Isolatie van extracellulaire blaasjes aan de lymfkliertest Bronchoalveolar Lavage vloeistof met behulp van een techniek van ultrafiltratie centrifugeren

Deze methode kan helpen bij het aanpakken van vragen met betrekking tot de efficiëntie, herstelopbrengst en zuiverheid van bronchoalveolaire lavage vloeistof afgeleid extracellulaire vesicles met behulp van een ultrafiltratie centrifugatie benadering. We hebben deze techniek direct vergeleken met een ultracentrifugatie- en dichtheidgradiënt zuiveringstechniek. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het eenvoudig, efficiënt en geschikt is voor kleine volumemonsters zoals murine bronchoalveolaire lavage vloeistof.

Wat nog belangrijker is, het biedt een hoge zuiverheid en aanzienlijk hogere schaalbaarheid in vergelijking met een ultracentrifugatie-isolatiemethode. Het aantonen van de procedure zal mr. Norman Garrett III zijn, onderzoeksmedewerker voor mijn laboratorium. Om te beginnen plaatst u een angiocatheter van 22 meter in de luchtpijp van een geëuthanaseerde muis.

Bevestig een insulinespuit met een milliliter ijskoud steriele DPBS, en inboezemen een milliliter in beide van de longen. Trek langzaam de spuitzuiger terug om bronchoalveolar lavage vloeistof, of BAL vloeistof op te halen. En doseer de BAL-vloeistof in een conische buis op ijs.

Trek hierna BAL-vloeistof uit 25 muizen en verdeel het in twee gelijke sets. Centrifuge de BAL vloeistof op 400 keer G gedurende vijf minuten op vier graden Celsius. Verzamel de supernatant en centrifuge het op 15.000 keer G op vier graden Celsius gedurende 10 minuten.

Verzamel vervolgens de supernatant en ga onmiddellijk naar de EV isolatiestappen. Filtreer eerst de supernatant door een 0,2 micrometer steriel spuitfilter. Daarna moet u de centrifugaalfiltereenheid gedurende 10 minuten met steriele DPBS in evenwicht brengen.

Dan centrifugeren de centrifugaal eenheid op 15.000 keer G gedurende 10 minuten op vier graden Celsius. Vul het filter met 15 milliliter BAL-vloeistof. En centrifugeren het op 3.000 G's gedurende 30 minuten op vier graden Celsius.

Daarna was je het retentaat met 14 milliliter steriele DPBS door herhaaldelijk voorzichtig te pipetten. Verheerlijk de filtereenheid op 3,000 G's bij vier graden Celsius gedurende 30 minuten om de DPBS te verwijderen en het retentaat te concentreren. Om de geconcentreerde BAL vloeistof afgeleide EV's te verzamelen, steek je een pipetter in de bodem van de filterunit en trek je het monster terug met behulp van een veegbeweging van links naar rechts.

Dan aliquot de BAL vloeistof afgeleide EV's en bewaar ze op min 80 graden Celsius. U ook beginnen met het overbrengen van de vorige verworven supernatant naar een ultracentrifuge buis. En centrifugeren het op 10.000 G's gedurende 30 minuten op vier graden Celsius.

Verzamel dan de supernatant en centrifuge. Gooi de supernatant weg en hang de EV-pellet opnieuw op in 200 microliters van DPBS. Meng hierna de EV-vering met 300 microliters van 50%iodixanol werkoplossing.

En breng het over op een 15 milliliter ultracentrifugebuis. Voeg vervolgens bufferoplossing toe volgens het tekstprotocol om een verloop van een dichtheidsgradiënt te maken en deze gedurende drie uur en 50 minuten te centrifugeren bij 100, 000 G's. Verzamel de 15% en de 25%iodixanol fracties, en verdun ze in DPBS om het volume te brengen tot 15 milliliter.

Breng de fracties over op een nieuwe ultracentrifugebuis en centrifuge bij 100.000 G's bij vier graden Celsius gedurende 60 minuten. Gooi de supernatant weg en hang de EV-pellets opnieuw op in 50 microliter van steriel DPBS. Om te beginnen nano deeltjes tracking analyse, verdun het EV monster in een milliliter van DPBS.

En laad het monster in een insulinespuit. Bevestig hierna de spuit aan een spuitpomp en meet de deeltjesnummers en -grootte. Stel het cameraniveau in op 14 en de detectiedrempel op één.

Gebruik vervolgens een plaatlezer om de hoeveelheid eiwit in het EV-monster te kwantificeren via colorimetrische detectie. Los een gelijke hoeveelheid EV-eiwit uit elk monster op met een blotting-laadbuffer en DTT. Verwarm vervolgens de monsters op 70 graden Celsius gedurende 10 minuten.

Laad de monsters in een Bis-Tris Plus acrylamide gel en voer elektroforese gedurende 35 minuten. Breng de eiwitten vervolgens over naar een nitrocellulosemembraan met behulp van een droge overdrachtsmethode. Daarna, blokkeer het membraan met vijf procent magere melk gedurende 60 minuten met zachte schommelen.

Incubeer het membraan met een antilichaam aan een EV oppervlakte eiwitmarkering bij vier graden celsius met zacht schommelen 's nachts. Ontwikkel het membraan door het membraan 60 minuten lang uit te broeden met HRP-verbindingsantilichaam bij kamertemperatuur. Was het membraan 10 minuten met tbst-buffer drie keer.

Ten slotte, ontwikkel het membraan met chemiluminescent HRP-antilichaamdetectiereagens voordat u overgaat tot beeldvorming. Om te beginnen met de stroom cytometrie, verdun bal vloeistof afgeleide EV's in 49 microliters van PEB kleuring buffer. Voeg vervolgens drie antilichamen toe aan elk van de monsters, voordat u de monsters bij vier graden Celsius uitbroedt met 60 minuten schommelen in het donker.

Ten slotte verdun de monsters met 40 microliters membraan gefilterde PEB-kleuringsbuffer en voer de stromingscytometrieanalyse uit. In dit protocol werden EV's geïsoleerd van muis BAL vloeistof met behulp van een UFC en UC-DGC methoden. BAL vloeistof afgeleid EV's van normale muizen geïsoleerd door de UFC methode weergegeven kleinere maten en meer uniforme grootte distributie dan de UC-DGC-EV's.

De UFC-techniek had ook aanzienlijk hogere totale deeltjestellingen in vergelijking met de UC-DGC-techniek. De totale eiwitterugwinning gemeten in milligram van de UFC-EV's was ook hoger dan die van de UC-DGC-EV's, wat aangeeft dat de UFC-techniek meer tijd en moeite efficiënt is. Ten slotte werden de BAL vloeistof afgeleide EV's ook verder gekenmerkt via flow cytometrie.

De UFC-EV's en UC-DGC-EV's hebben beide cd63, CD9 en CD81 uitgedrukt. Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om de ultrafiltratie-eenheid membraan rehydrateren met DPBS. Zodra het membraan gehydrateerd is, moet het apparaat te allen tijde nat worden gehouden totdat het wordt gebruikt.

Het ophalen van extracellulaire vesicle retentate uit de filterunit kan een uitdaging zijn. Zorg ervoor dat de pipettepunt van links naar rechts wordt geveegd om de meeste EV's uit de filterunit te halen. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van extracellulaire blaasisolatie om de biologische functies van bronchoalveolaire lavage afgeleide extracellulaire blaasjes te verkennen in zowel normale als pathologische omstandigheden bij kleine dieren.