Fabriceren van een nier Cortex extracellulaire Matrix afkomstige Hydrogel

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van biomaterialen, zoals hoe celmatrix interacties van invloed zijn op sulfaat. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het genereert het eerste materiaal dat nauwkeurig weerspiegelt de inheemse nierschors biochemische micro-omgevingen. Lijn een weefselkweekkap met een onderstootkussen.

Plaats een een liter beker met een roerstaaf, een 150 millimeter steriele weefsel cultuur schotel, en de hele nier in de kap. Vul het bekerglas met 500 milliliter van 1%SDS oplossing. Plaats de nier in de steriele weefselkweekschotel.

Verwijder alle perirenal vet door licht scheren rond de niercapsule met een scalpel. Maak vervolgens een ondiepe incisie van acht tot tien centimeter over het superieure uiteinde van de nier, om de niercapsule open te breken zonder het onderliggende cortexweefsel te beschadigen. Gebruik twee hemostatklemmen om de niercapsule te verwijderen door deze weg te pellen van het cortexweefsel.

Doorsnijd de nier langs het coronale vlak met behulp van de scalpel langs de zijkant van de nier. Isoleer cortexweefsel uit beide helften door het medullar-gebied uit te snijden met de scalpel. Vervolgens, dobbelstenen de cortex weefsel in 0,5 centimeter in blokjes gesneden stukken, en verwijder alle grote, zichtbare vaten.

Om extracellulaire matrix van de nier te isoleren, plaatst u het in blokjes gesneden cortexweefsel in het bekerglas met SDS-oplossing. Bedek het bekerglas met autoclaved aluminiumfolie en plaats het op een roerplaat bij ongeveer 400 RPM, buiten de weefselkweekkap. Na 24 uur roeren, breng het bekerglas in een weefsel cultuur kap.

Voeg een 40 micron steriele cel zeef gemaakt met nylon mesh. Vul dan een aparte bekerglas van 1000 milliliter met 200 milliliter bleekmiddel en plaats het in de weefselkweekkap. Gooi de SDS-oplossing via de celzeef in het bekerglas met bleekmiddel.

Pipet uit de resterende SDS-oplossing, totdat alleen gedecellulariseerd weefsel en de celzeef blijven in het bekerglas. Laat de celzeef in het bekerglas en voeg 500 milliliter verse SDS-oplossing toe. Bedek het bekerglas met dezelfde aluminiumfolie en plaats op dezelfde snelheid als voorheen op een roerplaat.

Na decellularisatie en wassen, breng het gedecellulariseerde weefsel, aangeduid als nier ECM vanaf dit punt, in een 30 milliliter zelfstandige conische buis. En vul het met water van celkweekkwaliteit, totdat al het weefsel onder water staat. Gebruik eerst een weefselhomogenisator om de nier-ECM gedurende twee minuten in de conische buis te homogeniseren, totdat een ondoorzichtige oplossing zonder zichtbare stukjes ECM is verkregen.

Vervolgens dompel de conische buis met de nier ECM in vloeibare stikstof onder totdat het koken rond de buis niet langer aanhoudt. Bewaar de nier ECM op min vier graden Celsius 's nachts. Om het bevroren gedecellulariseerde weefsel te lyofiliëren, maak u de conische buisdop iets los om gasuitwisseling mogelijk te maken en plaats de buis in een lyofielisatiemachine.

Lyophilize de nier ECM voor drie dagen, of totdat het lijkt op een fijne, witte poeder. Om de gel chemisch te verteren en op te solubiliseren, voeg je zorgvuldig gewogen varkenszuur pepsine en 0,01 normaal zoutzuur toe aan een scintillatie vilebel met een roerstaaf. Roer bij ongeveer 500 RPM, totdat alle pepsine is opgelost.

Breng vervolgens de lyophilized kidney ECM over naar de scintillatie vileine en laat de oplossing op een roerplaat op ongeveer 500 RPM gedurende drie dagen om de voorraadnier ECM hydrogel te maken. In een weefsel cultuur kap, pipet de vereiste volumes van celcultuur media, een normale natriumhydroxide en M199 supplement, in een steriele 30 milliliter zelfstaande conische buis. Meng de neutraliserende reagensoplossing met een microspatel.

Gebruik een steriele spuit van één milliliter om het juiste volume van de voorraadnier ECM hydrogel over te brengen naar de neutraliserende reagensoplossing. Gebruik een microspatel om de oplossing voorzichtig te mengen tot een homogene in kleur, hydrogel oplossing wordt verkregen. Vermijd de invoering van luchtbellen door langzaam en voorzichtig roeren.

Om cellen op te nemen in de nier ECM hydrogel, resuspend driehonderdduizend cellen in 10 microliter van medium voor elke hydrogel. Pipet 10 microliters van celsuspensie in de uiteindelijke nier ECM gel. Roer de oplossing met een microspatel tot de cellen gelijkmatig verdeeld zijn.

Gebruik een spuit van één milliliter om het gewenste celkweekapparaat te vullen met de nier ECM hydrogel. Laat de gel een uur lang op 37 graden Celsius instellen voordat u de cellen op de nier-ECM in het celkweekapparaat overzet of plating. Analyse van gedecellulariseerd cortexweefsel door massaspectrometrie, bleek de aanwezigheid van eiwitten geassocieerd met de basilicum lamina, met Collagen-IV en Collageen-I wordt de meest vertegenwoordigd.

Collageen-IV, A1 en A2 ketens, alomtegenwoordig in alle keldermembranen werden bewaard. Collageen-IV, A3 en A5 ketens, alleen aanwezig in keldermembranen van de glomerulus, werden ook gedetecteerd. Gemeenschappelijke iso vormen van Lamininen en Collageen-Ik werden ook ontdekt.

Menselijke nierperitubulaire microvasculaire endotheelcellen, of HKMECs, gekweekt op Collageen-I, nier ECM, en een 1:1 mengsel gel, toonde verschillen in fenotype. HKMECs gekweekt op Collagen-I, weergegeven uniforme CD31 uitdrukking, gezien in het rood. Terwijl HKMECs gekweekt op de twee gels met nier ECM, weergegeven verminderde CD31 expressie in ongelijke distributies.

Matrix type leek niet van invloed vwf expressie, weergegeven in het groen. Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om volledig homogeniseren de gedecellulariseerde nierschors weefsel. Bovendien, bij het mengen van de gel met het neutraliseren van reagentia, vermijd de invoering van luchtbellen.

Microfysiologische systemen maken de studie van de orgaanfunctie in een gecontroleerde laboratoriumomgeving mogelijk. De creatie van dergelijke systemen vereist de implementatie van cellen, matrices en stimuli. De kECM hydrogel hier vervaardigd, zal ons toelaten om dergelijke systemen die de nier micro-omgevingen recapituleren studie.