Name: Anaërobe EiwitReiniging en kinetische analyse via zuurstof-elektrode voor het bestuderen van de activiteit van de DesB Dioxygenase en inhibitie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-03T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Leer anaërobe eiwitreiniging en kinetische analyse via zuurstof-elektrode voor het bestuderen van DesB dioxygenase activiteit en inhibitie. Deze methode behoudt enzymactiviteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zouden graag bedanken Dr. Camille Keller van Wesleyan University voor technische ondersteuning. Speciale dank aan Professor Lindsay D. Eltis en Jenna K. Capyk van de University of British Columbia, evenals Christian Whitman van de Universiteit van Texas in Austin, voor hun advies over anaërobe eiwit zuivering methoden en het gebruik van een O2 -gevoelige elektrode.

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten.

De kritische stappen bij het verkrijgen van actieve, gezuiverde eiwit van het DesB betrekking hebben op de vorming en handhaving van de verminderde Fe(II) actieve site in het enzym. Als zodanig, het corrigeren van prestaties van de inductie, zuivering, concentratie en demineralisatie maatregelen zijn noodzakelijk voor het actieve enzym met succes te verkrijgen. Inducerende eiwituitdrukking in aanwezigheid van 1 mM ferro ammoniumsulfaat, zorgt u ervoor dat de Fe(II) correct is opgenomen in de actieve site van DesB. Deze m...

Enzymen die gebruik maken van ijzer of andere metalen te activeren van zuurstof zijn vaak gevoelig voor inactivering tijdens het zuiveringsproces vanwege hun verwijdering uit de vermindering omgeving van een cel. Daarom deze eiwitten als cel lysates moeten worden gebruikt, onderworpen aan externe reductoren of anaëroob gezuiverd worden om ervoor te zorgen dat zij optimaal enzymatische activiteit1,2,3,4. Voor deze enzymen die is zuurstof-gevoelige (specifiek ijzer-bevattende enzymen), uitvoeren van alle stappen voor de zuivering en karakterisering met behoud van anaërobe omstandigheden noodzakelijk om hen volledig te karakteriseren. Dit heeft ertoe geleid dat onderzoekers te ontwikkelen volledige laboratorium set-ups binnen de grenzen van anaërobe kamers voor studies variërend van eiwit expressie t/m kristallografie5,6,7,8 .
Hierin, rapporteren we methodes voor de anaërobe zuivering en kinetische karakterisering van het enzym DesB met behulp van een zuurstof-elektrode-systeem. DesB is een gallate dioxygenase van de bacterie Sphingobium sp. strain Unnethes-6, die betrekking heeft op LigAB, een dioxygenase van de protocatecuate van het hetzelfde organisme. Beide enzymen behoren tot het type II protocatechuate dioxygenase (PCAD) superfamilie die heeft niet uitvoerig bestudeerd tot en met datum9, waarschijnlijk deels te wijten aan enzymen van deze superfamilie wordt gevoelig voor inactivering wanneer gereinigd met behulp van standaard aërobe Eiwit zuivering methoden. Aangezien sommigen van de PCAD enzymen substraat promiscuïteit, tonen terwijl anderen substraat-specifieke2,10, verdere is karakterisering van deze superfamilie nodig om te identificeren specificiteit determinanten. Zoals geconstateerd in verschillende enzym superfamilies11,12,13,14,15, kunnen kleine molecules activiteit via directe competitieve remming of de binding van wijzigen moleculen om te scheiden allosteric zakken waardoor een toename of afname van enzymatische activiteit16. Kinetiek alleen kan niet de locatie van de binding van een modulator differentiëren, bepaling van de omvang van een activiteit wijzigen is belangrijk voor het begrijpen van de effecten. Als dergelijke, methoden voor kinetische karakterisering van inheemse DesB activiteit en de activiteit in aanwezigheid van 4-nitrocatechol (4NC), een verbinding die vaak gebruikt om te karakteriseren en remmen dioxygenase enzymen2,17, 18, worden weergegeven.
DesB is in staat te breken gallaat, een aromatische lignine afkomstige samengestelde, via een extradiol dioxygenase (EDO) reactie in die ring opening wordt gekatalyseerd met behulp van zuurstof als één van de substraten10,19. Deze enzymatische reactie treedt op binnen de context van de afbraak van lignine, een aromatische heteropolymer gevonden in de celwand van planten. Lignine kan worden depolymerized, opbrengst van een verscheidenheid aan aromatische verbindingen die kan worden verder onderverdeeld in Centraal metabolieten3,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Extradiol dioxygenases (EDO) katalyseren een reactie op dihydroxylated aromatische verbindingen, waar decollete grenzend aan een metaal-gecoördineerd diol voorkomt; openen ring in tegenstelling, klieven intradiol dioxygenases analoog aromatische verbindingen tussen de twee hydroxylgroepen (Figuur 1). EDOs, zoals veel andere metalloenzymes, hebben een divalente metalen center voor coördinerende Fe(II) samengesteld uit een twee-histidine, één-carboxylaat triade9,34,35. Deze metalloenzymes worden geoxideerd, via autoxidation of mechanisme gebaseerde inactivatie, overwegende dat het enzym inactief2,36,37,38wordt weergegeven.
In de experimentele procedures die worden beschreven in dit manuscript, gebruiken we DesB, een lid van de PCAD-superfamilie van de bacterie Sphingobium sp. Unnethes-6, te katalyseren van de toevoeging van zuurstof in de C4-C5-band van gallate (figuur 2A). De regiochemistry van deze splitsing is analoog aan LigAB, een protocatechuate-4,5-dioxygenase (figuur 2B). Onderzoek van deze gallate dioxygenase omvatten tot nu toe geen meldingen van stoffen die een remmende werking DesB10,19,39. Met het gebruik van aërobe zuivering methoden tentoongesteld DesB variabele activiteit, terwijl met het gebruik van anaerobe methoden konden we consequent krijgen eiwit met reproduceerbare activiteit. De kinetische studies beschreven hier tonen de methoden voor anaërobe zuivering van DesB, kinetische karakterisering van de reactie van DesB met gallate en de remming van DesB door 4-nitrocatechol (4NC).

<table><tbody><tr><td>Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranodise</td><td>Gold Bio Technologies</td><td>I2481C50</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0400</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>30% Acrylamide</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0158</td><td></td></tr><tr><td>N,N'tetramethyl-ethylenediamine</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0801</td><td></td></tr><tr><td>Amylose Resin High Flow</td><td>New England Biolabs</td><td>E8022S</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) competent Escherichia coli cells</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527I</td><td></td></tr><tr><td>L-cysteine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>gallic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7384</td><td></td></tr><tr><td>4-nitrocatechol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N15553</td><td></td></tr><tr><td>Ferrous ammonium sulfate</td><td>Mallinckrodt</td><td>5064</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dithionite</td><td>Alfa Aesar</td><td>33381-22</td><td></td></tr><tr><td>wheaton serum bottles</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-406G</td><td></td></tr><tr><td>25 mm Acrodisc PF Syringe Filter with Supor Membrane</td><td>Pall Corportation</td><td>4187</td><td></td></tr><tr><td>400 mL Amicon Stirred Cell Concentrator</td><td>EMD Millipore</td><td>UFSC40001</td><td></td></tr><tr><td>76 mm Millipore Ultracel 10 kDa cutoff reconsituted cellulose membrane filter</td><td>EMD Millipore</td><td>PLGC07610</td><td></td></tr><tr><td>DL-dithiothreitol</td><td>Gold Bio Technologies</td><td>DTT50</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-25 coarse desalting gal column</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0033-01</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Crimp-Top Vials</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-391-38</td><td></td></tr><tr><td>Oxygraph Plus Electrode Control Unit</td><td>Hansatech Instruments</td><td>OXYG1 Plus</td><td></td></tr><tr><td>Oxygen Eletrode Chamber</td><td>Hansatech Instruments</td><td>DW1</td><td></td></tr><tr><td>Electrode Disc</td><td>Hansatech Instruments</td><td>S1</td><td></td></tr><tr><td>PTFE (0.0125 mmX25mm) 30m reel</td><td>Hansatech Instruments</td><td>S4</td><td></td></tr><tr><td>Electrode cleaning Kit</td><td>Hansatech Instruments</td><td>S16</td><td></td></tr><tr><td>Spacer paper</td><td>Zig Zag</td><td>beschikbaar bij elke tankstation</td><td></td></tr><tr><td>He-series Dri-Lab glove box</td><td>Vacuum/Atmospheres Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HE-493 Dri-Train</td><td>Vacuum/Atmospheres Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-10</td><td></td></tr><tr><td>DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column</td><td>Fisher Scientific</td><td>k420400-1530</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu;L, Model 701 N SYR, Cemented NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2 syringe</td><td>Hamilton</td><td>80300</td><td></td></tr><tr><td>DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column</td><td>Fisher Scientific</td><td>K420401-1505</td><td></td></tr><tr><td>Emulsiflex-C5 high-pressure homogenizer</td><td>Avestin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B-PER Complete Bacterial Protein Extraction Reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89821</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme from chicken egg white</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12650-88-3</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>ampicillin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7177-48-2</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1421-500</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-3</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris hydrochloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-500</td><td></td></tr><tr><td>Maltose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP684-500</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>G46-500</td><td></td></tr></tbody></table>

anaërobe eiwitreiniging en kinetische analyse via zuurstof-elektrode voor het bestuderen van de activiteit van de desb dioxygenase en inhibitie

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Zuurstof-gevoelige eiwitten, met inbegrip van deze enzymen die gebruik maken van de zuurstof als substraat, kunnen stabiliteit wanneer gereinigd met behulp van traditionele aerobic zuivering methoden hebben verminderd. Dit manuscript illustreert de technische details die betrokken zijn bij het zuiveringsproces van anaërobe, met inbegrip van de voorbereiding van reagentia, buffers en de methoden voor kolom-chromatografie in een handschoen vak en het ontzouten van het eiwit vóór kinetiek. Ook beschreven, zijn de methoden voor de voorbereiding en het gebruik van een zuurstof-elektrode voor het uitvoeren van kinetische karakterisering van een enzym dat zuurstof-met behulp van. Deze methodes worden geïllustreerd met behulp van het enzym dioxygenase DesB, een gallate dioxygenase van de bacterie Sphingobium sp. strain Unnethes-6.

De SDS-pagina gel analyse van afzonderlijke fracties van de reiniging van de DesB-maltose bindende eiwit (MBP) fusion construct (Figuur 3) wordt getoond. De gel blijkt dat het eiwit pure is (MW = 91.22 kDa), met uitzondering van de aanwezigheid van DesB (MW = 49.22 kDa) en MBP eiwit domein (42 kDa) gekloofd van elkaar. Breuken E2 en E3 werden geselecteerd voor concentratie (stap 4.2).
Reproduceerbar...

Hier presenteren we een protocol voor anaërobe EiwitReiniging, anaërobe eiwitconcentratie en latere kinetische karakterisering met behulp van een zuurstof-elektrode-systeem. De methode wordt geïllustreerd met behulp van het enzym DesB, een dioxygenase enzym die meer stabiel actief en wanneer gezuiverd en in een anaëroob milieu opgeslagen.

Anaërobe EiwitReiniging en kinetische analyse via zuurstof-elektrode voor het bestuderen van de activiteit van de DesB Dioxygenase en inhibitie

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Deze methode is ontworpen om belangrijke vragen in de anorganische biochemie te beantwoorden, over hoe enzymactiviteit te behouden in eiwitten die zuurstofgevoelige metalen bevatten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het u helpt visualiseren manieren waarop u handhaven van een eiwit metaal in zijn verminderde staat. Over het algemeen, individuen nieuw in deze techniek zal worstelen, omdat het moeilijk is om materialen en reagentia te handhaven om volledig anaeroob.24 uur na het opwekken van eiwitexpressie, verzamel de cellen door centrifugatie, en resuspend de bacteriële cel pellet in 20 milliliter amylose kolom buffer per 1,5 liter groei. Voeg een milligram lysozyme toe aan de celsuspensie en roer de cellen gedurende 20 minuten op ijs. Aan het einde van de incubatie, lyse de opnieuw oppende celoplossing via hogedrukhomogenisatie met drie tot vijf passen op ongeveer 15.000 psi, en breng het eiwit over naar een 50-milliliter centrifuge buis.Spoel de hoofdruimte met stikstof voor een minuut, en centrifuge de cel lysate om de onoplosbare puin te verwijderen. Breng de supernatant over op ten minste één buis van 50 milliliter en dop het lysaat met een rubberen septum. Met behulp van een naald van 20 meter, langzaam bellen stikstofgas door de oplossing gedurende twee minuten om de zuurstof te verplaatsen.Wikkel vervolgens het septum met paraffinefilm, zet de Parafilm vast met koperdraad en plaats de supernatant in het handschoenenkastje met de kolommaterialen. Wanneer het oplosmiddel net boven het harsbed ligt, in een eerder voorbereide amylose kolom, laad 50 milliliter eiwit supernatant op de kolom, het verzamelen van de flow-through in vijf-milliliter fracties onder matig onder druk stikstof op ongeveer vijf milliliter per minuut. Wanneer alle doorstroom is geëuterd, wast u de kolom met nog eens drie kolomvolumes van amylose kolombuffer.Voeg vijf CV van elutiebuffer toe en verzamel vervolgens handmatig drie milliliterfracties in glazen reageerbuizen onder matig onder druk gebouwde stikstof. Test de oplossingen voor zuurstofaanwezigheid met ferroammoniumsulfaat en dithiothreitol. De oplossing wordt donkerblauw of zwart als er zuurstof aanwezig is, zoals de buis aan de rechterkant.De aanwezigheid van zuurstof zal resulteren in gezuiverd eiwit met een lage katalytische activiteit. Oplossingen met minimale zuurstof aanwezig zal lavendel of lichtblauwe doorschijnende kleur, zoals de buis aan de linkerkant. Gebruik vervolgens een externe stikstoflijn om de geroerde celkamer onder druk te zetten en concentreer het eiwit twee keer op 50 milliliter bij een matige roersnelheid.Concentreer het eiwit vervolgens tot 10 milliliter en filter het geconcentreerde eiwit door een spuitfilter met 0,45 micrometerporiën. Aliquot 150 microliter eiwit in individuele 200-microliter polymerase kettingreactie buizen. Verwijder vervolgens de afgedekte aliquots uit het handschoenenkastje voor onmiddellijke flash-bevriezing in vloeibare stikstof en opslag bij min 80 graden Celsius.Voor DesB-desalting voegt u eerst drie milliliter Sephadex G-25 Grove ontziltingsgel toe aan een boorkosilicatekolom van negen milliliter en was de kolom met twee kolomvolumes ontgastde ontziltingsbuffer. Wanneer de DesB ontdooid is, laad het gezuiverde eiwit op de kolom via een zwaartekrachtgestuurd proces en gooi de flow-through weg voordat je drie druppels eiwit in elk van 12 flesjes eluteert, met ongeveer vijf milliliter ontziltingsbuffer. Om de zuurstofelektrode voor te bereiden, gebruikt u een schaar om een ongeveer 1,5-inch kwadraat van spacerpapier te snijden en kleine driehoeken op elk gezicht van het vierkant te snijden, met spleten in de hoeken om te helpen bij het verpakken van de elektrode.Voeg vijf druppels kaliumchlorideoplossing van 50% toe aan de zilverkleurige anodegroef van de elektrode en sluit de druppels aan zodat ze een continue ring van oplossing vormen. Voeg twee druppels van de kaliumchlorideoplossing toe aan de bovenkant van de platinaelektrode en plaats het spacerpapier voorzichtig op de platina elektrode, waardoor het ruimtepapier glad wordt, zodat er geen luchtbellen zijn. Snijd een ongeveer twee-inch-lange stuk van S4 30m PTFE membraan, en plaats het op de top van de spacer papier, het verwijderen van de randen van het membraan, zodat ze zijn uitgelijnd met de buitenste ring van de elektrode.Duw met behulp van een O-ring applicator een kleine O-ring over de elektrode om het afstandspapier en membraan op de elektrode te beveiligen en plaats een grotere O-ring op de cirkelvormige groef van de elektrode, waarbij ervoor wordt gezorgd dat er geen membraan onder zit. Schuif de bovenste kamer van de elektrode op de basis en schroef de twee stukken aan elkaar. Plaats de geassembleerde elektrode op de basis en sluit de elektrode aan op het bewakingssysteem.Om de snelheid van enzymatische reactie te bepalen, gebruikt u een zuurstofgevoelige Clark-type elektrode, met computerintegratie om het zuurstofverbruik via de elektrodecontrole-eenheid te meten. Voeg een milliliter Tris buffer in het juiste volume van substraat aan de elektrodekamer, en roer de oplossing gedurende 10 seconden. Na 10 seconden sluit u de kamer langzaam af met de zuiger en schroef de bovenkant naar beneden.Gebruik een schoon weefsel om de overtollige vloeistof die uit de kamer wordt verplaatst op te nemen en laat de elektrode in evenwicht brengen waar het een stabiele meting van de zuurstofconcentratie in de oplossing gedurende ten minste één minuut kan produceren. Gebruik vervolgens een gasdichte, 10-microliter spuit om ongeveer een microliter enzym toe te voegen aan de elektrodekamer via de zuiger, en het verzamelen van de snelheid gegevens. Wanneer alle van de snelheid voor een bepaalde substraat concentratie is verzameld, gebruik maken van een plastic buis aangesloten op een side-arm vacuüm fles om de elektrode kamer te legen, en herhaaldelijk spoelen de kamer voor vier tot zes cycli met water.Zet vervolgens de oplossing in de elektrode zoals net aangetoond, met behulp van een nieuwe substraatconcentratie. SDS-PAGE gel analyse van individuele fracties van DesB-maltose bindende eiwit fusie construct zuivering onthult de isolatie van een zuiver eiwitproduct, afgezien van de aanwezigheid van DesB en maltose bindende eiwit domein producten die gespleten van elkaar. Zodra alle kinetische metingen zijn verricht, kan de activiteit van DesB met gallaat, bijvoorbeeld, worden verkregen door de snelheid van zuurstofverbruik in variërende gallaatconcentraties te meten.Omgekeerd kan de remmingssnelheid van DesB met vier-nitrocatechol worden bepaald door de vermindering van het zuurstofverbruik van DesB met één millimolar gallaat in aanwezigheid van verschillende concentraties van vier-nitrocatechol te observeren, wat bijvoorbeeld aangeeft dat vier-nitrocatechol het consumptie van zuurstof en daarmee de DesB-reactie remt. Hoewel deze methode inzicht kan geven in het bestuderen van ferro-afhankelijke dioxygenasenzymen, kan het worden toegepast op andere systemen, zoals andere metalloenzymen. Vergeet niet dat het werken in een handschoenenkastje kan een uitdaging zijn, dus zorg ervoor dat je je niet haast tijdens het uitvoeren van deze techniek.

anaerobic-protein-purification-kinetic-analysis-via-oxygen-electrode

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Wij beschrijven het gebruik van een gestopt-flow instrument zowel de reductieve en oxidatieve halve reacties van...

Toezicht op de reductieve en oxidatieve Half-reacties van een Flavin-afhankelijke mono-oxygenase met Gestopt-Flow Spectrofotometrie

Source: Tokunou, Y., et al, Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates a whole-cell electrochemical method to assess how proton transfer affects extracellular electron transport (EET) in electroactive bacteria. By replacing protons with deuterons using deuterium oxide, the method measures changes in current to reveal a kinetic isotope effect, highlighting the role of...

Measuring the Kinetic Isotope Effect on Microbial Electron Transport Using Deuterium Oxide

Mitochondriën zijn slechts een klein percentage van de plant cel, moeten ze voor een aantal studies worden gezuiverd. Mitochondriën kunnen worden geïsoleerd uit een verscheidenheid van organen van de plant door homogenisering, gevolgd door de differentiaal- en dichtheid kleurovergang centrifugeren te verkrijgen van een hoogst gezuiverde mitochondriale fractie.

Isolatie en respiratoire metingen van Mitochondria van Arabidopsis thaliana

Mitochondriën bevatten verschillende flavin-afhankelijke enzymen die van reactieve zuurstof soorten (ROS produceren kunnen). Controle van ROS is vrijlating uit afzonderlijke sites in mitochondriën uitdagend als gevolg van ongewenste kant reacties. We presenteren een gemakkelijke en goedkope methode voor directe beoordeling van inheemse tarieven voor ROS release met behulp van gezuiverde flavoenzymes en microplate fluorometry.

Gelijktijdige meting van Superoxide/waterstofperoxide en NADH productie door Flavin-bevattende mitochondriale Dehydrogenases

Hier presenteren we een protocol van geheel-cel elektrochemische experimenten te bestuderen van de bijdrage van proton vervoer aan het tarief van extracellulaire elektronentransport via de buitenmembraan cytochromes complex in Shewanella oneidensis heer-1.

Elektrochemische detectie van Deuterium kinetisch-isotoopeffect op extracellulaire elektronentransport in Shewanella oneidensis heer-1

Hier presenteren we een protocol voor de benchtop geïmmobiliseerd metal affinity chromatografie zuivering en verdere reconstructie van een polyhistidine gelabeld, non-Heem ijzer bindende dioxygenase geschikt voor het undergraduate onderwijs-laboratorium.

Benchtop geïmmobiliseerd Metal affiniteitchromatografie, reconstitutie en kwantitatieve analyse van een Polyhistidine gecodeerde Metalloenzyme voor de Undergraduate laboratorium

Protocatechuate 3, 4-dioxygenase (PCD) kan enzymatisch vrij diatomaire zuurstof verwijderen uit een watersysteem met behulp van de substraat protocatechuïnezuur zuur (PCA). Dit protocol beschrijft de expressie, zuivering, en activiteit analyse van deze enzym voor het opruimen van zuurstof.

Expressie en zuivering van Nuclease-vrije zuurstof Scavenger Protocatechuate 3, 4-dioxygenase

We ontwikkelden een praktisch protocol en een analytische benadering om mitochondriale oxidatieve fosforylering en elektronenoverdrachtscapaciteit in verse tumorhomogenaten te evalueren. Dit protocol kan eenvoudig worden aangepast om verschillende mitochondriale functies te onderzoeken die bijdragen aan het initiëren, progressie en behandelingsrespons van kanker.

Analytische bepaling van mitochondriale functie van weggesneden vaste tumorhomogenaten

Hier presenteren we een compilatie van testen om de mitochondriale functie in zoogdiercellen direct te meten, onafhankelijk van hun vermogen om moleculaire zuurstof te consumeren.

Zuurstofonafhankelijke assays om de mitochondriale functie bij zoogdieren te meten

Deze studie introduceert een methodologie voor het bestuderen van xenobiotische effecten op de mitochondriale functie via respirometrische en enzymatische testen. Het onderzoekt de modulatie van de elektronentransportketen in verschillende soorten en biedt inzichten voor de gerichte ontwikkeling van biopesticiden tegen door insectenvectoren overgedragen ziekten.

Onthulling van xenobiotisch transport en effecten in geïsoleerde mitochondriën: inzichten uit respirometrische en enzymatische tests

Dit protocol beschrijft de synthese, hemoglobine-inkapseling en oppervlakte-PEGylatie van hiërarchisch poreuze UiO-66-nanodeeltjes die ontworpen zijn voor zuurstofafgifte. De procedure combineert defectengineering met rekbevorderde biorthogonale conjugatie om zeer doorlatende en fysiologisch stabiele dragers te genereren die geschikt zijn voor biomedische toepassingen.

Synthese, hemoglobine-inkapseling en biorthogonale PEGylatie in hiërarchisch poreuze uiO-66-nanodeeltjes voor zuurstofafgiftetoepassingen

Leer anaërobe eiwitreiniging en kinetische analyse via zuurstof-elektrode voor het bestuderen van DesB dioxygenase activiteit en inhibitie. Deze methode behoudt enzymactiviteit.

Anaërobe EiwitReiniging en kinetische analyse via zuurstof-elektrode voor het bestuderen van de activiteit van de DesB Dioxygenase en inhibitie (Video) | JoVE Journal

Anaërobe EiwitReiniging en kinetische analyse via zuurstof-elektrode voor het bestuderen van de activiteit van de DesB Dioxygenase en inhibitie

Meer video's verkennen