Stijve inbedding van vaste en gekleurd, geheel Millimeter-schaal Specimens voor sectie-gratis 3D histologie door Micro-berekend tomografie
17 oktober 2018
Wij protocollen ontwikkeld en ontworpen een aangepaste apparatuur om insluiten van millimeter-schaal specimens. We presenteren monsterbereidingsprocedures met de nadruk op het insluiten in acryl hars en polyimide buizen om rigide immobilisatie en langdurige opslag van specimens voor de ondervraging van architectuur en cel morfologie van weefsels door micro-CT.
Deze methode stelt u in staat om driedimensionale histologische beelden te genereren uit kleine millimetermonsters, waaronder kleine modelorganismen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de ingebedde monsters zijn zeer stabiel, zodat u de monsters te houden voor langere tijd en om ze beeld meerdere keren, zeggen met verschillende beeldvormende methoden over jaren. De output van deze methode zal zeer nuttig zijn voor hoge doorvoer model systeem fenomics, toxicologie, en potentieel zelfs menselijk weefsel diagnostiek.
Over het algemeen individuen nieuw op deze methode zal worstelen, omdat de monsters zijn relatief klein en moeilijk te oriënteren of manoeuvreren. Visuele demonstratie is van cruciaal belang omdat aandacht nodig is om monsterschade te voorkomen. Voor jonge of oudere zebravissen, verhonger ze gedurende ten minste 24 uur om het volume van de darminhoud voorafgaand aan fixatie te verminderen.
Verplaats 10% neutrale buffer formaline of NBF en 2x Tricaine-S voorgekoeld tot vier graden Celsius op ijs. Verdubbel het viswatervolume met gekoelde 2x MS-222 voor snelle en humane euthanasie. Zestig seconden nadat de vissen zijn gestopt met bewegen, na humane euthanasie, plaats de vis in gekoelde 10%NBF oplossing in platte bodem glazen flesjes op kamertemperatuur, en bevestig ze 's nachts.
Spoel op de tweede dag de vaste vismonsters drie maal in 1x PBS pH 7.4 gedurende 10 minuten per stuk. Dompelen de monsters na het wassen onder in 35% ethanol en broed gedurende 20 minuten op kamertemperatuur met zachte agitatie. Herhaal deze stap dan met 50% ethanol.
Incubeer de monsters in vers bereide 0,3%fosphotungsten zuur of PTA oplossing 's nachts bij kamertemperatuur met zachte agitatie om ze te bevlekken. Begin de derde dag met het bereiden van een één-op-één volume-per-volume mengsel van 100% ethanol en LR witte acrylhars. Spoel de monsters drie keer in 70% ethanol gedurende 10 minuten per stuk, dan incubeer de monsters in 90% ethanol bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten met zachte agitatie.
Herhaal de incubatie onder dezelfde voorwaarden, maar 95%ethanol en vervolgens nog twee keer met 100% ethanol. Aan het einde, dompel de monsters in een-op-een ethanol en LR witte acryl hars mengsel, en incubeer bij kamertemperatuur 's nachts met zachte agitatie. Op de vierde dag, verwijder het mengsel uit de flacon, en voeg 100% LR witte hars om de monsters onder te dompelen.
Incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur met zachte agitatie. Vervang na twee uur de hars door verse 100%LR witte hars en broed gedurende een uur bij kamertemperatuur met zachte agitatie. Gebruik de poly MI-slang voor het monteren van het inbeddingsapparaat met een diameter van ten minste 0,1 millimeter groter dan de diameter van het monster en snijd deze tot een standaardlengte van 30 millimeter.
Bevestig vervolgens een P1000 micro-pipe kop aan het witte uiteinde van de inbedding adapter en steek de poly MI slang aan zijn smalle einde. Nadat de monsters hebben geïncubeerd voor een uur in 100% LR witte hars, breng ze naar een kleine weegboot en volledig onderdompelen in 100% LR witte hars. Richt de slang van het inbeddingsapparaat aan het brede uiteinde van het vaste monster, of naar het hoofd, en pipet het monster langzaam in de slang.
Plaats het monster in het midden van de slang en zorg ervoor dat de slang boven en onder het monster is gevuld met hars. Onmiddellijk na, om het open uiteinde van de slang te verzegelen, plat een stuk van olie gebaseerde zachte modellering klei in een vel ongeveer een millimeter dik en stabiliseren de slang tussen wijs- en middelvingers. Druk vervolgens langzaam de klei tegen het einde van de slang met duim, en verwijder eventuele overtollige klei.
Verwijder het inbeddingsapparaat uit de micropijpkop. Trek de slang door zachte rotatie. Terwijl het houden van een vinger tegen het verzegelde eind om de uitwerping van de klei te verhinderen, verzegel het andere eind door het onverzegelde eind van de buizen in de klei langzaam te duwen.
Plaats de slang horizontaal op een buisrek en laat de hars 24 uur polymeriseren bij 65 graden Celsius in de oven. Aan het einde van de volgende dag, verzamel de monsters voor het verwerven van afbeeldingen. Een met succes ingebede zebravislarve heeft geen luchtbellen gevangen.
Als lucht tijdens het inbeddingsproces vastzit, kan het naar het monster bewegen als het monster niet horizontaal wordt geplaatst tijdens de polymerisatie, wat de beeldkwaliteit kan verslechteren. Dit protocol was succesvol in het inbedden van verschillende modelorganismen. Zoals zebravissen, Drosophila, Daphnia en muizenembryo.
De succesvolle inbedding kan worden getoond met gereconstrueerde, 3D-renderings, afgebeeld door micro-CT-scan voor zebravissen, Daphnia en Drosophila. Insluiten van hars kan worden gezien in alle scans buiten het monster, maar interfereert niet met het monster zelf. Deze exemplaren kunnen voor langere tijd worden bewaard en hergebruikt voor meerdere beeldvormingssessies, zoals blijkt uit de in 2011 afgebeelde zebravislarve.
En dan weer in 2013. Anatomische kenmerken worden bewaard na de opslag, zoals te zien op close-ups van spieren van beide scans. Bovendien, intensiteit profielen genormaliseerd naar hun overeenkomstige gemiddelden langs gesegmenteerde lijnen, toont ruimtelijk overeenkomende lokale pieken in beide scans.
De gemiddelde intensiteitswaarden voor geselecteerde regio's in beide scans werden gedeeld door een gemiddelde voor achtergrond en gebruikt om signaal-ruisverhoudingen te genereren, die goed overeenkwamen tussen de scans. Tijdens een poging tot deze methode is het belangrijk om voorzichtig te werken om monsterschade te voorkomen en zorgvuldig te werken om de introductie van luchtbellen te voorkomen. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals histologie of elektronenmicroscopie worden gebruikt om patronen van eiwitexpressie te bestuderen of een hogere resolutie te bereiken van gebieden die in 2D van belang zijn.
Onze hoop is dat deze publicatie zal u helpen om toegang te krijgen tot de kracht van hoge resolutie weefsel micro-CT.
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het inbedden van monsters op millimeterschaal, met een nadruk op het gebruik van acrylhars en polyimidebuisjes. De techniek maakt langdurige bewaring en meerdere beeldsessies mogelijk, wat de studie van weefselarchitectuur en celmorfologie via micro-CT vergemakkelijkt.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- Histologie
Achtergrond
- Inbeddingstechnieken zijn essentieel voor het behoud van kleine biologische monsters.
- De stabiliteit van ingebedde monsters maakt langdurige opslag en herhaalde beeldvorming mogelijk.
- Micro-CT-beeldvorming levert gedetailleerde driedimensionale histologische beelden op.
- Veelvoorkomende uitdagingen zijn onder meer de oriëntatie van het monster en het voorkomen van beschadigingen tijdens de preparatie.
Doel van de studie
- Om protocollen te ontwikkelen voor het inkapselen van kleine specimens voor beeldvorming.
- Om de stabiliteit en bruikbaarheid van monsters over een langere periode te verbeteren.
- Om de effectiviteit van de methode aan te tonen met verschillende modelorganismen.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van specimens met behulp van neutraal gebufferde formaline en Tricaine-S.
- Inbedding van monsters in LR white acrylhars met behulp van polyimide buisjes.
- Polymerisatie van de hars bij gecontroleerde temperaturen.
- Micro-CT-beeldvorming voor driedimensionale reconstructie van monsters.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle inbedding van exemplaren van zebravissen, Drosophila en Daphnia.
- Hoge kwaliteit beelden verkregen zonder dat luchtbellen de monsters beïnvloedden.
- Monsters behielden hun anatomische kenmerken over langere bewaartermijnen.
- De methode maakt meerdere beeldopnamesessies met consistente resultaten mogelijk.
Conclusies
- De ontwikkelde inbeddingsmethode is effectief voor kleine biologische monsters.
- Langdurige bewaring en herbruikbaarheid van monsters verbeteren de onderzoeksmogelijkheden.
- Dit protocol kan verdere studies in de histologie en microscopie faciliteren.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Sectievrije 3D-histologie via micro-CT, mogelijk gemaakt door rigide inbedding van gefixeerde en gekleurde specimens op millimeterschaal, voorziet in een kritische behoefte aan volumetrische weefselanalyse met hoge resolutie in vroege discovery-fasen en preklinisch onderzoek. Deze aanpak behoudt de anatomische integriteit en maakt herhaalde, kwantitatieve beeldvorming mogelijk, wat bijdraagt aan robuuste fenotypische screening en mechanische risicoreductie. De methode verhoogt het voorspellend vertrouwen en de efficiëntie van middelen binnen pipelines voor modelsystemen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt uitgebreide analyse van de 3D-weefselarchitectuur mogelijk voor functionele target-validatie.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie door cellulaire en subcellulaire kenmerken te behouden voor herhaalde analyse.
- Faciliteert hypothese-gestuurde studies in modelorganismen die relevant zijn voor ziektepaden.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt stabiele, herbruikbare monsters voor high-throughput fenotypische screening en toxicologische workflows.
- Levert kwantitatieve, reproduceerbare imaging-outputs voor assay-standaardisatie.
- Maakt cross-platform imaging-compatibiliteit mogelijk, wat de flexibiliteit voor downstream analytische toepassingen ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Behoudt anatomische getrouwheid voor longitudinale studies en afstemming van translationele biomarkers.
- Ondersteunt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door meerjarige heranalyse van monsters mogelijk te maken.
- Vermindert biologische variabiliteit en risico bij de evaluatie van preklinische modellen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze inbeddings- en beeldgevingsmethode bevindt zich op het snijvlak van vroege ontdekking, fenotypische screening en preklinische modelvalidatie, en biedt een herbruikbaar platform voor 3D-weefselonderzoek.
- Discovery Biology: Ondersteunt het testen van nulhypothesen en het verduidelijken van signaalpaden door middel van herhaalde, kwantitatieve 3D-beeldvorming van geconserveerde specimens.
- Screening: Levert assay-klare, stabiele monsters voor schaalbare fenotypische en toxicologische evaluatie.
- Analytics: Biedt kwantitatieve intensiteitsprofielen en signaal-ruismetingen voor robuuste statistische vergelijking.
- Translationeel Onderzoek: Conserveert monsters voor meerjarige, cross-studie biomarker- en anatomische analyses.
- Enterprise Hergebruik: Creëert een gestandaardiseerde langetermijnbron voor multi-modale beeldvorming en retrospectieve studies.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in weefselgebaseerde studies.
- Operationele waarde: Standardiseert de monstervoorbereiding, verbetert de reproduceerbaarheid en maakt schaalbare imaging-workflows mogelijk.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go-beslissingen en de kapitaalefficiëntie door hoogwaardige monsters te behouden voor herhaalde analyse.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en de verdere ontwikkeling van discovery- en preklinische assets.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in micro-CT-beeldvorming en nauwkeurige monsterhandeling om beschadiging en de introductie van luchtbellen te voorkomen.
- Vereist toegang tot inbeddingsmaterialen, polyimide buisjes en een temperatuurgecontroleerde polymerisatie-infrastructuur.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor een consistente monsteroriëntatie en beeldkwaliteit.
- Aanpasbaar aan een reeks kleine modelorganismen en weefseltypen binnen de gespecificeerde afmetingsbeperkingen.
- Zorgvuldige aandacht voor de protocolstappen is essentieel om de monsterintegriteit en de getrouwheid van de beeldvorming te behouden.
