TChIP-Seq: Cell-Type-specifieke Epigenome profilering

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het epigeneticaveld, zoals hoeveel chromatische modificaties worden geregeld op een celtype specifieke manier, samen met genomen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we chromatine kunnen isoleren van de beoogde cellen en vervolgens typische zigeunerafwaarts kunnen volgen. Dus deze methode kan inzicht geven in neuron specifieke trimincil, lysinc 4, opisoncilly.

Het kan ook worden toegepast op andere histone modificatie, andere celtypes, en vervolgens andere modelorganismen. Het aantonen van de procedure zal Mari Mito zijn, een technicus van mijn laboratorium. Om te beginnen, gebruik fijne veerschaar om het weefsel van belang in kleine stukjes te ontleden.

Voeg de weefselfragmenten toe aan een schone container gevuld met vloeibare stikstof. Breng vervolgens de weefselfragmenten over op twee milliliterbuizen gevuld met vloeibare stikstof. Bewaar de buizen op min 80 graden Celsius gedurende vijf minuten met de dop open om de vloeibare stikstof te verdampen.

Plaats de buizen met de weefselmonsters op een gekoeld metalen ijsrek. Plaats vervolgens een metalen kogel in een buis van 1,5 milliliter en koel deze met vloeibare stikstof. Plaats de gekoelde metalen kogel op een van de monsterbuizen.

Sluit de dop en zet de buis in de buishouder van een cryogene molen. Dompelen onmiddellijk de gemonteerde buishouder gedurende één minuut in vloeibare stikstof. Steek de bevroren buishouder in de buitenste cassette van de cryogene molen.

En schud het krachtig gedurende 30 seconden, 60 keer. Daarna demonteert u de cryogene molen, verwijdert u de metalen kogel. En plaats de buis in een voorgekoelde monsterkoeler.

Bewaar de koeler op negatieve 20 graden Celsius gedurende 15 minuten. Voeg vervolgens 900 microliter van 1% formaldehyde toe aan de buis en pipet om te mengen. Breng de suspensie over naar een nieuwe twee milliliter buis met 900 microliters van 1% formaldehyde.

Bevestig vervolgens de vering gedurende 10 minuten met zachte rotatie op 23 graden Celsius. Om de fixatiereactie te stoppen, voeg 100 microliter van 2,5 molaire glycine aan de buis toe. En centrifuge bij 3.000 keer zwaartekracht gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.

Gooi hierna de supersupernatant weg. Voeg een milliliter PBS aan de buis en vortex te mengen. Centrifuge bij 3.000 keer zwaartekracht gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.

Herhaal deze wasstap nog twee keer. Voeg vervolgens 500 microliters lyse buffer een aan de pellet en pipet te mengen. Centrifuge de buis gedurende vijf minuten bij 3.000 keer zwaartekracht bij vier graden Celsius en gooi de supernatant weg.

Voeg een milliliter lyse buffer twee aan de pellet en vortex te mengen. Dan, centrifuge de schorsing gedurende vijf minuten op 3,000 keer de zwaartekracht op vier graden Celsius en gooi de supernatant. Voeg hierna 800 microliters radio-immunoprecipitatie-asssaybuffer met proteaseremmercocktail toe aan de pellet en pipet om te mengen.

Centrifuge de suspensie gedurende vijf minuten bij 3.000 keer de zwaartekracht bij vier graden Celsius en gooi de supernatant weg. Voeg vervolgens 500 microliters RIPA-buffer met proteaseremmercocktail toe aan de pellet. Dan, centrifuge de schorsing gedurende vijf minuten op 3,000 keer de zwaartekracht op vier graden Celsius en gooi de supernatant.

Voeg een milliliter RIPA buffer toe met protease inhibitor cocktail. Onmiddellijk na het toevoegen van RIPA buffer met protease inhibitor cocktail, breng het lysaat naar een sonicator buis. En plaats de buis op een ultrasonicator.

Met behulp van de instellingen die in het tekstprotocol worden beschreven, schuift u de chromatine af. Breng het monster vervolgens over op een 1,5 milliliter eiwitarme bindingsbuis. En centrifuge het vijf minuten bij 20.000 keer zwaartekracht bij vier graden Celsius.

Verzamel de supernatant uit het monster en breng het over naar een nieuwe eiwitarme bindingsbuis. In dit protocol werd tandemchromachromaat immunoprecipitatie sequencing geïntroduceerd en gedemonstreerd. Tijdens de procedure werd de kwaliteit van het DNA in meerdere stappen getest.

Onmiddellijk na de sonicatie werd het afschuifde DNA geïsoleerd en getest met een microfluïde elektroforesemachine. Na het gebruik van anti-FLAG antilichaam en anti-H3K3me3 antilichaam om affiniteitszuivering uit te voeren werd de DNA-kwaliteit opnieuw gecontroleerd. De specificiteit van de immuunzuivering van DNA op H2B-FLAG werd bevestigd met negatieve controlemonsters.

Waar verwaarloosbare hoeveelheden DNA werden aangetroffen. Verder in het protocol werd de kwaliteit van de sequencing bibliotheek geverifieerd. De succesvolle ChIP en T-ChIP werden aangetoond via verrijkingsanalyse met behulp van primers gericht op de promotor regio van het GAPDH-gen.

Representatieve herverdelingen langs drie neuron genen werden verkregen. En de verrijking van reads aan de vijf belangrijkste uiteinden van de genen door neuron T-ChIP zoeken over hele hersenen T-ChIP zoeken werd waargenomen. Na een stabiliment, deze techniek effent de weg voor onderzoekers in het epigenetische veld om celtype specifieke histon modificatie algemeen in het algemeen in neuronen in muizen te verkennen.

Vergeet niet dat het werken met formaldehyde zeer gevaarlijk kan zijn en om voorzorgsmaatregelen te nemen, zoals het dragen van rubberen kleding en een bril moet altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.