Het snijden en drijvende methode voor paraffine-ingebedde weefsel voor het segmenteren
5 september 2018
Hier presenteren we een protocol om paraffine segmenteren. Deze methode combineert snijden en zwevende met behulp van een eenvoudige thermostatische kamer om te voorkomen dat het proces van de overdracht vereist met de conventionele methode. Dientengevolge, waren de efficiëntie en het aantal intact paraffine secties sterk verbeterd.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het morfologische veld, zoals paraffine-sectie. Het grote voordeel van deze techniek is dat het snijden en de vouwprocedure culmineren en het overdrachtsproces vermijden dat vereist is door de conventionele methode. Om te beginnen, verzamel alle voorgefabriceerde onderdelen in een afzuigkap.
Gebruik chloroform om de zeven acrylplaten te combineren, zoals hier getoond. Het eindproduct zal een tank zijn uitgerust met een sectiekanaal en een waterbad. Installeer het buisvormige elektrische verwarmingselement door het gat in acrylplaat nummer twee.
Maak met een elektrische boor een klein gaatje in acrylplaat nummer zeven en installeer een digitaal thermostaat op de tank, ervoor zorgen dat het minimaal een centimeter onder het niveau van het beoogde wateroppervlak is, wat wordt aangegeven door de zwarte stip op de tank. Pas de spanning aan zodat deze lager is dan 24 volt voordat u de apparatuur inschakelt. Verwijder de sectie-afvallade uit de microtoom.
Gebruik vervolgens neutrale siliconenkit om het sectiekanaal te verbinden met de bladhouder van de microtoom, zorg ervoor dat er geen kit boven de bovenkant van het mes komt. Laat de opstelling een nacht drogen om het chloroform en de neutrale siliconenkit de tijd te geven om te stollen. Installeer de volgende dag het mes in de bladhouder.
Voeg water toe aan het waterbad, zorg ervoor dat het wateroppervlak net de bovenkant van het mes raakt. Na het uitvoeren van conventionele paraffine-sectie, schakel de apparatuur in om de verbeterde paraffine-sectie te beginnen. Gebruik de temperatuurdetectieschakelaar om de verwarming te openen.
Stel de beoogde temperatuur in op tussen de 38 graden Celsius en 40 graden Celsius gedurende één uur om het water op te warmen. Gebruik een mes om de paraffineblok aan te passen die is verkregen door paraffine-inbedding. Plaats vervolgens de blok op de cassetteklem van de microtoom en vergrendel hem.
Snij de dikkere secties om snel het monster te benaderen. Pas aan tot een geschikte dikte van de sectie voor de monsters. Door de handwiel te draaien, worden de secties automatisch in het sectiekanaal en het bad geladen.
Sectieer vervolgens het specimen in een langzame en uniforme snijbeweging. Leid de secties in het badkamertje zodat ze in een lijn blijven drijven. Als de hoofdsectie zich aan de kamerwand hecht, gebruik dan een penseel om het drijvend te houden.
Nadat de secties zich volledig in het waterbad hebben ontvouwd, gebruik pincetten om er verschillende te scheiden en pak ze vervolgens op een microscoopglaasje. Breng de glazen over naar een oven ingesteld op 42 graden Celsius om een nacht te drogen. De glazen kunnen dan op kamertemperatuur worden bewaard totdat ze klaar zijn om te worden geanalyseerd.
Wanneer u klaar bent om te analyseren, gebruik hematoxiline-eosinekleuring om de secties te evalueren met behulp van de verbeterde methode. In dit onderzoek wordt een verbeterde methode gebruikt om paraffine-secties voor volwassen muis hippocampaal weefsel, volwassen muisnieren, embryonale muishersens en zebravisogen voor te bereiden. Zoals hier getoond wordt, vermijdt de nieuwe methode sectieverlies en verhoogt de verhouding van intacte secties in elk type onderzochte weefsel.
Bij het uitvoeren van gehele-serie secties wordt gezien dat deze methode de paraffine-sectiesnelheid in alle geteste monsters versnelt. Met andere woorden, deze methode biedt hogere kwaliteit paraffine-sectie in minder tijd dan de conventionele methode. Serie-secties van zebravis optische retina worden vervolgens waargenomen door hematoxiline-eosinekleuring.
De secties die zijn geoogst met de verbeterde methode hebben een betere integriteit dan die geoogst met de conventionele paraffine-sectiemethode. Hoewel er geen significante verschillen zijn in de kwaliteit van de meeste geoogste secties bij het vergelijken van deze twee methoden, zijn sommige secties die zijn geoogst met de conventionele methode van relatief lage kwaliteit. Vergeet niet dat het werken met chloroform buitengewoon gevaarlijk kan zijn, en voorzorgsmaatregelen zoals een afzuigkap moeten altijd worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure.
Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden, voeg voorzichtig water toe en vermijd overvulling.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol dat is ontworpen om paraffine secties te verbeteren door het combineren van snijden en drijven binnen een thermostatische kamer, waardoor de traditionele overdrachtsprocedure overbodig wordt. Deze aanpassing verbetert zowel de efficiëntie als de integriteit van paraffine secties aanzienlijk.
Belangrijkste Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Histologie
- Neurowetenschap
- Paraffine Sectietechnieken
Achtergrond
- Conventionele paraffine sectie omvat meerdere overdrachtsstappen, wat vaak leidt tot verlies van secties.
- De nieuwe methode stroomlijnt het proces en verbetert het rendement van intacte secties.
- Verbeterde sectietechnieken zijn cruciaal voor nauwkeurige morfologische analyse in verschillende biologische weefsels.
Doel van Studie
- Om een protocol te presenteren dat het aantal intacte paraffine secties verhoogt.
- Om de tijd die nodig is voor paraffine sectie in biologisch onderzoek te verkorten.
- Om een betere analyse van muis- en zebravisweefsels mogelijk te maken.
Gebruikte Methoden
- Het artikel beschrijft een methode die een thermostatische kamer voor sectie omvat.
- Paraffine inbedding en sectie van adulte muishippocampusweefsel, nieren, embryonale muishersens en zebravisogen werd uitgevoerd.
- Temperatuurinstellingen en specifieke installatie-stappen voor het apparaat worden beschreven.
- Kritische stappen omvatten de zorgvuldige installatie van verwarmingselementen en sectieprocedures.
- Secties worden vervolgens gekleurd met hematoxyline-eosine voor evaluatie.
Belangrijkste Resultaten
- Het protocol levert hogere kwaliteit secties op met verminderde verliezen in vergelijking met conventionele methoden.
- Verbeterde integriteit van secties werd waargenomen in verschillende weefselsoorten, met name zebravis optische retina en muisweefsels.
- De methode versnelt het paraffine sectieproces terwijl de kwaliteit behouden blijft.
Conclusies
- Deze studie biedt een efficiënter protocol voor paraffine sectie dat de integriteit van weefselmonsters bevordert.
- Het bevordert morfologische studies door hogere kwaliteit resultaten in een kortere tijdsperiode te garanderen.
- De implicaties zijn belangrijk voor onderzoekers die afhankelijk zijn van nauwkeurige sectietechnieken voor histologische analyse.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Paraffin sectioning remains a bottleneck in histology workflows, particularly for high-throughput target validation and phenotypic screening in discovery biology. This method improves section integrity and throughput, reducing technical variability that can confound downstream assay readouts and mechanistic de-risking efforts. By enabling reliable, reproducible tissue preparation, it supports predictive confidence in target engagement studies across neuroscience and oncology models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through high-integrity tissue morphology for target localization and pathway analysis.
- Operational Value: Reduces section loss and manual transfer steps, increasing usable tissue yield per experiment.
- Predictive Value: Supports consistent histological readouts critical for target engagement and mechanism-of-action studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, intact sections suitable for immunohistochemistry and in situ hybridization assays.
- Operational Value: Streamlines sectioning workflow, allowing junior operators to maintain quality and consistency.
- Assay Readiness: Enables reliable compound evaluation by minimizing tissue artifacts that interfere with signal detection.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains morphological fidelity across disease-relevant systems, including murine and zebrafish tissues.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery through preclinical validation with reduced technical failure.
- Risk Mitigation: Lowers biological noise in longitudinal studies, supporting risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation to lead optimization, where reliable histology informs go/no-go decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via intact tissue sections for target validation and biomarker co-localization.
- Screening: Enhances assay reproducibility by delivering uniform sections for quantitative imaging and staining.
- Analytics: Generates high-quality morphological data enabling accurate comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Promotes preclinical continuity through consistent tissue preparation across species and developmental stages.
- Enterprise Reuse: Represents a scalable, low-cost capability applicable across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing section loss and improving morphological integrity.
- Operational Value: Standardizes sectioning through simplified equipment and reduced operator dependency.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by accelerating histology workflows and reducing reagent waste from failed sections.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through reliable histological data for target validation and safety pharmacology.
Implementation Considerations
- Requires basic histology expertise and familiarity with microtome operation and paraffin embedding.
- Needs standard laboratory equipment including microtome, oven, and staining reagents, plus custom acrylic chamber assembly.
- Demands cross-team standardization of section thickness, temperature control, and water bath preparation for reproducibility.
- Adaptation considerations include tissue-specific optimization of cutting speed and section thickness for varied sample densities.
- Practical limitations include safe handling of chloroform during assembly, necessitating fume hood use and proper ventilation.
