° C voor 16 h.</li>
	<li>5 µL van het mengsel afbinding omvormen 100 µL van bevoegde cellen DH5α volgens een standaard transformatie-protocol en selecteer de resulterende kolonies op een ampicilline-LB agar plaat16. Bevestig de juiste klonen door DNA sequencing.</li>
</ol>2. wijziging van een Vector Baculovirus expressie met de insecten Hemolin signaal Peptide voor Plant eiwituitdrukking secretie
<ol><li>Synthetiseren van een fragment van DNA een 5' BglII snijden site13, de volgorde van insecten hemolin secretie signaal en een multi-klonen site met kennisgevingen, BamHI, EcoRI, StuI, SalI, SpeI, XbaI, PstI en XhoI (figuur 1B).</li>
	<li>Digest 4 µg van het DNA met BglII en XhoI, en 4 µg voor een expressie vector DNA met BamHI en XhoI14. Meng 10 eenheden van elke restrictie-enzym met het DNA in een 1 x concentratie-reactie-buffer (Kaliumacetaat 50 mM, 20 mM Tris-acetaat, 10 mM magnesium acetaat en 100 µg/mL BSA, pH 7,9 bij 25 ° C) en laat het mengsel bij 37 ° C gedurende 4 uur inwerken.<ol>
<li>Het zuiveren van de verwijderde fragment van DNA en de gelineariseerde vector DNA door een DNA gel extractie kit15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mix 100 ng van de gelineariseerde vector DNA met 400 ng van het verteerd DNA fragment in een 10-µL afbinding reactiemengsel met 1 x T4 DNA ligase reactie buffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, ATP van 1 mM en 10 mM DTT, pH 7.5 bij 25 ° C) en 5 eenheden van T4 DNA Ligase. Incubeer het reactiemengsel bij 16 ° C voor 16 h.</li>
	<li>5 µL van het mengsel afbinding omvormen 100 µL DH5α bevoegde cellen en selecteer de kolonies op een ampicilline-LB agarplaat. Pick up 5-10 kolonies en groeien elke kolonie in een 2-mL LB medium waarin 100 µg/mL ampicilline bij 220 rpm en 37 ° C in een schudden incubator voor 16 h.</li>
	<li>Plasmide DNA met een DNA miniprep kit17 pak en het klonen bevestigen door DNA sequentiebepaling van een primer AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG.</li>
	<li>PCR-versterken A. thaliana stuifmeel Receptor Kinase 3 (PRK3) gen fragment codering residuen 20-237 van een synthetische PRK3 gene construct (toekomen primer: CATG GCGGCCGC CTACAAAACGTTAGTGAATCGGAACC, omgekeerde primer: CGC GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTG TGAAGGTTTCTCATCGCATTCTATATTC). Het versterken van het DNA voor 30 cycli in een polymerase van DNA reactie buffer met een 0.5 mM dNTP mix, 0,2 µM inleidingen, 0,1 µg sjabloon DNA, 0,4 mM MgCl2en 1 reactie-eenheid van de polymerase van DNA.<ol>
<li>Voor de PCR cyclus stappen, stelt u de initiële denaturatie bij 95 ° C gedurende 30 s en vervolgens 30 cycli van denaturatie bij 95 ° C gedurende 30 s, gloeien bij 55 ° C gedurende 30 s, en uitbreiding bij 72 ° C gedurende 30 s binnen elke cyclus, en de laatste uitbreiding bij 72 ° C gedurende 5 minuten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zowel het PCR fragment en de gemodificeerde vector met kennisgevingen en BamHI beperking endonuclease enzymen verteren. Het gen-fragment met de gelineariseerde vector afbinden. Mix 100 ng van de gelineariseerde vector DNA met 400 ng van het verteerd DNA fragment in een 10-µL afbinding reactiemengsel met T4 DNA ligase reactie buffer en 5 eenheden van T4 DNA ligase. Incubeer het reactiemengsel bij 16 ° C voor 16 h.</li>
	<li>5 µL van het mengsel afbinding omvormen 100 µL van bevoegde cellen DH5α volgens een standaard transformatie-protocol en selecteer de resulterende kolonies op een ampicilline-LB agar plaat16. Bevestig de juiste klonen door DNA sequencing.</li>
</ol>3. productie en versterking van Baculovirus construeert herbergen de Recombinant eiwit expressie Cassette
<ol><li>Gebruik 100 ng van de plasmide construct te transformeren 40 µL van bevoegde cellen DH10Bac volgens het protocol van de baculovirus expressie systeem1. Incubeer de platen van de transformatie bij 37 ° C gedurende 48 uur.</li>
	<li>Pick-up met twee witte kolonies van elke plaat transformatie, Inoculeer elke kolonie in 2 mL van LB medium met 50 µg Mo/mL kanamycine, 7 µg/mL gentamicine en 10 µg Fe/mL tetracycline. Volg het protocol van de baculovirus expressie systeem1 uitpakken en controleren van de bacmid van DNA. Aliquot elke DNA in twee buizen met 20 µL per stuk, en op te slaan van de buizen bij-20 ° C. Opmerking: De volgende stappen moet een aseptische bewerking.</li>
	<li>Groeien een monolayer van Sf9 cellen in de voedingsbodems met 10% foetale runderserum (FBS) en 100 µg/mL (of 100 I.U./mL) penicilline-streptomycine antibiotica bij 27 ° C tot 80% samenkomst in een 6-well-plate. Schatting van het percentage voor confluence gebaseerd op het percentage van de overdekte ruimte op de plaat weefselkweek.</li>
	<li>Voorbereiding van de volgende oplossingen in twee steriele 1.5-mL centrifuge buizen.<ol>
<li>Buis 1: Voor elke transfectie, Verdun 20 µL van bacmid DNA in 100 µL unsupplemented Sf9 cel kweekmedium zonder antibiotica. Meng voorzichtig de verdunning door flicking de kant van de buis.</li>
		<li>Buis 2: Voor elke transfectie, Verdun 8 µL van lipide transfectiereagens in 100 µL unsupplemented Sf9 cel kweekmedium zonder antibiotica. Meng de verdunning door pipetteren op en neer voor 6 x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Combineren van de twee oplossingen, meng ze zachtjes door pipetteren langzaam op en neer voor 3 x en laat ze 20-40 min bij kamertemperatuur inwerken.</li>
	<li>Wassen elk putje van de Sf9 enkelgelaagde cellen 2 x met 3 mL unsupplemented Sf9 cel kweekmedium zonder antibiotica. Voeg voor elke transfectie, 0.8 mL unsupplemented Sf9 cel kweekmedium zonder antibiotica aan elke buis met het mengsel van lipide-DNA. Meng de inhoud van de buizen voorzichtig door pipetteren langzaam op en neer voor 3 x. De media van het wassen van de platen gecombineerd en overlay van de monsters met de transfectie mengsel.</li>
	<li>Na de toevoeging van de transfectie mengsel, Incubeer de transfected plaat voor 5 uur bij 27 ° C. De transfectie media vervangen het volledige Sf9 cel kweekmedium dat 10% FBS en 100 µg/mL (of 100 I.U./mL) penicilline-streptomycine antibiotica. Incubeer de transfected plaat bij 27 ° C gedurende 4 d.</li>
	<li>Oogst en de recombinante baculovirus versterken.<ol>
<li>Verzamelen het supernatant van de besmette plaat in een steriele 15 mL conische buis na 4 d van incubatie. Draai het supernatant bij 1010 x g gedurende 5 min voor het verwijderen van het puin van de cel. Negeren van de pellet en decanteren van de bovendrijvende substantie aan een schone buis en sla het bij 4 ° C voor maximaal 1 jaar. Opmerking: Dit is het virus P0. Het kan worden aliquoted en opgeslagen bij-80 ° C voor een langere periode van tijd.</li>
		<li>Om te vullen elk recombinante virus, groeien een monolayer van Sf9 cellen op een 150-mm plaat tot 80% samenkomst. Gecombineerd van de media van de plaat, voeg toe 2 mL van het virus P0 aan de aanhanger van de cellen aan de plaat en de plaat gedurende 1 uur in een incubator 27 ° C incuberen. Rock de plaat elke 15 min mixen van het medium met de cellen.<ol>
<li>Voeg 25 mL volledige Grace media met 10% FBS en 100 µg/mL (of 100 I.U./mL) penicilline-streptomycine antibiotica. Incubeer de plaat voor 3 d in een 27 ° C incubator te verkrijgen van de P1 passage virus.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Het verzamelen van het supernatans van de besmette plaat in een steriele 50 mL conische buis en de spin bij 1010 x g gedurende 5 min voor het verwijderen van het puin van de cel. Giet het supernatant aan een schone buis en sla het bij 4 ° C voor maximaal 1 jaar. Opmerking: De P1-virus kan worden aliquoted en opgeslagen bij-80 ° C voor een langere periode van tijd.</li>
		<li>Om te versterken het virus van P1 naar P2 passage, groeien een monolayer van Sf9 cellen op een 150-mm plaat tot 90% samenkomst, gecombineerd van de media van de plaat, voeg toe 2 mL van het virus van de P1 aan de plaat en het Incubeer gedurende 1 uur in een 27 ° C incubator.</li>
		<li>Herhaal stap 3.8.2 en 3.8.3 te verkrijgen van de P2 en P3 passages van de virussen. Bewaar de P3-virus niet voor meer dan 2 maanden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. eiwit expressie, zuivering met NiNTA en kristallisatie
<ol><li>Cultuur 1 L van Hi5 insect cellen in de voedingsbodems met 100 µg/mL (of 100 I.U./mL) penicilline-streptomycine antibiotica met een dichtheid van 2 x 10,6 op 100 rpm in een 27 ° C incubator shaker. Spin down de cellen bij 570 x g gedurende 5 min, giet het supernatant resuspendeer de cellen in 20 mL van het vers geproduceerde P3-virus en houd het bij kamertemperatuur voor 1 h. voorzichtig schudden de spin fles resuspendeer de cellen 1 x elke 15 min.</li>
	<li>De cellen omzetten in 1 L van voedingsbodems met 100 µg/mL (of 100 I.U./mL) penicilline-streptomycine antibiotica, cultuur van de cellen op 100 rpm in een shaker 27 ° C incubator voor 72 h. Spin down de cellen bij 1,010 x g gedurende 5 min en het supernatant verzamelen.</li>
	<li>PH-indicator voor stroken aan de pH van het supernatans dat tot 8,0 aanpassen door het toevoegen van 0,1 M HCl of 0,1 M NaOH en bindende buffer op een eindconcentratie, met 20 mM Tris buffer met een pH van 8.0, 100 mM NaCl, en 5 mM imidazol toevoegen. Voeg een bepaalde hoeveelheid NiNTA hars (10-40 mL) op basis van de geschatte opbrengst van het uitgedrukt zijn-gelabeld recombinant eiwit.<ol>
<li>Meng de oplossing op een magnetische roer met lage snelheid bij 4 ° C gedurende 1 h. Wash de hars en elueer de afhankelijke eiwitten na de standaard NiNTA zuivering protocol18.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De gezuiverde proteïne onverminderd ionenwisseling en gel filtratie chromatografie, evenals andere eiwit zuivering methoden, om de opbrengst van een homogeen monster. Opmerking: Voor de TDR-ectodomain, 20 mM Tris, pH 8, 100 mM NaCl werden gebruikt als gel filtratie buffer. Voor de PRK3 ectodomain, 20 mM BIB-Tris, pH 6, 100 mM NaCl werden gebruikt als de voorkeurs gel filtratie buffer.</li>
</ol>

<ol><li>Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+using+the+baculovirus-insect+cell+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Protein production using the baculovirus-insect cell expression system.</a> Biotechnology Progress. 30, 1-18 (2014).</li>
<li>Khan, S., Ng, M. L., Tan, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+3a+protein+and+the+assembly+of+coronavirus-like+particles+in+the+baculovirus+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Expression of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 3a protein and the assembly of coronavirus-like particles in the baculovirus expression system.</a> Methods in Molecular Biology. 379, 35-50 (2007).</li>
<li>Possee, R. D., King, L. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17951765">Baculovirus Transfer Vectors.</a> Methods in Molecular Biology. 1350, 51-71 (2016).</li>
<li>Vaughn, J. L., Goodwin, R. H., Tompkins, G. J., McCawley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+establishment+of+two+cell+lines+from+the+insect+Spodoptera+frugiperda+%28Lepidoptera%3B+Noctuidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">The establishment of two cell lines from the insect Spodoptera frugiperda (Lepidoptera; Noctuidae).</a> In Vitro. 13, 213-217 (1977).</li>
<li>Hink, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Established+insect+cell+line+from+the+cabbage+looper%2C+Trichoplusia+ni%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Established insect cell line from the cabbage looper, Trichoplusia ni.</a> Nature. 226, 466-467 (1970).</li>
<li>Davis, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+recombinant+protein+production+of+eight+insect+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Development+Biology+-+Animal%22%5BJournal%5D)">Comparative recombinant protein production of eight insect cell lines.</a> In Vitro Cellular & Development Biology - Animal. 29A, 388-390 (1993).</li>
<li>Wickham, T. J., Nemerow, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+growth+methods+and+recombinant+protein+production+in+BTI-Tn-5B1-4+insect+cells+using+the+baculovirus+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Optimization of growth methods and recombinant protein production in BTI-Tn-5B1-4 insect cells using the baculovirus expression system.</a> Biotechnology Progress. 9, 25-30 (1993).</li>
<li>Davis, T. R., Trotter, K. M., Granados, R. R., Wood, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+expression+of+alkaline+phosphatase+as+a+reporter+gene+for+evaluation+of+production%2C+glycosylation+and+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Baculovirus expression of alkaline phosphatase as a reporter gene for evaluation of production, glycosylation and secretion.</a> Nature Biotechnology. 10, 1148-1150 (1992).</li>
<li>Murphy, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+expression%2C+secretion%2C+and+large-scale+purification+of+recombinant+HIV-1+gp120+in+insect+cell+using+the+baculovirus+egt+and+p67+signal+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Enhanced expression, secretion, and large-scale purification of recombinant HIV-1 gp120 in insect cell using the baculovirus egt and p67 signal peptides.</a> Protein Expression and Purification. 4, 349-357 (1993).</li>
<li>Sun, S. C., Lindstrom, I., Boman, H. G., Faye, I., Schmidt, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolin%3A+an+insect-immune+protein+belonging+to+the+immunoglobulin+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hemolin: an insect-immune protein belonging to the immunoglobulin superfamily.</a> Science. 250, 1729-1732 (1990).</li>
<li>Li, Z., Chakraborty, S., Xu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+CLE+peptide+perception+by+plant+receptors+implicated+from+structural+and+functional+analyses+of+TDIF-TDR+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differential CLE peptide perception by plant receptors implicated from structural and functional analyses of TDIF-TDR interactions.</a> PLoS One. 12, e0175317(2017).</li>
<li>Chakraborty, S., Pan, H., Tang, Q., Woolard, C., Xu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Extracellular+Domain+of+Pollen+Receptor+Kinase+3+is+structurally+similar+to+the+SERK+family+of+co-receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The Extracellular Domain of Pollen Receptor Kinase 3 is structurally similar to the SERK family of co-receptors.</a> Scientific Reports. 8, 2796(2018).</li>
<li>Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+synthesis+of+a+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Total synthesis of a gene.</a> Science. 203, 614-625 (1979).</li>
<li>Bahl, C. P., Marians, K. J., Wu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+for+inserting+specific+DNA+sequences+into+cloning+vehicles%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A general method for inserting specific DNA sequences into cloning vehicles.</a> Gene. 1, 81-92 (1976).</li>
<li>Xu, W., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Vaccine-Derived+Polioviruses%2C+Relevance+for+the+Global+Polio+Eradication+Initiative%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Vaccine-Derived Polioviruses, Relevance for the Global Polio Eradication Initiative.</a> Methods in Molecular Biology. 1387, 213-226 (2016).</li>
<li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Journal of Molecular Biology. 166, 557-580 (1983).</li>
<li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purifying+plasmid+DNA+from+bacterial+colonies+using+the+QIAGEN+Miniprep+Kit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 247(2007).</li>
<li>Reddy, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+the+alpha+subunit+of+the+epithelial+sodium+channel%2C+ENaC%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of the alpha subunit of the epithelial sodium channel, ENaC.</a> Protein Expression and Purification. 117, 67-75 (2016).</li>
<li>Harris, T. J., Emtage, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+heterologous+genes+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Expression of heterologous genes in E. coli.</a> Microbiological Sciences. 3, 28-31 (1986).</li>
<li>Kaur, J., Kumar, A., Kaur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+optimization+of+heterologous+protein+expression+in+E.+coli%3A+Roadblocks+and+reinforcements%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+BIological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Strategies for optimization of heterologous protein expression in E. coli: Roadblocks and reinforcements.</a> International Journal of BIological Macromolecules. 106, 803-822 (2018).</li>
<li>Guo, Y., Yang, F., Tang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Overview+of+Protein+Secretion+in+Yeast+and+Animal+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An Overview of Protein Secretion in Yeast and Animal Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1662, 1-17 (2017).</li>
<li>Blight, M. A., Chervaux, C., Holland, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+secretion+pathway+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein secretion pathway in Escherichia coli.</a> Current Opinion in Biotechnology. 5, 468-474 (1994).</li>
<li>Idiris, A., Tohda, H., Kumagai, H., Takegawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+protein+secretion+in+yeast%3A+strategies+and+impact+on+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineering of protein secretion in yeast: strategies and impact on protein production.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 86, 403-417 (2010).</li>
<li>Wormald, M. R., Dwek, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoproteins%3A+glycan+presentation+and+protein-fold+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Glycoproteins: glycan presentation and protein-fold stability.</a> Structure. 7, R155-R160 (1999).</li>
<li>Geisler, C., Mabashi-Asazuma, H., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Overview+and+History+of+Glyco-Engineering+in+Insect+Expression+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An Overview and History of Glyco-Engineering in Insect Expression Systems.</a> Methods in Molecular Biology. 1321, 131-152 (2015).</li>
<li>Li, Z., Chakraborty, S., Xu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+crystallographic+studies+of+the+extracellular+domain+of+the+first+plant+ATP+receptor%2C+DORN1%2C+and+the+orthologous+protein+from+Camelina+sativa%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F%3A+Structural+BIology+and+Crystallization+Communications%22%5BJournal%5D)">X-ray crystallographic studies of the extracellular domain of the first plant ATP receptor, DORN1, and the orthologous protein from Camelina sativa.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural BIology and Crystallization Communications. 72, 782-787 (2016).</li>
<li>Aricescu, A. R., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+recombinant+glycoproteins+in+mammalian+cells%3A+towards+an+integrative+approach+to+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Expression of recombinant glycoproteins in mammalian cells: towards an integrative approach to structural biology.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23, 345-356 (2013).</li>
<li>Reuter, L. J., Bailey, M. J., Joensuu, J. J., Ritala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale-up+of+hydrophobin-assisted+recombinant+protein+production+in+tobacco+BY-2+suspension+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Scale-up of hydrophobin-assisted recombinant protein production in tobacco BY-2 suspension cells.</a> Plant Biotechnology Journal. 12, 402-410 (2014).</li>
<li>Dohi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+virus-mediated+expression+of+a+foreign+protein+in+suspension-cultured+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Inducible virus-mediated expression of a foreign protein in suspension-cultured plant cells.</a> Archives of Virology. 151, 1075-1084 (2006).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Gezien de diversiteit in grootte en stabiliteit van de duizenden eiwitten aanwezig in de biologische systemen, is het vaak empirische voor een onderzoek laboratorium om te beslissen welk heterologe expressie systeem moet worden gekozen voor de uitdrukking van een specifieke proteïne. Het systeem van E. coli expressie is vaak de eerste keuze voor eiwit expressie als gevolg van de korte levenscyclus van de bacteriën, lage kosten van de voedingsbodems, en het relatieve gemak aan schaal omhoog19</s...

Het is noodzakelijk voor een onderzoekslaboratorium te zijn geschikt voor het produceren van grote hoeveelheden van homogene recombinante eiwitten voor biochemische en biofysische karakteristieken, vooral voor X-ray kristallografische studies. Er zijn vele gevestigde heterologe expressiesystemen zoals Escherichia coli, gist, insect cellen, cellen van zoogdieren, plantencellen, etc. onder hen, het insect cel baculovirus-gemedieerde expressie systeem is een van de meest gebruikte technieken voor de productie van grote hoeveelheden van structureel gevouwen grote recombinante eukaryotische eiwitten voor eiwit kristallisatie1.
De expressievectoren van de baculovirus expressie systemen zijn ontworpen om te bevatten een sterke polyhedrin of P10 promotor voor de productie van een hoog rendement van recombinante intracellulaire eiwitten2,3. Het gen van belang is om een recombinant baculovirus, gekloond in een insect vector met de locus polyhedrin (polh) van het genoom van de multi-nucleopolyhedroviral Autographa californica . De resulterende construct is vervolgens sequenced en de juiste open leesraam (ORF) is geverifieerd. De juiste constructie wordt vervolgens ingevoerd in de gastheercel insecten door het proces van transfectie. Het gen van belang is ingevoegd in het virale genoom homologe recombinatie. Dit evenement resulteert in de productie van de recombinante virale genoom, die vervolgens wordt gerepliceerd naar het produceren van recombinant bloesem virus deeltjes1.
Het insect cellen die het meest worden gebruikt in de expressie systemen zijn Sf9 en hoge vijf (Hi5) cellen. Sf9 cellen zijn een klonale isolaat van Sf21, afgeleid van de pop ovariale cellen van Spodoptera frugiperda, en Hi5 cellen zijn een klonale isolaat afgeleid van de ouderlijke Trichoplusia ni ovariële cel lijn TN-3684,5. Co transfections, virus versterking en plaque tests worden uitgevoerd op Sf9 cellen, terwijl Hi5 cellen zijn meestal geselecteerd voor de productie van grotere hoeveelheden van recombinante eiwitten6. Het is vermeldenswaard dat de Hi5 cellen niet geschikt voor het genereren en versterking van virus nakomelingschap vanwege hun neiging zijn tot mutant virussen. Traditioneel, een temperatuurbereik van 25-30 ° C wordt beschouwd als goed voor de teelt van insect cellen. Er is echter gemeld dat 27-28 ° C de optimale temperatuur voor het insect cel groei en infectie7,8 is.
De invoering van een krachtig signaal reeks voorafgaand aan het gen is nodig voor de hoge expressie van de secreted eiwitten. De volgorde van het signaal zou efficiënt begeleiden de vertaalde recombinante eiwitten in het endoplasmatisch reticulum voor eiwit secretie en posttranslationele modificaties noodzakelijk voor goede vouwen en stabilisatie3. Signaal peptide reeksen, hebben zoals de baculovirus omhullen eiwit GP64/67, honingbij melittin, en anderen, uitgekozen om de uitdrukking van secretoire recombinant eiwit in de uitdrukking baculovirus-gemedieerde systemen3. De invoering van de signaal-peptide van GP67 is aangetoond dat het verbeteren van het rendement van de expressie van een secreted recombinant eiwit, in vergelijking met het gebruik van de intrinsieke signaal peptide van de doelgroep gene9. Hemolin is een Hemolymfe proteïne van de gigantische zijde vlinder Hyalophora cecropia, geïnduceerde op bacteriën infectie10. Vanwege de relatief hoge niveau van geïnduceerde expressie, kan het signaal peptide sequentie van het gen worden gebruikt om te bemiddelen de expressie van de secretie van de recombinante eiwitten in het baculovirus-insect cell systeem.
De A. thaliana Tracheary Element differentiatie remmende Factor Receptor (TDR) en stuifmeel Receptor Kinase 3 (PRK3) beide tot de familie van de herhaling Receptor-achtig Kinase (LRR-RLK) plant Leucine-rijke eiwitten11,12 behoren . Om de structuur en functie van deze familie van receptor eiwithoudende gewassen, alsmede over het vergemakkelijken van de structurele en Biochemische karakterisering van andere plantaardige uitgescheiden eiwitten te bestuderen, is het baculovirus-insect cel expressie systeem gewijzigd om te verbeteren eiwit kwaliteit en productie opbrengst. De extracellulaire domeinen van zowel de TDR en de PRK3 is met succes geuit met behulp van twee gewijzigde expressievectoren in het baculovirus-insect cel expressie systeem. Zowel de extracellulaire domeinen van TDR en PRK3 eiwitten hebben is uitgekristalliseerd. Dit artikel rapporteert de uitdrukking en de zuivering van grote hoeveelheden van recombinante secreted plantaardige eiwitten met twee gewijzigde baculovirus expressievectoren door het opnemen van een GP67 of een hemolin signaal reeks tussen de promotor en meerdere klonen sites.

<table><tbody><tr><td>Incubator shaker</td><td>VWR</td><td>Model Excella E25</td><td>27 oC</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>VWR</td><td>Model 2005</td><td>27 oC</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>BECKMAN</td><td>Model J-6</td><td>met een swing bucket rotor</td></tr><tr><td>Herculase II Fusion DNA Polymerase</td><td>Agilent</td><td>600677-51</td><td>Voor PCR-amplificatie van DNA</td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td>BIO-RAD</td><td>Model C1000 Touch</td><td>Voor PCR-amplificatie van DNA</td></tr><tr><td>Incubator shaker</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Model I 24</td><td>Voor het kweken van bacteriecultuur</td></tr><tr><td>Klant DNA-synthese</td><td>GENSCRIPT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI (HF)</td><td>New England Biolabs</td><td>R3136S</td><td>Restrictie-endonuclease</td></tr><tr><td>BglII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144S</td><td>Restrictie-endonuclease</td></tr><tr><td>NotI (HF)</td><td>New England Biolabs</td><td>R3189S</td><td>Restrictie-endonuclease</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td>Restrictie-endonuclease</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202T</td><td>DNA-ligatie</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>DNA-zuivering van Agorase-gel</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Plasmiid-DNA-zuivering uit bacteriecultuur</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15510-019</td><td>Voor DNA-gelelektroforese</td></tr><tr><td>MAX Efficiency DH5&alpha; competente cel</td><td>Invitrogen</td><td>18-258-012</td><td>Voor transformatie van DNA-ligatiemengsel</td></tr><tr><td>Lennox L LB Broth</td><td>Research Product International Corp.</td><td>L24066-5000.0</td><td>Voor het maken van bacteriecultuur</td></tr><tr><td>Ampicilline natriumzout</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11593-019</td><td>Antibiotica</td></tr><tr><td>Kanamycin Sulfaat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15160-054</td><td>Antibiotica</td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>64-75-5</td><td>Antibiotica</td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15710-064</td><td>Antibiotica</td></tr><tr><td>MAX Efficiency DH10Bac competente cellen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10361-012</td><td>Voor het maken van bacmid-DNA</td></tr><tr><td>S.O.C. Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15544-034</td><td>Voor DNA-transformatie</td></tr><tr><td>CellFECTIN II Reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10362-101</td><td>Insectenceltransfectie reagens</td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Expressiesysteem</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10359-016</td><td>Baculovirus-insectencellen expressiekit</td></tr><tr><td>Bluo-gal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15519-028</td><td>Voor isolatie van recombinant Bacmid-DNA</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15529-019</td><td>Voor isolatie van recombinant Bacmid-DNA</td></tr><tr><td>pFastBac1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10360014</td><td>Baculovirus expressievector</td></tr><tr><td>Sf9 cellen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11496015</td><td>Sf9 monolaag cellen</td></tr><tr><td>Hi5 cellen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B85502</td><td>High Five insectencellen</td></tr><tr><td>Grace&rsquo;s insect medium, ongesupplementeerd</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11595030</td><td>Minimale Sf9 celtransfectie medium</td></tr><tr><td>Grace&rsquo;s insect medium, gesupplementeerd</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11605102</td><td>Volledige Sf9 monolaag celcultuur medium</td></tr><tr><td>Sf-900 II SFM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10902104</td><td>Sf9 suspensie celcultuur medium zonder FBS</td></tr><tr><td>Express Five SFM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10486025</td><td>Hi5 celcultuur medium</td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>100 ml (10.000 I.U./ml)</td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>FBS Gecertificeerd</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000-044</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>6-well plates</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td>Vlakbodem</td></tr><tr><td>150 mm platen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>353025</td><td>100/verpakking</td></tr><tr><td>1,5 ml Microcentrifugebuizen</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2500</td><td>500 buizen/zak</td></tr><tr><td>15 ml kegelvormige schroefdop centrifugebuizen</td><td>USA Scientific</td><td>1475-0511</td><td>25 buizen/zak</td></tr><tr><td>50 ml kegelvormige schroefdop centrifugebuizen</td><td>USA Scientific</td><td>1500-1211</td><td>25 buizen/zak</td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td>NiNTA hars</td></tr><tr><td>pH-indicator strips</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>1.09535.0001</td><td>pH 0 - 14</td></tr></tbody></table>

wijzigen baculovirus expressievectoren voor de productie van plantaardige eiwitten in insect cellen uitgescheiden

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Het is een uitdaging voor de wetenschappers uitspreken recombinant secretoire eukaryotische eiwit voor structurele en biochemische studies geweest. Het insect cel baculovirus-gemedieerde expressie systeem is een van de systemen die worden gebruikt om uit te drukken van recombinante eukaryotische secretoire eiwitten met sommige posttranslationele modificaties. De secretoire eiwitten moeten worden gerouteerd via de secretoire trajecten voor eiwit glycosylatie, disulfide bindingen vorming en andere posttranslationele modificaties. Ter verbetering van de bestaande insect cel uitdrukking van secretoire plantaardige eiwitten, wordt een baculovirus expressie vector gewijzigd door de toevoeging van hetzij een GP67 of een hemolin signaal peptide sequentie tussen de promotor en klonen van meerdere sites. Dit nieuw ontworpen gemodificeerde vector-systeem met succes geproduceerd van een hoog rendement van oplosbare recombinante secreted receptor eiwithoudende gewassen van Arabidopsis thaliana. Twee van de geuite plantaardige eiwitten, de extracellulaire domeinen van Arabidopsis TDR en PRK3 plasmamembraan receptoren, werden kristalliseerde voor X-ray kristallografische studies. Het systeem gemodificeerde vector is een verbeterd gereedschap die potentieel kan worden gebruikt voor de expressie van recombinante secretoire eiwitten in het dierenrijk alsmede.

Zoals aangegeven in Figuur 1, werden twee gewijzigde pFastBac1 baculovirus expressievectoren gebruikt om uit te drukken de secreted eiwitten met de GP67 of de hemolin signaal volgorde ter vervanging van de intrinsieke signaal sequentie van de target-gen. De virale GP67 en de insecten hemolin genen hebben aangetoond dat hoge secretie expressie niveaus in de cellen. Fusion eiwitten met een van deze twee reeksen van het signaal wordt verwacht dat de secretie exp...

Hier presenteren we de protocollen voor het gebruik van het insect cel en baculovirus eiwit expressie systeem voor de productie van grote hoeveelheden uitgescheiden eiwithoudende gewassen voor eiwit kristallisatie. Een vector baculovirus expressie is gewijzigd met GP67 of insect hemolin signaal peptide voor plant secretie eiwituitdrukking in insect cellen.

Wijzigen Baculovirus expressievectoren voor de productie van plantaardige eiwitten in Insect cellen uitgescheiden

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van biochemie en structurele biologie van uitgescheiden eiwitten, zoals eiwitstructuurbepaling door kristallografie en cryo-EM. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een grote hoeveelheid recombinante uitgescheiden eiwitten produceert met relatief lage kosten voor eiwitstructuurbepaling. Eerst, synthetiseer een DNA-fragment dat een vijf prime BglII-snijplaats bevat, de secretiesignaalsequentie van belang in een multi-kloonzaitplaats zoals beschreven in het tekstprotocol.Vervolgens verteer je vier microgram van het DNA met BglII en X1, en vier microgram van een expressievector-DNA met BamH1 en X1. Meng 10 eenheden van elk restrictie-enzym met het DNA in een 1X concentratie reactiebuffer. Incubeer gedurende vier uur bij 37 graden Celsius. Voeg 10 microliters van een ligatiereactiemengsel toe dat 1X T4 DNA Ligase reactiebuffer en vijf eenheden T4 DNA Ligase bevat aan een verse 1,5 milliliter Eppendorfbuis.Voeg vervolgens 100 nanogram van het gelinieerde vector-DNA en 400 nanogram van het verteerde DNA-fragment toe. Incubeer gedurende 16 uur bij 16 graden Celsius. Transformeer vijf microliters van het ligatiemengsel in 100 microliters DH5 alpha competente cellen en selecteer de resulterende kolonies op een Ampicilline LB agarplaat zoals beschreven in het tekstprotocol.Pluk tussen de vijf en 10 kolonies en breng elk over naar twee milliliter LB medium dat 100 microgram per milliliter ampicilline bevat. Laat deze kolonies groeien in een schudende incubator bij 220 rpm bij 37 graden Celsius gedurende 16 uur. Gebruik vervolgens een DNA Miniprep kit om elk plasmide DNA te extraheren.Bevestig de klonen door DNA-sequencing met een voorwaartse sequencing primer zoals beschreven in het tekstprotocol. Gebruik 100 nanogram van het constructplasmide, transformeer 40 microliters DH10Bac competente cellen zoals beschreven in het tekstprotocol. Incubeer de transformatieplaten gedurende 48 uur bij 37 graden Celsius.Neem twee witte kolonies van elke transformatieplaat en inoculeer elke kolonie in twee milliliter LB medium dat kanamycine, gentamicine en tetracycline bevat. Extraheer en verifieer het bacmid DNA zoals beschreven in het tekstprotocol. Verdeel elk DNA in twee buisjes met 20 microliters dat naar elke buis wordt overgebracht.Bewaar de buisjes vervolgens bij min 20 graden Celsius totdat u klaar bent om verder te gaan. Alle volgende stappen moeten aseptisch worden uitgevoerd. Laat een monolaag van Sf9 cellen groeien in een zes-well plaat in het kweekmedium met 10% foetaal bovien serum en 100 microgram per milliliter Penicilline-Streptomycine antibiotica bij 27 graden Celsius tot 80% confluency.Voeg voor elke transfectie 100 microliter ongesupplementeerd Sf9 celkweekmedium zonder antibiotica toe aan een 1,5 milliliter centrifugeerbuisje. Verdun 20 microliter van het bacmid DNA in elke buis en klop zachtjes om te mengen. Voeg vervolgens 100 microliter ongesupplementeerd Sf9 celkweekmedium zonder antibiotica toe aan een 1,5 milliliter buisje voor elke transfectie.Verdun acht microliter van het lipidetransfectiereagens in elke buis en meng door zes keer grondig op en neer te pipetteren. Combineer deze twee oplossingen en meng ze door langzaam op en neer te pipetteren drie keer. Laat 20 tot 40 minuten bij kamertemperatuur incuberen.Was elke put van de kweekplaat twee keer met drie milliliter ongesupplementeerd Sf9 kweekmedium zonder antibiotica voor elke wasbeurt. Voeg vervolgens 0,8 milliliter ongesupplementeerd Sf9 celkweekmedium zonder antibiotica toe aan elke buis die het lipide DNA mengsel bevat. Pipet langzaam op en neer drie keer om te mengen.Aspibeer het wasmedium van de platen en bedek de monsters met het transfectiemengsel. Incubeer de getransfecteerde plaat gedurende vijf uur bij 27 graden Celsius. Vervang vervolgens het transfectiemedium door het complete Sf9 celkweekmedium dat 10%FBS en 100 microgram per milliliter Penicilline-Streptomycine antibiotica bevat.Incubeer gedurende vier dagen bij 27 graden Celsius. Verzamel vervolgens de supernatant in een steriele 15 milliliter conische buis. Centrifugeer gedurende vijf minuten bij 1.010 keer g om het cellulaire puin te verwijderen.Gooi de pellet weg en giet de supernatant in een schone buis. Bewaar bij vier graden Celsius gedurende maximaal een jaar of totdat u klaar bent om te gebruiken. Om elk recombinant virus te versterken, laat eerst een monolaag van Sf9 cellen groeien op een 150 millimeter plaat tot 80% confluency.Vervolgens aspibeer je het medium en voeg je twee milliliter van het P0 virus toe aan elke put. Incubeer gedurende een uur in een 27 graden Celsius incubator, wieg de plaat elke 15 minuten om het medium met de cellen te mengen. Voeg vervolgens 25 milliliter compleet Grace's Media toe dat 10%FBS en 100 microgram per milliliter Penicilline-Streptomycine antibiotica bevat.Incubeer de plaat gedurende drie dagen in een 27 graden Celsius incubator om het P1 passage virus te verkrijgen. Verzamel vervolgens de supernatant in een steriele 50 milliliter conische buis. Centrifugeer gedurende vijf minuten bij 1.010 keer g om het cellulaire puin te verwijderen.Giet de supernatant in een schone buis en bewaar bij vier graden Celsius gedurende maximaal een jaar of totdat u klaar bent om te gebruiken. Om het virus van P1 naar P2 passage te versterken, laat eerst een monolaag van Sf9 cellen groeien op een 150 millimeter plaat tot 90% confluency. Zodra de gewenste confluency is bereikt, aspibeer je het medium.Voeg twee milliliter van het P1 virus toe en incubeer gedurende een uur in een 27 graden Celsius incubator. Herhaal de versterkingsstappen om de P2 en P3 passages van het virus te verkrijgen. In deze studie worden twee gemodificeerde pFastBac1 baculovirus expressievectoren gebruikt om de uitgescheiden eiwitten te expresseren met ofwel de gp67 of de hemolin signaalsequentie door de intrinsieke signaalsequentie van het

modifying-baculovirus-expression-vectors-to-produce-secreted-plant

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Eiwitcomplexen katalyseren belangrijke cellulaire functies. Gedetailleerde functionele en structurele karakterisering van vele essentiële complexen vereist recombinante productie. MultiBac is een baculovirus / insectencelsysteem vooral afgestemd voor het uitdrukken van eukaryote eiwitten en hun complexen. MultiBac werd geïmplementeerd als een open-access platform en standaard operationele procedures ontwikkeld om het nut te maximaliseren.

De MultiBac Protein Complex Production Platform in het EMBL

Planten bieden een nieuw systeem voor de productie van farmaceutische eiwitten op commerciële schaal die is beter schaalbaar, kostenefficiënte en veilige dan de huidige expressie paradigma. In deze studie, rapporteren we een eenvoudig en handig, toch schaalbare aanpak van target-gen-bevattende...

Efficiënte Agroinfiltration van planten voor High-level Tijdelijke expressie van recombinante eiwitten

Hier beschrijven we een manier om correct gevouwen en functionele oppervlak influenzavirus-antigenen afgeleid van de nieuwe Chinese H7N9 virus in insectencellen uiten. De techniek kan worden aangepast aan ectodomeinen van elke virale of cellulaire oppervlakte-eiwitten tot expressie.

Expressie van Functionele Recombinant Hemagglutinine en neuraminidase Eiwitten uit de roman H7N9 Influenza Virus Met de baculovirusexpressiesysteem

Voorbijgaande eiwitproductie in Nicotiana planten op basis van vacuüm infiltratie met Agrobacteriën uitvoeren lancering vectoren (tabak mozaïek virus-based) is een snelle en economische benadering van vaccin antigenen en therapeutische eiwitten te produceren. We vereenvoudigde de procedure en verbeterd doel accumulatie door het optimaliseren van de voorwaarden van bacteriën kweken, selecteren gastheer soorten, en co-introduceren van RNA-silencing onderdrukkers.

Optimalisatie en het gebruik van<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Gemedieerde Transient eiwitproductie in<em&gt; Nicotiana</em

Kindlins fundamenteel celadhesie door integrines maar studies ervan werden gehinderd door de moeilijkheid erin recombinante expressie in bacteriële gastheren. We beschrijven hier werkwijzen voor de efficiënte productie in baculovirus-geïnfecteerde insectencellen.

Efficiënte productie en zuivering van recombinant muizen Kindlin-3 uit Insect Cellen voor Biofysische Studies

In deze studie werd de expressie van een doelgerichte humane recombinante eiwit in verschillende productieplatforms vergeleken. We concentreerden ons op traditionele fermentor-gebaseerde culturen en op planten, waarbij we de instelling van elk systeem beschreven en, op basis van de gerapporteerde resultaten, de inherente grenzen en voordelen voor elk platform benadrukten.

Een vergelijkende analyse van recombinant eiwit expressie in verschillende biofactories: Bacteriën, Insect Cells and Plant Systems

Nonlytic insectencel expressiesystemen onderbenut productie, cellulair transport / lokalisatie en recombinante eiwitten functionele analyse. We beschrijven werkwijzen voor expressievectoren en transiënte daaropvolgende eiwitexpressie genereren handel verkrijgbaar Lepidoptera cellijnen. De co-localisatie van Bemisia tabaci aquaporins met fluorescente subcellulaire markereiwitten wordt gepresenteerd.

Transiënte expressie en cellulaire lokalisatie van recombinante eiwitten in gekweekte insectencellen

Dit protocol beschrijft een warmte schok-geïnduceerde proteïne expressie systeem (pDHsp/V5-zijne/sf9 cel), die kan worden gebruikt voor het uitdrukken van vreemde proteïnen of evaluatie van de anti-apoptotic activiteit van potentiële buitenlandse eiwitten en hun afgeknotte amino zuren in insect cellen.

Voorbijgaande expressie van buitenlandse genen in Insect cellen (sf9) voor eiwit functionele Assay

In dit protocol is baculovirus geproduceerd door voorbijgaande transfectie van baculovirus plasmide in Sf9 cellen en versterkt in een serumvrij schorsing cultuur. De bovendrijvende substantie is gezuiverd door de chromatografie van de affiniteit van heparine en verder geconcentreerd door ultracentrifugatie. Dit protocol is handig voor de productie en zuivering van baculovirus voor gen-therapie-toepassing.

Productie en zuivering van Baculovirus voor toepassing van de gentherapie

De zuivering van ionenkanalen is vaak uitdagend, maar eenmaal bereikt, kan het potentieel toestaan in vitro onderzoeken van de functies en structuren van de kanalen. Hier beschrijven we de stapsgewijze procedures voor de expressie en de zuivering van eiwitten van zoogdieren bestrophin, een familie van Ca2 +-geactiveerd Cl- -kanalen.

Meningsuiting en zuivering van zoogdier Bestrophin ionenkanalen

Het baculovirus expressie vectorsysteem (BEVS) is een robuust platform voor expressiescreening en productie van eiwit arginine methyltransferases (PRMT's) voor biochemische, biofysische en structurele studies. Milligram hoeveelheden materiaal kunnen worden geproduceerd voor de meerderheid van PRMT's en andere eiwitten van belang die een eukaryotische expressie platform vereisen.

Productie van recombinante PRMT-eiwitten met behulp van het Baculovirus Expression Vector System

Leer baculovirus-expressievectoren modificeren voor productie van plantaardige eiwitten in insectencellen. Deze kosteneffectieve methode ondersteunt structurele biologie en eiwitkristallisatieonderzoek.

Wijzigen Baculovirus expressievectoren voor de productie van plantaardige eiwitten in Insect cellen uitgescheiden

Meer video's verkennen