Label-gratis identificatie van lymfocyt subtypen met behulp van drie-dimensionale kwantitatieve fase Imaging en Machine Learning

Deze methode biedt een alternatief voor conventionele fluorescentie etikettering en flow cytometrie analyse procedure, die tijdrovend, kostbaar, en het risico van het veranderen van de cellulaire functie van de monsters. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de driedimensionale brekingsindextomografie en machine learning zijn labelvrije en kwantitatieve methoden die een snelle en nauwkeurige lymfocytenidentificatie mogelijk maken. De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot de therapie van bloedkankers en auto-immuunziekten als identificatie van lymfocyten kan cruciaal zijn voor de diagnose van de ziekte en de juiste behandeling toepassing.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in lymfocytenpopulaties, kan het ook worden toegepast op de analyse van andere enkele cellen van belang, waaronder bacteriën. Visuele demonstratie van 3D kwantitatieve fase beeldvorming technologie is van cruciaal belang, omdat het vergemakkelijkt een duidelijke instructie over hoe de techniek uit te voeren en kan inzicht geven in de toepassingen ervan. Begin met het verzamelen van elke lymfocyten subset door fluorescentie-geactiveerde celsorling.

Voor een optimale beeldvorming verdunt u elk celmonster tot een concentratie van 180 cellen per microliter rpmi-medium en injecteer u langzaam 120 microliters van het eerste verdunde monster in een beeldkamer. Na bevestiging van een gebrek aan bubbels in de kamer, plaats een druppel gedestilleerd water op de objectieve lens van een 3D-kwantitatieve fasemicroscoop en plaats de beeldkamer op de vertaalfase van de microscoop. Pas het stadium zo aan dat het monster aansluit bij de objectieve lens en klik op focus en oppervlak in het kalibratietabblad van het microscoopperspectief van de beeldvormingssoftware om respectievelijk de axiale posities van de objectieve en condensatorlenzen aan te passen.

Klik op De automatische modus om de objectieve en condensatorlenzen uit te lijnen. Als u de uitlijning wilt optimaliseren, opent u de scanmodus en past u de lenzen handmatig aan om het digitale micromirrorapparaatpatroon naar het midden uit te lijnen. Ga vervolgens terug naar de normale modus en pas de vertaalfase aan om een cel in het gezichtsveld te vinden.

Pas de axiale positie van de objectieve lens aan om het brandpuntsvlak te vinden totdat de monstergrens die in het scherm wordt gevisualiseerd bijna onzichtbaar is. Het is belangrijk om de focus van de cel perfect aan te passen om een optimaal 3DRI tomogram te genereren. Als het beeld niet goed wordt genomen, wordt de 3D-reconstructie aangetast, wat resulteert in een luidruchtig tomogram.

Pas de vertaalfase aan om een locatie zonder cel te vinden en klik op Kalibreren om meerdere 2D-hologrammen met verschillende verlichtingshoeken te meten. Pas de vertaalfase aan om een cel in het midden van het gezichtsveld te vinden. En geef onder het tabblad Acquisitie een naam aan het voorbeeld dat wordt afgebeeld.

Klik op 3D Snapshot om de hologrammen van de cel te meten met dezelfde verlichtingshoeken als voor de 2D-hologrammen die net zijn gemeten. Wanneer de verkregen gegevens worden weergegeven in het deelvenster Gegevensbeheer, klikt u met de rechtermuisknop op de gegevens en klikt u op Proces om een 3D-refractieve indextomogram van de 2D-hologrammen te reconstrueren met behulp van het defractiontomografiealgoritme dat in de imagingsoftware is geïmplementeerd. Klik na beeldvorming in het deelvenster Gegevensbeheer met de rechtermuisknop op de gegevens en klik op Openen om de gegevens te visualiseren.

Klik op het midden van de cel om deze te verplaatsen en klik op RI Tomogram in het deelvenster Gegevensbeheer. Klik op het tabblad Vooraf op Laden en dubbelklik op lymfocyten. xml, een vooraf gedefinieerde overdrachtsfunctie van de imagingsoftware om het tomogram te visualiseren volgens de 3DRI-distributies.

Schuif met de muis om in te zoomen en sleep de cel om deze in elke richting te draaien. Voor kwantitatieve morfologische en biochemische functie extractie plaats alle van de tomografische gegevens in een enkele map en splits de celtypen binnen individuele submappen in de hoofdmap. Open vervolgens het aanvullende functieextractiebestand in de juiste beeldsoftware en bewerk lijn 14 om de tomogrammap aan te wijzen waaruit de gegevens moeten worden geëxtraheerd.

Bewerk regel 15 om de map aan te wijzen waarop de geëxtraheerde functiegegevens moeten worden opgeslagen en voer de code uit. Voor elk tomogram in de gegevensset berekent de code het oppervlaktegebied, het cellulaire volume, de sfericiteit, de eiwitdichtheid en de droge massa per brekingsindexdrempel. Voor begeleid leren en identificatie gebruik maken van de eenvoudige willekeurige splitsing algoritme in MATLAB om willekeurig splitsen van de geëxtraheerde functie gegevens in aparte training en test set mappen.

Open het aanvullende trainingsbestand en bewerk regel 14 om de map met trainingsset, regel 16 aan te wijzen om de map aan te wijzen voor het opslaan van de getrainde classificatie en regel 17 om een bestandsnaam voor de classificatie in te stellen. Voer vervolgens de code uit. Met behulp van de geselecteerde functies van de trainingsset traint de code een classificatie met het K-dichtstbijzijnde buuralgoritme en slaat de classificatie op in de aangewezen map.

Open vervolgens het aanvullende testbestand drie en bewerk de lijnen 14 tot en met 15 om de te testen getrainde classificatie aan te wijzen en lijn 17 om de getrainde testset aan te wijzen. Voer vervolgens de code uit. De classificatie identificeert de celtypen van de afzonderlijke lymfocyten in de testset.

Hier representatieve 3D gerenderde indextomogrammen van B lymfocyten, CD4 positieve T lymfocyten, en CD8 positieve T lymfocyten met verschillende kleurenschema's, die volgens de brekingsindexwaarden worden toegewezen die via de beeldvormingssoftware worden toegewezen worden getoond. Uit de brekingsindexwaarden kunnen kwantitatieve morfologische en biochemische kenmerken worden berekend. In dit experiment was de nauwkeurigheid van de T- en B-lymfocytenclassificatie respectievelijk 93,15% en 89,81% voor de trainings- en testcases.

De CD4 positieve en CD8 positieve T lymfocyten werden statistisch geclassificeerd, en de nauwkeurigheid was 87,41%en 84,38%voor de training en testsets respectievelijk. Ten slotte was de nauwkeurigheid van de classificatie van de groep, celtype respectievelijk 80,65% en 75,93% voor de trainings- en testfasen. De kwaliteit en het aantal beelden zijn essentieel voor het succes van deze techniek.

Hoe beter de beeldkwaliteit en hoe hoger het volume van de gegevens, hoe beter de nauwkeurigheid van de identificatie. Deep learning kan worden gebruikt om de complexe gegevens van de tomogrammen vollediger te analyseren, wat de identificatieprestaties sterk verbetert. Verder kunnen fluorescentie en 3D-kwantitatieve fasebeeldvorming worden gebruikt om het pad van fysiologische rollen van de geïdentificeerde lymfocyten te onderzoeken.

Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van celbiologie en biogeneeskunde om specifieke ziekten te onderzoeken die van belang zijn binnen verschillende organismen. Met name immunologen kunnen baat hebben bij het gebruik van deze nieuwe technologie voor het identificeren van de populatie van belang.