Name: Isolatie en Decellularization van een hele varkens alvleesklier (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Leer de dissectie en decellularisatie van een intact varkensalvleesklier met koude detergentperfusie. Deze methode behoudt de extracellulaire matrix voor weefselengineering en klinische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Deze studie werd gefinancierd door een subsidie van de Zweedse regering LUA ALF S.S.H.

De dissectie van een varkens alvleesklier en de procedure van de decellularization gepresenteerd hier volgen de ethische richtsnoeren voor de Universiteit van Göteborg.
1. voorbereiding van de opstelling van de Decellularization
<ol><li>3 x 5 mm siliconen buizen gebruikt, in de serie de wasmiddel inlaat container verbinding te maken met de peristalic-pomp en vervolgens aan de alvleesklier in het orgel kamer via de degasser (Zie Figuur 1). Een mannelijke luer verbinden met het vrije uiteinde van de buis in orgel kamer.</li>
	<li>Met behulp van een andere 3 x 5 mm silicon buis, verbinden met de orgel-zaal de wasmiddel outlet container via de peristaltische pomp voor het verzamelen van de perfused wasmiddel.</li>
	<li>Pipetteer 2 ml labelloze verbinden met de vrije uiteinden van buizen in wasmiddel inlaat container en wasmiddel outlet cointainer.</li>
	<li>Houden de hele set-up bij 4 ° C.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58302/58302fig1v2.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;"> Figuur 1: voorbereiding van de opstelling van de perfusie. Met behulp van een 3 x 5 mm Siliconen slang, zoals wordt weergegeven in de set-up, in serie de wasmiddel inlaat container verbinding te maken met de peristaltische pomp, de degasser en de orgel-kamer. De zwarte pijlen stroomrichting de van wasmiddel inlaat container naar orgel kamer. Voor het wasmiddel outlet, gebruik een andere 3 x 5 mm Siliconen slang en sluit het orgel kamer via de peristaltische pomp aan het wasmiddel outlet container. De rode pijlen stroomrichting de van orgel kamer aan wasmiddel outlet container. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58302/58302fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
2. bereiding van Decellularization oplossingen
<ol><li>Oplossing 1 (met fosfaat gebufferde zoutoplossing [PBS]): 8 g natriumchloride (137 mM), 0.2 g van kaliumchloride (2,7 mM), 1,44 g natriumfosfaat (10 mM) en 0,24 g (1,8 mM) kalium fosfaat aan 1 L ultrazuiver water toevoegen en roer tot het is opgelost. Breng de pH op 7.4 met zoutzuur (HCl). In totaal is 3,2 L van deze oplossing vereist.</li>
	<li>Oplossing 2 (PBS + heparine): 1 L oplossing 1, voeg 3,4 mL van heparine (17 internationale eenheden [IU] /mL). Deze oplossing vers bereiden en bewaar deze op ijs totdat het wordt koud. In totaal is de 1.2 L van deze oplossing vereist.</li>
	<li>Oplossing 3 (ultrazuiver water + natriumazide Dinatrium ethyleendiamminetetra zuur [EDTA]): tot 1 L ultrazuiver water, voeg 1,86 g EDTA (5 mM) en 200 mg (0,02%) natriumazide. Roer totdat de zouten zijn opgelost. Koel de oplossing tot 4 ° C vóór gebruik. In totaal is 22 L van deze oplossing vereist.</li>
	<li>Solutie 4 (PBS + natriumazide EDTA): 1 L oplossing 1, voeg 200 mg (0,02%) natriumazide en 1,86 g (5 mM) EDTA. Roer totdat de zouten zijn opgelost. Koel de oplossing tot 4 ° C vóór gebruik. In totaal is 1 liter van deze oplossing vereist.</li>
	<li>Oplossing 5 (ultrazuiver water + natriumazide): tot 1 L ultrazuiver water, voeg toe 200 mg (0,02%) natriumazide. Roer totdat de zouten zijn opgelost. Koel de oplossing tot 4 ° C vóór gebruik. In totaal is 260 L van deze oplossing vereist. Opmerking: EDTA vormt een neerslag met SDC en oplossing 5 was uitgesloten aangezien het zal worden gebruikt voor directe wassen voor en na de behandeling van SDC.</li>
	<li>Oplossing 6 (SDC + Triton X-100): 940 ml ultrazuiver water, voeg toe 40 g (4%) SDC, 60 mL (6%) Triton-X-100, 200 mg (0,02%) natriumazide en 69,6 mg (0,4 mM) phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF). Roer tot het is opgelost. Koel de oplossing tot 4 ° C vóór gebruik. Toevoegen PMSF voor gebruik. In totaal is 9,6 L van deze oplossing vereist.</li>
	<li>Oplossing 7 (DNase): 10.000 Kunitz toevoegen eenheden van DNase-ik in 250 mL (40 Kunitz eenheden/mL) Dulbecco van PBS met CaCl2 en MgCl2. Vers bereid en direct gebruiken. Verwarm de oplossing tot 37 ° C vóór gebruik.</li>
	<li>Oplossing 8 (PBS + natrium azide): 1 L oplossing 1, voeg toe 200 mg (0,02%) natriumazide. Roer totdat de zouten zijn opgelost. Koel de oplossing tot 4 ° C vóór gebruik. In totaal is 1 liter van deze oplossing vereist.</li>
</ol>3. dissectie van de varkens alvleesklier
Opmerking: In deze studie varkens pancreases werden ontleed van euthanized, vrouwelijke varkens EDTA (400 IU/kg) met een gewicht van 45 kg van een bedrijf.
<ol><li>Plaats het varken op de tafel van de dissectie in de liggende positie.</li>
	<li>Maak een middellijn insnijding van het xiphoidal proces aan het schaambeen (ongeveer 40 cm) met behulp van een scalpel, alle buikorganen bloot.</li>
	<li>Zoek de milt, duodenale, en verbinding lobben.</li>
	<li>Zoek het niveau van de grote duodenale Papil en afbinden van de twaalfvingerige darm mondeling van die site met behulp van twee afzonderlijke hechtingen.</li>
	<li>De inferieur slokdarm met twee afzonderlijke hechtingen afbinden en snijd tussen de ligaturen met een schaar te nemen de maag.</li>
	<li>Het scheiden van het bindweefsel van de dikke darm te bereiken van de dunne darm.</li>
	<li>Scheiden van het bindweefsel van de dikke darm dat aan de milt kwab van de alvleesklier hecht.</li>
	<li>Verwijder de dubbele punt uit de dunne darm na ligating van de slagaders.</li>
	<li>Vind de inferieure mesenterische ader en de boom inferieur mesenterische slagader en afbinden met een hechtdraad waar ze worden caudally van de alvleesklier weergegeven.</li>
	<li>Afbinden van de milt slagader en ader samen met een hechtdraad, dicht bij de milt, in de Hilus, en distally knippen met een schaar te verwijderen van de milt.</li>
	<li>Volg de twaalfvingerige darm tot de duodenale en verbinding lobben zijn uitgeschakeld en de twaalfvingerige darm aan het eind met twee afzonderlijke hechtingen afbinden.</li>
	<li>Ontleden van de ader van de portal, het afbinden met een hechtdraad ter voorkoming van lekkages van bloed uit de lever en proximally op ligatuur gesneden. De ader portal fungeert als een stopcontact tijdens de decellularization.</li>
	<li>Ontleden en afbinden van de gal duct en hepatische slagader met twee hechtingen. Knippen en distally naar hechtingen.</li>
	<li>Zoek op de aorta onder de renale ader en het ontleden in de craniale richting van spier- en bindweefsel totdat het pancreas gebied wordt bereikt.</li>
	<li>De alvleesklier zachtjes over wegknippen en ontleden de aorta, houden de SMA en de CT intact, en snijd de aorta aan CT superieur en inferieur aan SMA met een schaar.</li>
	<li>Knip de resterende omringende weefsels met een schaar en neem de alvleesklier uit.</li>
	<li>Met een 50 mL injectiespuit verbonden aan 4-mm arteriotomy canule, het orgel door de aorta met oplossing 2 spoelen totdat het perfuses het gehele orgaan of het gehele orgaan koud wordt.</li>
</ol>4. voorbereiding van de varkens alvleesklier Decellularization
<ol><li>Houd de alvleesklier bij 4 ° C of op ijs tijdens het hele proces.</li>
	<li>De hechtingen van de twaalfvingerige darm met behulp van schaar te knippen, schoon van voedsel door te spoelen van de 50-150 mL ultrazuiver water met behulp van een precisiepipet 25 mL en het opnieuw afbinden met hechtingen.</li>
	<li>Afbinden één uiteinde van de aorta en alle subsleutels behalve de SMA en CT met hechtingen ter voorkoming van lekkage.</li>
	<li>Invoegen vanaf het andere einde van de aorta een canule 4-mm arteriotomy en het afbinden met hechtingen.</li>
	<li>Perfuse de alvleesklier met oplossing 3 gedurende 1 uur bij 20 mL/min met behulp van de set-up van de decellularization. Opmerking: Prefill de buizen van pomp met oplossing 3, zodat er geen luchtbellen Voer de alvleesklier. Kijk voor eventuele lekkages van alle kanten van het orgaan en afbinden van alle geopende vasculaire takken met hechtingen, met uitzondering van de ader van de portal.</li>
	<li>Het bevriezen van de alvleesklier bij-20 ° C in oplossing 4 tot het begin van de decellularization.</li>
</ol>5. decellularization van de varkens alvleesklier
<ol><li>Ontdooi de alvleesklier bij 4 ° C.</li>
	<li>Lopen de peristaltische pomp in de opzet van de decellularization met oplossing 3 op 20 mL/min tot geen luchtbellen worden gezien in de buis wasmiddel inlaat.</li>
	<li>Plaats de alvleesklier in de decellularization container en sluit de tube wasmiddel inlaat aan de aorta van de alvleesklier. Wassen van het orgel door perfusie met oplossing 3 's nachts bij 20 mL/min bij 4 ° C.</li>
	<li>Giet de oplossing links in de kamer van het orgel.</li>
	<li>Oplossing 3 vervangen door oplossing 5 en perfuse van de alvleesklier gedurende 30 minuten bij 20 mL/min bij 4 ° C. Giet de oplossing in de zaal van het orgel.</li>
	<li>Voeg oplossing 6 en perfuse de alvleesklier gedurende 8 uur bij 20 mL/min bij 4 ° C. Giet de oplossing in de zaal van het orgel.</li>
	<li>Wassen van het orgel door perfusie met oplossing 5 voor 96 uur bij 20 mL/min bij 4 ° C. Giet de oplossing in de zaal van het orgel.</li>
	<li>De alvleesklier voorbereiden DNase behandeling door het opnieuw circuleren van 500 mL Dulbecco van PBS met CaCl2 en MgCl2 gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Giet de oplossing in de zaal van het orgel.</li>
	<li>Voeg 250 mL oplossing 7 en perfuse de alvleesklier gedurende 4 uur bij 20 mL/min bij 37 ° C. Giet de oplossing in de zaal van het orgel.</li>
	<li>Wassen van het orgel door perfusie met oplossing 5 voor 120 h op 20 mL/min bij 4 ° C.</li>
	<li>Sla het orgel in oplossing 8 bij 4 ° C gedurende korte perioden of bij-20 ° C voor lange periodes.</li>
</ol>6. verificatie van Decellularization
<ol><li>Met behulp van schaar, knip 3 - tot 10-mm Biopten van alle lobben van de alvleesklier en corrigeren in formaldehyde gedurende 48 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Wassen van de stukken in ultrazuiver water gedurende 15 minuten in een weefsel processor standaard protocollen te verwerken, en hen inbedden in paraffine.</li>
	<li>Knip 5-µm secties microtoom gebruiken en vlekken hen door Meyers haematoxyline en 0,2% alcoholische eosine (HE) na standaardprotocollen.</li>
	<li>Bekijk de dia's onder een lichte Microscoop te controleren voor het verlies van kernen. Opmerking: Een stuk uit een vers weefsel verwerkt op dezelfde manier kan worden gebruikt als een besturingselement controleren op de aanwezigheid van kernen.</li>
</ol>

<ol><li>Federation, I. D. IDF Diabetes Atlas. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.diabetesatlas.org">http://www.diabetesatlas.org</a> (2016).</li>
<li>Yang, H. K., Yoon, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+encapsulated+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+and+its+Complications%22%5BJournal%5D)">Current status of encapsulated islet transplantation.</a> Journal of Diabetes and its Complications. 29 (5), 737-743 (2015).</li>
<li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-organ+tissue+engineering%3A+Decellularization+and+recellularization+of+three-dimensional+matrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Whole-organ tissue engineering: Decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).</li>
<li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li>
<li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+metazoan+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The evolution of metazoan extracellular matrix.</a> Journal of Cell Biology. 196 (6), 671-679 (2012).</li>
<li>Scarritt, M. E., Pashos, N. C., Bunnell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+cellularization+strategies+for+tissue+engineering+of+whole+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A review of cellularization strategies for tissue engineering of whole organs.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnol. 3, 43(2015).</li>
<li>Goh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+pancreas+as+a+natural+3D+scaffold+for+pancreatic+tissue+and+whole+organ+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized pancreas as a natural 3D scaffold for pancreatic tissue and whole organ engineering.</a> Biomaterials. 34 (28), 6760-6772 (2013).</li>
<li>Wu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Culture+of+MIN-6+Cells+on+Decellularized+Pancreatic+Scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+and+In+Vivo+Study.+Biomed+Research+International%22%5BJournal%5D)">3D Culture of MIN-6 Cells on Decellularized Pancreatic Scaffold.</a> In Vitro and In Vivo Study. Biomed Research International. 2015, 432645(2015).</li>
<li>Peloso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Pancreas+as+a+Source+of+Protolerogenic+Extracellular+Matrix+Scaffold+for+a+New-generation+Bioartificial+Endocrine+Pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">The Human Pancreas as a Source of Protolerogenic Extracellular Matrix Scaffold for a New-generation Bioartificial Endocrine Pancreas.</a> Annals of Surgery. 264 (1), 169-179 (2016).</li>
<li>Mirmalek-Sani, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+pancreas+extracellular+matrix+as+a+platform+for+endocrine+pancreas+bioengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Porcine pancreas extracellular matrix as a platform for endocrine pancreas bioengineering.</a> Biomaterials. 34 (22), 5488-5495 (2013).</li>
<li>Taylor, M. J., Baicu, S., Greene, E., Vazquez, A., Brassil, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+isolation+from+juvenile+porcine+pancreas+after+24-h+hypothermic+machine+perfusion+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Islet isolation from juvenile porcine pancreas after 24-h hypothermic machine perfusion preservation.</a> Cell Transplantation. 19 (5), 613-628 (2010).</li>
<li>Elebring, E., Kuna, V. K., Kvarnstrom, N., Sumitran-Holgersson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold-perfusion+decellularization+of+whole-organ+porcine+pancreas+supports+human+fetal+pancreatic+cell+attachment+and+expression+of+endocrine+and+exocrine+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cold-perfusion decellularization of whole-organ porcine pancreas supports human fetal pancreatic cell attachment and expression of endocrine and exocrine markers.</a> Journal of Tissue Engineering. 8, 2041731417738145(2017).</li>
<li>Gilpin, A., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+Strategies+for+Regenerative+Medicine%3A+From+Processing+Techniques+to+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Decellularization Strategies for Regenerative Medicine: From Processing Techniques to Applications.</a> Biomed Research International. 2017, 9831534(2017).</li>
<li>James, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+protease+inhibitor+phenylmethylsulfonyl+fluoride+in+buffers%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the protease inhibitor phenylmethylsulfonyl fluoride in buffers.</a> Analytical Biochemistry. 86 (2), 574-579 (1978).</li>
<li>Lichstein, H. C., Soule, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+the+Effect+of+Sodium+Azide+on+Microbic+Growth+and+Respiration%3A+I.+The+Action+of+Sodium+Azide+on+Microbic+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Studies of the Effect of Sodium Azide on Microbic Growth and Respiration: I. The Action of Sodium Azide on Microbic Growth.</a> Journal of Bacteriology. 47 (3), 221-230 (1944).</li>
</ol>

S.S.H. houdster is van aandelen in Verigraft, een bedrijf dat de technologie van bloedvat weefselengineering vergunning heeft gegeven. De andere auteurs hebben niets te onthullen.

Het voorgestelde protocol, met behulp van perfusie van SDC en Triton X-100 bij 4 ° C, zullen hele varkens alvleesklier met succes decellularize. De uitdaging in deze techniek is de dissectie van de intact alvleesklier met alle de drie lobben zonder beschadiging van de parenchym en haar verstrekkende vaartuigen, evenals de afbinding van de andere vasculaire takken van het model om het perfuse van het orgel zonder lekkage. De varkens alvleesklier heeft een verschillende anatomie in vergelijking met de menselijke alvleesklier. Het bestaat uit drie lobben en blijft in nauw contact met de dunne darm door deels eromheen. We ontleed de twaalfvingerige darm samen met de alvleesklier, net als verschillende kleine bloedvaten uit alvleesklier verbinding de darm. Tijdens de optimalisatie studies, heeft stomp snijden van deze bloedvaten aangetoond lekkage en een onvolledige perfusie van oplossingen.
Aangezien de aorta verbinding met de alvleesklier via de coeliakie en superieure mesenterische slagaders maakt, kozen we de aorta als een inham eenvoudig te houden de perfusie door slechts met behulp van een canule en dus een inlaat. In onze ervaring, Afbinding van de aorta boven de CT en onder de SMA zal het verminderen van de tijd van dissectie en vermindert het risico van beschadiging van een van de twee schepen. Naast een heparinized varken, wij ook gemerkt dat een perfusie van koude heparine via de aorta onmiddellijk na de dissectie helpt bij het bereiken van de perfusie van oplossingen in het orgel. Wij speculeren dat als dit gebeurt doordat de vorming van bloedstolsels in de bloedvaten. De eerste perfusie van een alvleesklier met ultrazuiver water na dissectie zal lyse van rode bloedcellen en verwijder de resten van het bloed in het orgaan, waardoor de vorming van bloedstolsels. Deze periode kan ook worden gebruikt om te vinden van unligated kleine zijtak van de aders en slagaders, zoals bloedstroom kan gemakkelijk worden opgemerkt boven de achtergrond.
Wij kozen om te houden van de hele decellularization-procedure bij koude temperaturen (4 ° C), zoals dit zal een belemmering vormen voor de werking van exocrine enzymen die bij exocrine cellen van de pancreas vrijkomt. De exocrine enzymen, wanneer niet wordt geremd, kunnen leiden tot een schadelijke werking op cellen en de ECM, zoals zij celmembranen en eiwitten12 verteren kunnen. Invriezen en ontdooien effectief de cellen barsten kunnen, we opgenomen een vorst/dooi-stap, aanvankelijk nog vóór de perfusie van detergentia4,13. De eerste wassen na het ontdooien zal het verwijderen van de overblijfselen van cel uitbarstingen. Het wasmiddel behandeling die we gebruikten is een mix van SDC en Triton X-100 bij ongewoon hoge concentraties en bij een hoge perfusie-snelheid. Wij kozen deze benadering tot snellere decellularization door het verwijderen van de exocrine cellen die schade toebrengen aan de ECM. We speculeren dat een harde en snelle protocol gunstig voor alvleesklier decellularization, is zoals minder tijd beschikbaar voor enzymen van de alvleesklier om te interageren met de ECM zijn zal, dus behoud van goede ECM componenten. Om te bewaren de ECM-onderdelen, wij ook toegevoegd serine proteaseinhibitor (PMSF) aan het wasmiddel oplossingen, zoals die de activering van de enzymen die vrijkomen uit exocrine cellen14 remmen zal. Natriumazide wordt toegevoegd aan alle decellularization oplossingen, zoals het fungeert als een bacteriostatische agent, waardoor de remming van de kans op bacteriële besmetting15.
De alvleesklier decellularized volgens dit protocol toonde een behoud van ECM structuren en de ECM eiwitten collageen en elastine. Echter werd een aanzienlijk verlies van glycosaminoglycanen opgemerkt in de decellularized alvleesklier. De alvleesklier decellularized op deze manier ook toonde belofte voor de bevestiging van menselijke foetale pancreatic cellen van de stam en de expressie van exocrine en endocriene markers in recellularized voor 14 dagen12stukken. Verder onderzoek is echter voor het genereren van een intact en functionele alvleesklier, vereist bij de evaluatie van de juiste cel bronnen, celtypes, cel seeding strategieën en bioreactor cultuur.

Diabetes mellitus wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van glucose in het bloed wordt verbeterd. Het is erkend als een belangrijke volksgezondheid uitdaging in de meeste landen1. Hoge niveaus van de bloedglucose invloed op de bloedvaten en het zenuwstelsel, waardoor schade aan de ogen, het hart, de nieren en extremiteit ischemie. Traditionele methoden van behandeling omvatten injecties van exogeen insuline, drugs, en veranderingen in levensstijl. Het wegzetten een remedie voor de ziekte, in sommige gevallen, falen beschikbare behandelingen om de insuline op therapeutische niveaus, wat resulteert in hyperglykemie. Hoewel de transplantatie van eilandjes of hele alvleesklier de ziekte elimineert, is het niet vaak gedaan vanwege een gebrek aan geschikte donor-organen en de risico's en moeilijkheden van immuunsuppressie en inkapseling2.
Huidige verbeteringen op het gebied van engineering en regeneratieve geneeskunde van weefsel beschikken over de capaciteit voor het verstrekken van een oplossing voor deze problemen. Met de techniek van decellularization, het celmateriaal van een mens of dier donor kan worden verwijderd terwijl de belangrijke extracellulaire matrix (ECM) eiwitten, groeifactoren, en signalering moleculen worden bewaard in de steiger. Dergelijke steigers kunnen mogelijk worden getransplanteerd zonder de noodzaak voor immuunsuppressie, de orgaanfunctie herstellen na recellularization met de geadresseerde eigen niet-immunogene stamcellen3,4. De weefsel-engineered organen van allogene of XENOGENECELLEN bronnen kunnen worden gebruikt in de klinische transplantatie, zoals de grote extracellulaire matrix eiwitten tussen soorten zijn bewaard en kunnen niet worden afgewezen na transplantatie5.
Decellularization is een goed onderzocht methode waarbij het optimale gebruik van de fysieke krachten, chemische reinigingsmiddelen en enzymen in een fysiologische omgeving om cellen en nucleair materiaal uit een weefsel of orgaan. Recellularization is een procedure voor het zaaien van de cellen terug in het Acellulair orgel. Het is een intellectueel taai geding, wordt gelast een groot aantal cellen, een optimale strategie voor cel-zaaien en een bioreactor systeem voor de cultuur van het orgel in fysiologisch aanvaardbare omstandigheden zoals temperatuur, druk en gassen6.
De alvleesklier kan een uitdagende weefsel voor weefselengineering vanwege haar exocrine en endocriene vermogens worden beschouwd. Het exocrine weefsel scheidt meerdere spijsverteringsenzymen, terwijl het endocriene deel hormonen scheidt, met inbegrip van insuline. De decellularization van intacte pancreases van muis7,8, menselijke9en varken10 reeds gerapporteerd met behulp van enzymen (trypsine, deoxyribonuclease [DNase]) en de niet-ionogene (Triton X-100) en de Ionische detergentia ( natrium deoxycholate [SDC] en natrium dodecyl sulfaat [SDS]). Echter, naar aanleiding van de gepubliceerde protocollen worstelde we met een succesvolle dissectie en volledige perfusie en decellularization terwijl het handhaven van een ECM-structuur. Wij speculeerden dat de toegepaste detergentia tijdens de decellularization veroorzaken lysis van de cellen, waardoor het vrijgeven van spijsverteringsenzymen in het orgel. De vrijgegeven enzymen zal leiden tot een onomkeerbare schade aan de ECM-steiger en inefficiënte voor decellularization en recellularization. Een ontwerp van de methode die effectief decellularizes alvleesklier tijdens het remmen de werking van spijsverteringsenzymen, kan het probleem oplossen. We kozen de strategie van Peloso et al., van decellularization van de pancreas bij een koude temperatuur, hoewel ze heeft geen verslag over waarom koude temperatuur gebruikte9is. Op hetzelfde moment ontwierpen we een dissectie strategie met wijzigingen van Taylor et al. door te kiezen voor de aorta als een perfusie inlaat over de coeliakie stam (CT) en de superieure mesenterische slagader (SMA)11.
In een recent gepubliceerd artikel12tonen we een methode voor de effectieve isolatie en decellularization van varkens alvleesklier met behoud van sommige onderdelen van de ECM. In dit document, wij geven een gedetailleerde beschrijving van hoe een hele varkens alvleesklier met milt, duodenale ontleden en verbinding lobben en presenteren van een stapsgewijze protocol voor succesvolle decellularization.

<table><tbody><tr><td>4mm DLP arteriotomiecanule</td><td>Medtronic</td><td>31104</td><td></td></tr><tr><td>2ml Ongelabelde pipette</td><td>vWR</td><td>612-3720</td><td></td></tr><tr><td>Degasser</td><td>Biotech AB</td><td>0001-6484</td><td></td></tr><tr><td>DNase-I</td><td>Worthington</td><td>LS0020007</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS met CaCl2 en MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>EDTA dinatriumzout dihydraat</td><td>AlfaAesar</td><td>A15161.OB</td><td></td></tr><tr><td>Heparine</td><td>Leo</td><td>387107</td><td></td></tr><tr><td>Luer Male met 1/8" ID Barb</td><td>Oina</td><td>LM-2PP-QC</td><td>Voor 3X5mm siliconenbuis</td></tr><tr><td>Peristaltiek pomp</td><td>Oina</td><td>SP-1X4</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Roche</td><td>10837091001</td><td>Onstabiel in waterige oplossing. Moet vers worden toegevoegd voor perfusie.</td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumwaterstoffosfaat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>SDC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>Siliconenbuis 3X5mm</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazied</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>13423</td><td></td></tr><tr><td>Natriumwaterstoffosfaat</td><td>Merck</td><td>71640-M</td><td></td></tr><tr><td>Hechtdraad</td><td>V&ouml;mel</td><td>14817</td><td></td></tr><tr><td>Spuit 50mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>300137</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>AlfaAesar</td><td>A16046.OF</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie en decellularization van een hele varkens alvleesklier

Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas

Weefselengineering van de hele alvleesklier kunt verbeteren huidige behandelingen voor diabetes mellitus. Het uiteindelijke doel is om weefsel ingenieur alvleesklier van een allogene of XENOGENECELLEN bron met menselijke cellen. Een demonstratie van methoden voor de efficiënte dissectie, decellularization en recellularization van varkens alvleesklier zouden kunnen profiteren van het veld. Verwant aan het menselijke pancreases, varkens pancreases hebben een speciale anatomische regeling met drie lobben (milt, duodenale, en verbinding) afgerond door de twaalfvingerige darm en dunne darm. De duodenale kwab van de alvleesklier maakt verbinding met de twaalfvingerige darm verschillende kleine bloedvaten. Weefselengineering van de alvleesklier is ingewikkeld vanwege haar exocrine en endocriene karakter. In deze paper tonen we een gedetailleerd protocol om te ontleden de hele varkens alvleesklier en decellularize het met detergenten tijdens het opslaan van haar structuur en sommige componenten van de extracellulaire matrix. Om te bereiken volledig perfusie, is de aorta gekozen als de inlaat en de portal vein als uitlaatklep. De andere bloedvaten (hepatische slagader ader van de milt, milt slagader, mesenterische slagader en ader boom) en gal duct als ligatuur zijn verbonden. Voorkom de vorming van trombose en het varken is EDTA en onmiddellijk na dissectie, het orgel is gespoeld met koud heparine. Om te remmen de werking van exocrine enzymen, de decellularization van de alvleesklier ligt bij 4 ° C. De decellularization wordt uitgevoerd door perfusie van Triton X-100, natrium deoxycholate en deoxyribonuclease, met een intermitterende en laatste uitgebreide wassen. Met een succesvolle decellularization, de alvleesklier wordt wit weergegeven, en een histologische evaluatie met haematoxyline en eosine toont een gebrek aan kernen met een bewaarde extracellulaire matrix-structuur. Dus, de voorgestelde methode kan worden gebruikt om te succesvol te ontleden en decellularize hele varkens alvleesklier.

Representatieve varkens alvleesklier dissectie afbeeldingen, die kunnen helpen bij het opsporen en ontleden de inferieure mesenterische slagader en ader van de boom, de portal ader, de hepatische slagader, de gal koker en de aorta vertakt CT en SMA, worden getoond in figuur 2A, 2ben 2 C (gele pijlen), respectievelijk. Figuur 3A geeft de bruto morfologie van een normale alvleesklier, die verschijnt licht roze en bevat milt, verbinding en duodenale lobben. Na decellularization, de roze kleur is verloren en de decellularized alvleesklier kijkt bleke witte kleur. De bruto morfologie afbeelding van milt, wordt verbinding en duodenale lobben van de alvleesklier van een decellularized weergegeven in figuur 3B. Figuur 3 c toont de aanwezigheid van vele blauwe kernen in een normale alvleesklier door kleuring met hij. In een decellularized alvleesklier, de HE kleuring toonde een verlies van kernen, zoals geen blauwe kernen worden gezien (figuur 3D).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58302/58302fig2v2.jpg"> Figuur 2: foto's van de dissectie van een varkens alvleesklier. (A) de locatie van de inferieure mesenterische slagader en ader boom (gele pijl). (B) Afbinding van de ader van de portal, de hepatische slagader en de gal buis (gele pijl). (C) Aorta vertakking aan de coeliakie stam en de superieure mesenterische slagader (gele pijl). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58302/58302fig2v2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58302/58302fig3.jpg"> Figuur 3: bruto morfologie en hij kleuring van normale en decellularized pancreases. (A) bruto morfologie van een normale alvleesklier. (B) bruto morfologie van een decellularized alvleesklier. (C) hij kleuring toont de aanwezigheid van blauwe kernen in een normale alvleesklier. (D) hij kleuring toont de afwezigheid van blauwe kernen in een decellularized alvleesklier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58302/58302fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Weefselengineering van de hele alvleesklier is een uitdaging vanwege zijn exocrine en endocriene functies. Laten we een methode voor de dissectie van een intact varkens alvleesklier en het proces van succesvolle decellularization door perfusie van detergentia Triton X-100, natrium-deoxycholate, en deoxyribonuclease.

Isolatie en Decellularization van een hele varkens alvleesklier

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an ...

Deze methode kan worden gebruikt voor de dissectie van varkensalvleesklier met verbinding, duodenale en miltlobben en uiteindelijke decellularisatie via de perfusie van detergentia bij koude temperaturen. Hoewel deze methode van decellularisatie inzicht geeft in de varkensalvleesklier, kan deze ook worden toegepast op alvleesklier van andere grote dieren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het het intact ophalen van een ingewikkeld orgaan, zoals de alvleesklier, vergemakkelijkt voor verdere weefseltechnische toepassingen.Over het algemeen, individuen nieuw voor deze methode, zullen ze worstelen omdat dissectie van de intacte alvleesklier, terwijl het identificeren en ligating van alle omliggende bloedvaten vereist veel oefening te beheersen. Gebruik voor het begin van de procedure een siliconenbuis van drie bij vijf millimeter om de wasmiddelhouder aan te sluiten op de peristaltische pomp en een tweede siliconenbuis van drie bij vijf millimeter om de peristaltische pomp via de degasser op de orgelkamer aan te sluiten. Sluit een mannelijke Luer aan op het vrije uiteinde van de tweede buis en gebruik een derde siliconenbuis van drie bij vijf millimeter om de orgelkamer via de peristaltische pomp aan te sluiten op de reinigingscontainer.Sluit ten slotte een twee millimeter niet-gelabelde pipet aan op de vrije uiteinden van de buizen in de wasmiddelcontainer en de reinigingscontainer. Plaats vervolgens de decellularisatie-instelling op vier graden Celsius. Om de alvleesklier te oogsten, plaats een gehepariniseerd, 45 kilogram, vrouwelijk varken op een dissectietafel in de supinepositie, en gebruik een scalpel om een 40-centimeter middellijnincisie van het xiphoidproces aan het schaambeen te maken om de buikorganen bloot te stellen.Na het identificeren van de milt, duodenale en verbindingskwabben, lokaliseren van de belangrijkste duodenale papillen, en gebruik twee individuele hechtingen om mondeling ligate de twaalfvingerige darm van de site. Ligate de inferieure slokdarm met extra hechtingen, en snijd tussen de ligaturen met een schaar om de verwijdering van de maag te vergemakkelijken. Scheid de bindweefsels van de dikke darm om de dunne darm te bereiken, en scheid het bindweefsel van de dikke darm die hecht aan de miltkwab van de alvleesklier.Dunne darmen wordt bevestigd aan de alvleesklier door bindweefsel op de miltkwab, maar ook omringt de alvleesklier. Je moet zorgvuldig volgen het darmpad te ontwarren en scheiden van het bindweefsel tussen de darm en de alvleesklier. Na het ligateren van de slagaders, verwijder de dikke darm uit de dunne darm.Identificeer de inferieure mesenterische ader, de inferieure mesenterische slagaderboom, en ligate de vaten met één hechtingscaudal aan de alvleesklier en snijd met een schaar. Ligate de miltslagader en ader samen in het hilum, dicht bij de milt, en snijd distally met een schaar om de milt te verwijderen. Volg de twaalfvingerige darm tot de duodenale en verbindingskwlo's zijn gewist en ligate de twaalfvingerige darm aan het einde met twee afzonderlijke hechtingen.Het deel van de twaalfvingerige darm dat in nauw contact staat met de verbinding en duodenale kwabben wordt verwijderd met de alvleesklier, omdat de ligatie van alle kleine bloedvaten tussen de twee organen te moeilijk is. Na het ontleden van de poortader, ligate het vat met een hechting om bloedlekkage uit de lever te voorkomen, en ontleden en ligate de galbuis en leverslagader met twee hechtingen. Snijd vervolgens poortader, leverslagader en galwegen met een schaar door.Zoek de aorta onder de nierader en ontleden de aorta in de schedelrichting van de spier en bindweefsel totdat het vat de alvleesklier bereikt. Nu, draai voorzichtig de alvleesklier om, en ontleden de aorta, het houden van de superieure mesenterische slagader en de coeliakie stam intact. Snijd de aorta craniale aan de coeliakie stam, en stompe ontleden de resterende omliggende weefsel om de oogst van de alvleesklier mogelijk te maken.Gebruik vervolgens een spuit van 50 milliliter die is aangesloten op een cannula van vier millimeter arteriotomie om het orgaan door de aorta te spoelen met oplossing twee totdat het hele orgaan is geperfuseerd of totdat het hele orgaan koud wordt. Plaats de oplossing twee doorgebode alvleesklier op een metalen lade op ijs, met aorta naar boven, en gebruik schaar om de hechtingen te snijden van de twaalfvingen. Gebruik een pipet van 25 milliliter om de twaalfvingerige darm door te spoelen met 50 tot 150 milliliter ultrazuiver water en het weefsel te relineren met verse hechtingen.Ligate het ene uiteinde van de aorta en alle takken, met uitzondering van de superieure mesenterische slagader en de coeliakie stam, om lekkage te voorkomen, en steek een vier-millimeter arteriotomie canule in het andere uiteinde van de aorta. Plaats vervolgens de alvleesklier in de orgelkamer en sluit de canule in de alvleesklier aan op een mannelijke Luer. Vervolgens, doorsnede de alvleesklier met oplossing drie voor een uur op 20 milliliter per minuut, en vries de dubbel-doordrongen alvleesklier bij min 20 graden Celsius in oplossing vier tot het begin van de decellularisatie.Op de dag van het starten van decellularisatie ontdooit u de alvleesklier bij vier graden Celsius en plaatst u de ontdooide alvleesklier in de decellularisatieorgaankamer. Sluit de wasmiddelinlaatbuis aan op de aorta van de alvleesklier en was de alvleesklier met oplossing drie bij 20 milliliter per minuut 's nachts bij vier graden Celsius. De volgende ochtend decanteer u elke oplossing die nog in de orgelkamer aanwezig is en doorsneed u de alvleesklier gedurende 30 minuten op 20 milliliter per minuut in oplossing vijf bij vier graden Celsius.Aan het einde van de oplossing vijf perfusie, doorsnede de alvleesklier gedurende acht uur op 20 milliliter per minuut in oplossing zes en vier graden Celsius, gevolgd door een 96-uurs wassen in verse oplossing vijf bij 20 milliliter per minuut en vier graden Celsius. Vervang de was met 500 milliliter DPBS aangevuld met calcium en magnesium gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius, gevolgd door perfusie met 250 milliliter oplossing zeven gedurende vier uur bij 20 milliliter per minuut en 37 graden Celsius. Was vervolgens het orgel nog 120 uur met verse oplossing vijf op 20 milliliter per minuut en vier graden Celsius en bewaar het orgel in oplossing acht.Hier kan de grove morfologie van een normale alvleesklier, die lichtroze lijkt en milt, verbinding en duodenale kwabben bevat, worden waargenomen. Na decellularisatie gaat de roze kleur verloren en lijkt de verwerkte alvleesklier lichtwit van kleur. In een normale alvleesklier, veel blauwe kernen zijn duidelijk door H en E vlekken, terwijl in een gedecellulariseerde alvleesklier de kernen niet langer kunnen worden gevisualiseerd, bevestiging van hun verlies.De geïsoleerde intacte varkensalvleesklier, na deze procedure, zal het mogelijk maken een volledige perfusie en succesvolle decellularisatie met behoud van de structuur en ook waardoor een aantal extracellulaire matrix eiwitten worden verkregen. De gedecellulariseerde alvleesklier kan worden gebruikt voor het ontwikkelen van hele-orgaan recellularisatie strategieën in bioreactor systemen met relevante celtypes. Na recellularisatie met ontvanger stamcellen, het weefsel gemanipuleerde alvleesklier kan worden gebruikt voor klinische toepassingen en drugstesten.Vergeet niet dat het werken met Triton X-100 en SDC zeer gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van handschoenen en het voorbereiden van de oplossingen onder rookkap, altijd moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

isolation-and-decellularization-of-a-whole-porcine-pancreas

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Het bereiken van hoge kwaliteit en de juiste hoeveelheid van de menselijke eilandjes is een van de prominente voorwaarden voor een succesvolle transplantatie eilandjes van Langerhans. In deze video, beschrijven we stap voor stap de procedures voor de menselijke eilandjes van Langerhans isolatie (deel I: de spijsvertering en het verzamelen van de pancreas weefsel) met behulp van een aangepaste automatische methode.

Human eilandjes van Langerhans Isolatie: Deel I: Spijsvertering en verzameling van alvleesklierweefsel

This video describes the technique used for isolating pancreatic acinar cells--exocrine cells--containing a variety of digestive enzymes. Primary acinar cells are useful in the ex vivo study of acinar-to-ductal metaplasia (ADM)--an early event in developing pancreatic cancer.

Primary Acinar Cell Isolation: A Method to Isolate Acinar Cells from Mouse Pancreas

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other important biological functions. This protocol explains a method for isolating pancreatic islets by first perfusing collagenase via Ampulla of Vater to digest the exocrine pancreatic tissue and a simplified density gradient centrifugation to purify the islets from mice.

Pancreatic Islets Isolation through Collagenase Perfusion: An Enzymatic Method to Isolate Pancreatic Islet Cells

Het testen in vitro β-celfunctie met geïsoleerde eilandjes van Langerhans muis is een belangrijke component in de studie van diabetes pathofysiologie en therapie. Terwijl veel downstream applicaties beschikbaar zijn, dit protocol beschrijft specifiek de meting van intracellulaire cyclische adenosine monofosfaat (cAMP) als een essentiële parameter bepalen van β-cel functie.

Een methode voor muis eilandjes van Langerhans Isolatie en intracellulaire cAMP Bepaling

Dit eilandje isolatie protocol beschreef een roman route van Collagenase injectie om het exocriene weefsel te verteren en een vereenvoudigde gradiënt procedure om de eilandjes van muizen te zuiveren. Het gaat om enzymatische spijsvertering, gradiënt scheiding/zuivering en eilandje hand-picking. Succesvolle isolatie kan 250 – 350 hoge kwaliteit en volledig functionele eilandjes per muis opleveren.

Een eenvoudig hoog rendement protocol voor isolatie van de alvleesklier eiland van muizen

Decellularized extracellulaire matrix (dECM) kan geschikte micro-omgevings aanwijzingen bieden om de inherente functies van doelweefsels in een Engineered constructie te recapituleren. Dit artikel verheldeert de protocollen voor de decellularisatie van pancreas weefsel, evaluatie van decm bioink van de alvleesklier weefsel, en generatie van 3D-alvleesklier weefsel constructies met behulp van een bioprinten techniek.

Pancreatic weefsel-afgeleide extracellulaire matrix Bioink voor het afdrukken van 3D Cell-beladen alvleesklier weefsel constructies

Dit protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor de aanschaf van een alvleesklier van varkens voor isolatie en zuivering van eilandjes.

Chirurgische perfusie en isolatie van de alvleesklier van varkens voor isolatie van eilandjes

Deze studie ontwikkelde een vereenvoudigde methode om efficiënt functionele primaire eilandjes en acinaire cellen uit de muizenalvleesklier te extraheren, wat een waardevol hulpmiddel biedt voor het bestuderen van intercellulaire communicatie in de pathogenese van Acute Pancreatitis-geïnduceerde Diabetes.

Een eenvoudige en snelle methode voor gelijktijdige isolatie van primaire eilandjes en primaire alvleesklier-acinaire cellen van muizen

Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde methode voor chirurgische oogst, enzymatische vertering en dichtheidsgradiëntzuivering van Lewis rat-pancreaseilandjes, waardoor hoogopbrengst- en hoogzuiverheidspreparaten mogelijk zijn voor direct gebruik in transplantatie- of in vitrostudies .

Isolatie en zuivering van het pancreaseiland door Lewisratten met behulp van enzymatische vertering en dichtheidsgradiëntscheiding

Perfusie decellularisatie is een nieuwe techniek om hele lever scaffolds dat het orgel van de extracellulaire matrix samenstelling en microarchitectuur behoudt produceren. Hierin wordt de werkwijze voor het bereiden gehele orgel steigers met behulp van perfusie decellularisatie en de daaropvolgende herstel van de populatie met hepatocyten beschreven. Functionele en transplanteerbare lever enten kan worden gegenereerd met behulp van deze techniek.

Decellularisatie en Recellularization van Whole Levers

Leer de dissectie en decellularisatie van een intact varkensalvleesklier met koude detergentperfusie. Deze methode behoudt de extracellulaire matrix voor weefselengineering en klinische toepassingen.

Isolatie en Decellularization van een hele varkens alvleesklier

Meer video's verkennen