Generatie van menselijke primordiale geslachtscellen-achtige cellen aan de oppervlakte van Embryoid instanties van primer-pluripotent geïnduceerde pluripotente stamcellen

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van de menselijke kiembaantoxicologie, zoals hoe schade in het genoom van menselijke oerkiemcellen wordt gecreëerd of gerepareerd. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat menselijke oerkiemcellen kunnen worden gegenereerd in twee weken uit de geprimede pluripotentie iPS cellen herbergen ziekte aanleg genetische achtergrond. De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot preventie van genomische stoornissen in menselijke kiembaancellen, omdat ons celcultuurmodel ons kan helpen om de toxiciteit van een therapeutisch medicijn te verminderen.

Om te beginnen met het genereren van menselijke oerkiekiecelachtige cellen, of menselijke PGCLC's, bereid extracellulaire matrix eiwitgecoate platen en celsuspensie van menselijke IPSCs, zoals beschreven in het tekstprotocol. Bereid een eencellige suspensie van geprimede pluripotentie menselijke iPSCs voor in het mTeSR1-medium met de Y-27632 Rho kinase-remmer. Pas de celdichtheid voorzichtig aan op 100.000 cellen per milliliter.

Inenting twee milliliter celsuspensie van geprimede menselijke iPSCs in elke put van de extracellulaire matrix eiwit gecoate zes-goed platen, ervoor te zorgen dat de cellen gelijkmatig worden verdeeld door het schudden van de platen verticaal en horizontaal. Incubeer de platen in een tri-gas CO2 incubator op 37 graden Celsius. Het is zeer belangrijk om precies 200.000 cellen in te enten in elke put van een zes-put plaat.

Nauwkeurig tellen van cellen is van cruciaal belang. Na voltooiing van de tijdelijke omzetting in naïeve pluripotentie, moeten cellen over-confluent kijken, wat normaal is. Exacte timing van medium verandering is belangrijk om hoge menselijke PGCLCS en experimentele reproduceerbaarheid te bereiken.

Dichtheid van de 4i hiPSC cultuur is hoog onder deze omstandigheden, en het is naar verwachting voor cel te worden confluent op de 48 tot 72 uur na inenting. 24 uur na inenting, verander het medium met twee milliliter per put van mTeSR1 medium zonder Y27632. Start conversie van geprimed pluripotentie staat menselijke iPSCs naar 4i naïeve pluripotente stamcellen, door opwarming 50 milliliter van 4i compleet medium in een 37 graden Celsius waterbad gedurende 15 minuten.

Verwijder bij 48 en 72 uur na inenting de platen uit de couveuse en verander het medium met 2 milliliter per put van 4i compleet medium. Centrifugeer het met een wasmiddel bedekte microwellplaat op 1.000 g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Inspecteer de putten met omgekeerde microscoop om de afwezigheid van luchtbellen te garanderen.

Spoel de putten zoals beschreven in het tekstprotocol en herhaal de centrifugatie. Voeg 4i compleet medium toe aan de gespoelde putten. Centrifugeer de plaat op 1.000 g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur en inspecteer de putten opnieuw.

Om 4i menselijke iPSCs in de microwellplaat te inenten, bereid menselijke iPSC celsuspensie voor zoals beschreven in het protocol. Filter deze celsuspensie door een celzeef van 40 micrometergrootte om celaggregaten te verwijderen. Was de zeef met een milliliter voorverwarmde 4i compleet medium drie keer om alle cellen te verzamelen van de zeef, en tel de cellen met een cultuur teller.

Verdun vervolgens deze eencellige suspensie van 4i naïeve menselijke iPSC's tot 27 tot 32,4 miljoen cellen in 9 milliliter voorverwarmd 4i compleet medium met Y27632. Verwijder eerder voorbereide microwell plaat met 1 milliliter van 4i compleet medium per put uit een tri-gas incubator. Inenting 1 milliliter van 4i naïeve menselijke iPSC suspensie in elke put, om een concentratie van 3,0 tot 3,6 miljoen cellen per put te bereiken.

Voorzichtig pipette om de cellen gelijkmatig te verdelen. Centrifugeren de plaat op 100 g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Plaats de plaat in een tri-gas CO2 incubator, zorg ervoor dat cellen pelleted in microwells verstoren, en uitbroeden voor 24 tot 30 uur, omdat een nachtelijke incubatie onvoldoende is voor de vorming van strakke embryonale lichamen of EB's.

Prewarm 5 milliliter van menselijke PGCLC basale medium en 20 milliliter van de menselijke PGCLC compleet medium voor ten minste vijf minuten in een 37 graden Celsius waterbad Voorzichtig plaats een 40 micrometer poriën sized cel zeef ondersteboven over een 50 milliliter polypropyleen kegelbuis. Om EBs los te maken van microwells, voorzichtig pipette elke put van de plaat. Als u cellen wilt verwijderen die niet in EB's zijn opgenomen, filtert u de inhoud van alle putten door de celzeef.

Was voorzichtig de EB's die op het membraan van de celzeef worden vastgehouden met 1 milliliter voorverwarmd menselijk PGCLC-basaal medium en herhaal de was vijf keer. Plaats een verse 50 milliliter conische buis op de celzeef, zodat de celzeef nu rechts in de nieuwe buis wordt geplaatst. Snel de celzeef omkeren met de nieuwe buis, die de EB's onder het membraan van de celzeef zal plaatsen.

Voeg 18 milliliter voorverwarmde menselijke PGCLC complete medium toe aan het membraan van de celzeef om EB's in de conische buis te verzamelen. Dan, plaat 3 milliliter per put van de schorsing van EB's in putten van een lage bevestiging zes-goed plaat. Plaats de plaat op een wip-move rocker in een tri-gas incubator, en stel de schommelsnelheid voorzichtig op ongeveer 20 bochten per minuut.

Op dag zeven tot 13 van het experiment, vers bereiden 20 milliliter van de menselijke PGCLC complete medium per dag. Verwijder de plaat van de tuimelschakelaar, waardoor de EB's naar de bodem van de putten zinken. Verwijder het oude medium zonder eb's te drogen, zodat ongeveer 0,2 milliliter oud medium in elke put blijft.

Voeg 3 milliliter per put van verse menselijke PGCLC compleet medium, na het verwijderen van het oude medium elke dag. Om menselijke PGCLC's te identificeren als OCT4-positieve cellen, oogst je de EB's tot een 1,5 milliliter laagbindarme microcentrifugebuis. Laat de EB's zinken naar de bodem bij kamertemperatuur, en gooi het medium.

Spoel de EBs af met ijskoude 1X PBS. Na het verwijderen van de PBS, incubeer de EB's in 1 milliliter ijskoud 1%gewicht in volume natrium azide in PBS op ijs gedurende vijf minuten. Laat de EB's zinken naar de bodem bij kamertemperatuur.

Na het weggooien van de supernatant, spoel de EBs met ijskoude PBS. Ontdooi 200 microliters van extracellulair matrix-eiwit op ijs. Voeg het eiwit toe aan de buis met EB's.

Laat de buis ongeveer 10 minuten op kamertemperatuur, totdat de gel is gestold en de EB's zijn ingebed. Om de EBs te repareren, voeg 1 milliliter van 4% formaldehyde in PBS aan de buis, en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten met zachte schommelen. Gooi daarna het formaldehyde weg en spoel de EB's één keer af met ijskoude PBS.

Voeg 1 milliliter ethanol toe. Bewaar in 70% ethanol bij 4 graden Celsius voor maximaal een week, of ga verder met het verwerken ervan met een standaard FFPE-protocol. Celdichtheid en zelfs verdeling van cellen op elke put zijn van cruciaal belang.

Menselijke IPC's in 2 milliliter Y27632 aangevuld medium per put van een zes-put plaat, bereiken 20 tot 30%confluency na 24 uur. Na een extra 24-uurscultuur in het mTeSR1-medium, bij afwezigheid van Y27632, werden cellen samengevoegd en gevormd kolonies, die ongeveer 30% van het groeigebied bezetten. Na 24 uur cultuur in het 4i herprogrammeringsmedium bereikten cellen samenvloeiing.

Na een extra 24 uur cultuur in het 4i-medium, werden cellen dichter verpakt. Na een 24-uurs incubatie in microwells in het 4i herprogrammeringsmedium, vormden cellen EB's met hun cirkelvormige contour zichtbaar op 24 tot 30 uur na inenting. EB's bewaard in de menselijke PGCLC medium, onder schommelende niet-loodrechte omstandigheden, onderhouden hun bolvormige vorm zonder aggregatie na 24 uur.

Na 192 uur waren de EB's groter en hadden dezelfde morfologie. Na 5 dagen kwamen de cellen tevoorschijn als OCT4 die cellen uitdrukte op het oppervlak van EB's, waardoor hun aantal na 8 dagen toeneemt. Cellen uit eencellige suspensie van menselijke PGCLCs werden verrijkt als CD38-positieve cellen door FACS.

Cellen die CD38 niet uitdrukken, waren negatieve controle. Om besmetting te voorkomen, werden FACS-poorten CD38-positieve en CD38-negatieve cellen gescheiden door een ruime marge. Tijdens een poging deze procedure, zijn belangrijk om exacte cel tellen en timings van medium verandering te volgen.

Het weglaten van middelgrote verandering zelfs één enkele dag, of het verminderen van het volume van dat middel bij elke stap, kan massieve celdood veroorzaken. Snelheid van de schommelende cultuur van embryonale lichamen moet zorgvuldig worden geoptimaliseerd.