Name: Isolatie van primaire muisknop hepatocyten door niet-radioactieve L-azidohomoalanine Labeling methode p.a. ontluikende eiwit synthese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Leer de isolatie van primaire muizenhepatocyten via leverperfusie met niet-radioactieve L-azidohomoalanine-labeling. Deze methode detecteert nieuw gevormde eiwitten voor metabool onderzoek naar obesitas en diabetes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Drs. Joonbae Seo en Vivian Hwa voor hun wetenschappelijke inbreng en discussie. Dit werk werd gesteund door de National Institute of Health (NIH) (R01DK107530). T.N. werd gesteund door de PRESTO uit het Japan Science and Technology Agency. Een deel van deze studie werd gesteund door een subsidie van NIH (P30DK078392) voor de spijsvertering ziekte Core onderzoekscentrum in Cincinnati.

Dit protocol bevat het gebruik van laboratorium muizen. Verzorging van de dieren en experimentele procedures werden uitgevoerd volgens de procedures die zijn goedgekeurd door de commissies van de verzorging van de dieren van de centrum van de geneeskunde van het ziekenhuis van de kinderen van Cincinnati.
1. isolatie van primaire muisknop hepatocyten
<ol><li>Pre isolatie preparaten<ol>
<li>450 mL 40% dichtheid kleurovergang buffer bereiden zoals beschreven in tabel 1 en blijven bij 4 ° C (15 mL/muis).</li>
		<li>500 mL van Williams' Medium bereiden zoals beschreven in tabel 1 en houden bij 4 ° C.</li>
		<li>500 mL DMEM bereiden zoals beschreven in tabel 1 en houd op ijs (30 mL/muis).</li>
		<li>500 mL Buffer HBSS (-) voor te bereiden zoals beschreven in tabel 1 en blijven bij 42 ° C in het waterbad (40 mL/muis).</li>
		<li>Bereiden van 500 mL HBSS (+) Buffer met 0,3 mg/mL Collagenase Type X, zoals beschreven in tabel 1 met 30 min incubatie bij 42 ° C in het waterbad (40 mL/mouse).</li>
		<li>De pomp perfusie opgericht door het plaatsen van de intraveneuze (I.V) administratie buis over de latching voetpedaal en door het controleren van de stroom van het spoelen oplossing zonder luchtbellen.</li>
		<li>Opwarmen op de kachel van de buis op 42° C.</li>
		<li>Afkoelen van de centrifuge machine tot 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Narcose en perfusie<ol>
<li>Reinig de werkgebieden en de pomp.</li>
		<li>Spoel de IV pomp-verbonden buis door het uitvoeren van 70% ethanol grondig gedurende 10 minuten.</li>
		<li>Verwijder de resterende ethanol uit de IV pomp-verbonden buis door spoelen met DDW geheel gedurende 10 minuten.</li>
		<li>Veeg de schaar en pincet met 70% ethanol.</li>
		<li>Hiermee plaatst u de muisaanwijzer in een plastic container met een gaas bodem en met de 2 mL Isofluraan doordrenkte gaas onder de Maas om te voorkomen dat het directe contact.</li>
		<li>Ezels de diepte van de verdoving door pedaal reflex (stevige teen snuifje).</li>
		<li>Verwijder de muis wanneer het de gewenste diepte van verdoving heeft bereikt. Opmerking: De tijd van de inductie van de anesthesie mag niet meer dan 1 min.</li>
		<li>Construeer een neus kegel met behulp van een conische tube van 15 mL met 1 mL Isofluraan doordrenkte zeem geduwd aan het uiteinde van de buis.</li>
		<li>Bepalen van de diepte van de verdoving door het bewegen van de neus dichter of weg van de neusgaten van de muis.</li>
		<li>Plaats de muis op het werkplatform met de ventrale zijde naar boven.</li>
		<li>70% ethanol spray over de buikstreek van de muis en open vervolgens de buikholte door het maken van een grote dwarse insnijding van de dermis en buikvlies met behulp van scherpe schaar en getande pincet.</li>
		<li>Controleer vervolgens een verticale snede van de abdominale lagen totdat alle buikorganen zijn volledig blootgesteld met behulp van scherpe schaar en getande pincet.</li>
		<li>Zet kleine en grote darmen naar de linkerkant van de muis met gesteriliseerde met autoclaaf katoen tip tot lever, portal vein en vena cava inferior (IVC) duidelijk worden blootgesteld.</li>
		<li>Invoegen een katheter 24 G IVC alleen op de bifurcatie met recht renale ader zorgvuldig zonder schudden handen om te voorkomen dat de schade van IVC en bloeden. Opmerking: Als bloeden optreedt terwijl u de katheter in IVC invoegt, vervolgens u moet probeert te voegen de nieuwe katheter in een ader van de portal.</li>
		<li>Verwijder de naald van de katheter en de positie van de canule om te voorkomen dat je uit IVC bepalen en sluit vervolgens 24 G canule met perfusie buis met behulp van de verbindingslijn. Opmerking: De aanwezigheid van luchtbellen te voorkomen voordat de perfusie.</li>
		<li>Start de perfusie van de lever met warme HBSS (-) op een debiet van 4 mL/min en afgesneden van de milt ader snel naar afvoer uit het interne bloed met behulp van schaar. Opmerking: Als de cannulation voltooid is, zal de lever beginnen te blanch als gevolg van de verdeling van de Terugvloeiing van de buffer van IVC hepatische aderen. De portal ader wordt gevormd door de Unie van milt en superieure mesenterische aderen; Daarom is het vrij veilig te snijden van de milt ader, omdat het grote en distale uit de lever.</li>
		<li>Blijven perfusie met 35 mL van warme HBSS (-). Opmerking: De lever bleek in kleur als de perfusie volstaat, en de muis nog steeds leven onder verdoving zal worden in dit stadium.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Spijsvertering en extractie<ol>
<li>Perfuse de lever van de muis met warme 35 mL HBSS (+) met inbegrip van Collagenase Type X op een debiet van 4 mL/min.</li>
		<li>Om de paar minuten, de milt ader klem met pincet voor ~ 10 s om het gehele volume van HBSS (+) om te verspreiden in alle anatomische delen van de lever. Opmerking: Lever begint te zwellen na het klemmen van de milt ader als gevolg van de congestie van de buffer.</li>
		<li>Schenk 5 mL bereide warme HBSS (+) met Collagenase Type X in 100 mm petrischaal aan het einde van het proces van de perfusie.</li>
		<li>Afgesneden de perfused lever van de rest van het lichaam voordat u stopt de pomp om te voorkomen dat de terugvoer van bloed in de lever, verwijderen van de galblaas door pincet en vervolgens veeg de lever voorzichtig met een papieren handdoek te verwijderen van het bloed.</li>
		<li>Overbrengen van de lever naar de petrischaal waarin 5 mL bereide warme HBSS (+) en de lever capsule voorzichtig met behulp van rechte-tipped pincet te verwijderen. Opmerking: De lever capsule is een dun laagje bindweefsel dat rond de lever.</li>
		<li>Verspreiden de parenchymal weefsel zorgvuldig met behulp van de verlostang. Voeg toe 15 mL koude DMEM om de petrischaal. Opmerking: Het medium zal draaien bewolkt als gevolg van parenchymal cellen als de lever wordt goed verteerd.</li>
		<li>Schud de gescheurde lever zachtjes om de introductie van de resterende parenchymal cellen in het medium en voeg een ander 15 mL koude DMEM om de petrischaal om de rest van de cellen.</li>
		<li>Pipetteer DMEM met de opgeloste lever door 100 μm cel zeef in een conische tube van 50 mL en houden in ijs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zuivering<ol>
<li>Centrifugeer de celsuspensie bij 60 x g gedurende 2 min bij 4 ° C, verwijder de bovendrijvende vloeistof door vacuüm aspiratie voorzichtig en resuspendeer de pellet in 10 mL DMEM.</li>
		<li>Geresuspendeerde pellet toevoegen als een dunne laag op de bovenkant van 40% dichtheid kleurovergang buffer en centrifugeer bij 800 x g gedurende 10 minuten zonder rem op 4° C.</li>
		<li>Verwijder voorzichtig de bovendrijvende vloeistof met inbegrip van de bovenste laag (DMEM) en de middelste laag (dode of niet-parenchymal cellen), maar niet de onderste laag (Pellet: primaire parenchymal hepatocyten).</li>
		<li>Resuspendeer de primaire cellen met 2-3 mL William's middellange E en overbrengen naar de nieuwe tube van 50 mL om verontreiniging van dode cellen in de wand van de buis te voorkomen.</li>
		<li>7-8 mL William's medium E toevoegen, mengen zachtjes en centrifugeer bij 800 x g voor 1 min bij 4 ° C.</li>
		<li>Verwijder voorzichtig de bovendrijvende vloeistof door vacuüm aspiratie en vervolgens resuspendeer de pellet opnieuw met 10, 20 of 30 mL van William's medium E (op basis van de grootte van de pellet).</li>
		<li>Cellen tellen door middel van een geautomatiseerde cel itemlogboeken.</li>
		<li>Seed met William's medium E, houden van de plaat in een incubator op 37° C gedurende 2-3 uur, vervolgens de middellange with10% FBS DMEM medium met Anti-Anti aan de dode of losse cellen verwijderen en vervangen voor overnachting incubatie bij 37 ° C.</li>
		<li>Volgende dag, zijn primaire muisknop hepatocyten klaar voor experimenteel gebruik.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. chemo-selectieve afbinding reactie Assay voor het opsporen van ontluikende eiwitsynthese
<ol><li>Metabole labeling<ol>
<li>(Voorbehandeling) Primaire hepatocyten met 37 ° C warme PBS tweemaal wassen en voeg het methionine-vrije DMEM medium voor 30 min om afbrekende de cytoplasmatische methionine behoudt zich. Opmerking: L-Azidohomoalanine, is een aminozuur en analoog naar methionine, bevat een deel van de azido die kan worden opgenomen in de eiwitten tijdens de biosynthese van cellulaire eiwitten zodat uitputting van cytoplasmatische methionine de voeding verbeteren zal en de integratie van L-Azidohomoalanine in nieuw samengestelde proteïnen van gekweekte primaire hepatocyten.</li>
		<li>(Behandeling) De primaire hepatocyten Wash met 37 ° C warm PBS tweemaal en voeg het methionine-vrije DMEM medium met 25 μM AHA (L-Azidohomoalanine) voor 4 – 6 h.</li>
		<li>Voeg een specifieke chemische stof (d.w.z. 10 μM rotenon) in het medium voor 4 – 6 h in aanwezigheid van AHA om te onderzoeken van het effect daarvan op de ontluikende eiwitniveaus expressie.</li>
		<li>Na incubatie, verwijderen van het medium door vacuüm aspiratie en wassen van primaire hepatocyten met koude PBS driemaal.</li>
		<li>200 μl lysis-buffermengsel toevoegen aan de plaat en incubeer gedurende 15-30 min op het ijs, dan kantelen van de plaat en nemen de hele cel lysate in 1,7 mL-buis. Opmerking: U moet observeren dat die cel lysate is erg plakkerig tijdens het oogsten van de cel.</li>
		<li>Bewerk de cel lysate op ijs voor 5 ultrasone trillingen ten s drie keer met behulp van een sonde ultrasoonapparaat solubilize van de eiwitten en het verspreiden van het DNA.</li>
		<li>Vortex de cel lysate voor 5 min, centrifugeer de cel lysate bij 21,130 x g gedurende 10 minuten bij 4 oC en breng de duidelijke bovendrijvende substantie in een nieuwe buis. Meet de eiwitconcentratie tweemaal. Opmerking: In dit stadium EiwitSteekproeven kunnen worden achtergelaten bij-20 ° C gedurende twee weken als ze niet onmiddellijk worden gebruikt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Labelen van de Azide gemodificeerde ontluikende eiwit<ol>
<li>De onderdelen (A + B) voor te bereiden door 60 μL van onderdeel a naar component b toe te voegen. Opmerking: De kleur omslaat naar helder roze in kleur (A) aan (B) toevoeg component.</li>
		<li>Voorbereiden van de buffers (D) en (E) volgens het protocol.</li>
		<li>Neem 20-40 μg cel lysate en voeg 50 l 2 x reactie buffer (component A + B), dan pas het volume aan 80 μL door toevoeging van DDW en vortex voor 5 s.</li>
		<li>Voeg 5 l CuSO4 (onderdeel C), en vortex voor 5 s.</li>
		<li>Voeg 5 μl reactie buffer toevoegingsmiddel 1 (vers bereide onderdeel D), dan vortex voor 5 s en wachten op 3 min.</li>
		<li>Voeg toe 10 μL gereconstitueerd reactie buffer additieve 2 (onderdeel E), vervolgens vortex voor 5 s en roteren monsters gedurende 20 minuten bij 4 ° C met behulp van een machine meerdere rotator. Opmerking: De kleur omslaat naar fel oranje in kleur na het toevoegen van de component (E). De monsters moeten worden beschermd tegen licht tijdens de rotatie.</li>
		<li>Toevoegen van 300 μL methanol en vortex voor 5 s, toevoegen van 75 μL chloroform en vortex voor 5 s, voegt u 200 μl DDW en vortex voor 5 s.</li>
		<li>Centrifugeer de monsters op 21,130 x g en 4° C gedurende 5 min, vervolgens de waterige vloeistof wordt weggeworpen en houden de pellet.</li>
		<li>250 μL methanol toevoegen aan de buis, vortex, en spin opnieuw voor 5 min op 21,130 x g.
</li>
		<li>Verwijder het supernatant, dan dekken de monsters met de stofvrije tissue en toestaan dat de pellets te drogen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PAGINA-analyse en het westelijke bevlekken<ol>
<li>Solubilize de pellet in 20 μL van het laden van de buffer zonder β-mercaptoethanol, vortex voor 10 min, warmte bij 70 ° C met behulp van de warmte blok gedurende 10 minuten. Dan laden de monsters in 10% SDS gel (1,5 mm) voor de detectie van de Tetramethylrhodamine (TAMRA).</li>
		<li>AHA-signaal een variabele modus laserscanner gebruikt voor nauwkeurige kwantificatie van ontluikende eiwitten te detecteren.</li>
		<li>Het wassen van de Gel met DDW gedurende 15 minuten.</li>
		<li>Vervolgens vlek de gel SDS 10% met een snelle en gevoelige coomassie-kleurstof reagens voor 15-60 min voor speurder totale eiwitten zoals een besturingselement.</li>
		<li>-De Gel met DDW vlek voor 1-2 h en verwerven van de afbeelding met behulp van een UV fluorescentie imager.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

De auteurs geven dat ze hebben geen conflicten van belang.

Hoewel verschillende vereeuwigd hepatische cellijnen zijn voorgesteld en gebruikt voor het onderzoeken van de lever functies49,50,51,52, deze cellen in het algemeen ontbreekt aan de belangrijke en fundamentele functies van de normale hepatocyten, zoals de uitdrukking van albumine (Figuur 3). Het wordt algemeen erkend, daarom, dat met behulp van primaire hepatocyten...

Eiwit is een belangrijk element van de voeding en ongeveer 50% van het drooggewicht van het menselijk lichaam is samengesteld uit eiwitten die verschillende biologische kenmerken en functies1 hebben. Bijgevolg eiwitsynthese is een van de meeste energie verbruikende gebeurtenissen en een verandering in de stofwisseling van eiwit is sterk gekoppeld aan de ontwikkeling van ziekten, met inbegrip van metabole ziekten2,3,4. In de lever, eiwit biosynthese goed voor ongeveer 20 tot 30% van de totale energie verbruik5,6. Ter vermeerdering, eiwitten functie niet alleen passief bouwen van blokken van de lever, maar ook actief signaal-bemiddelen factoren intracellulair of extracellularly te reguleren de systemische metabolisme7. Bijvoorbeeld, de lagere niveaus van serum albumine, die gesynthetiseerd en uitgescheiden door de lever en de overvloedigste eiwitten in het plasma8, verhoogt het risico van type 2 diabetes ontwikkeling9,10, 11, terwijl een hogere concentratie van serum albumine beschermend is tegen metabool syndroom12te ontwikkelen. Bovendien kan gestoord of verstoring van secretoire of membraan-gebonden hepatische eiwitten, die homeostase van cholesterol moduleren, waaronder lipoproteïnen, LDLR en LRP1, leiden tot de ontwikkeling of insulineresistentie, hyperlipidemie, atherosclerose 13. Daarom, de identificatie van moleculaire pathofysiologische mechanismen die bij eiwit verstoring van het metabolisme in de lever en de bijbehorende metabole complicaties betrokken zijn kan zinvol zijn voor het ontdekken van de roman farmacologische benaderingen om begin retard of het metabole ziektes zoals diabetes, insulineresistentie en non-alcoholische vette lever.
Eiwitsynthese is nauw gekoppeld aan de status van de cellulaire energie (b.v., de vorming van één binding van peptide tijdens de stap van de rek van de eiwitsynthese vereist 4 phosphodiester obligaties14) en wordt gereguleerd door moleculaire trajecten die zin Inter - en intra - cellular nutriënten beschikbaarheid15,16. AMP-geactiveerd proteïne kinase (AMPK) is één van de intracellulaire energie-sensoren die energie homeostase17handhaven. Zodra AMPK wordt geactiveerd wanneer de cellulaire energie niveaus lager worden, functioneren AMPK en haar gerichte substraten om te stimuleren katabole pathways en remmen anabole processen, met inbegrip van eiwit synthese18,19. De regulering van de eiwitsynthese wordt gemedieerd door fosforylering van meerdere factoren van de vertaling en ribosomal eiwitten20. Van de nota, de zoogdieren doel van rapamycin complexe 1 (mTORC1), een belangrijke bestuurder van de eiwitsynthese, is een van de hoofddoelen van AMPK21. Activering van de mTORC1-pathway verbetert de celgroei en proliferatie door stimulerende eiwit vertaling en autophagy20,21. Het is daarom logisch dat activering van AMPK mTORC1-gemedieerde eiwit synthese22kan remmen. Inderdaad, activering van AMPK tegengaat en direct kinaseenzym mTORC1 op threonine residu 2446 (Thr2446) leidt tot de inactivatie23 en onderdrukking van de proteïne biosynthese24. Bovendien kunnen AMPK niet indirect mTORC1 functie door fosforylatie en activering van Tubereuze sclerose complex 2 (TSC2)25 die de upstream regulator van mTORC1 signalering trapsgewijs remmen. Kortom, disregulatie van deze trajecten in de lever is vaak gekoppeld aan de ontwikkeling van metabole ziekten en daarom is er dringend behoefte om effectieve experimentele instrumenten voor het onderzoek naar de rol van deze trajecten in de regulering van energie en eiwit metabolisme in hepatocyten.
Er is een sterkere gelijkenis tussen de functionele eigenschappen van geïsoleerde primaire hepatocyten en in vivo hepatocyten dan met in vitro lever afkomstige cel lijnen26,27,28. Het is aangetoond dat primaire menselijke hepatocyten 77% gelijkenis met die van lever biopsieën delen, overwegende dat HepG2 cellen, die goed gedifferentieerde hepatische kankercellen en op grote schaal gebruikt om te onderzoeken van hepatische functies, vertonen die minder dan 48% in het kader van genexpressie profielen29. Daarom gebruik van primaire hepatocyten, in plaats van vereeuwigd cultuur cellen, is van vitaal belang bij het onderzoeken van hepatische functie en fysiologie, en diverse protocollen beschikbaar zijn voor de isolatie en de cultuur van primaire hepatocyten vooral van ratten30,31. Terwijl de rat hepatocyten handig met een relatief hogere opbrengst van cellen zijn, hebben muis hepatocyten een groter potentieel in vele wetenschappelijke aspecten vanwege de brede beschikbaarheid van genetisch gemoduleerde muizen. Er zijn echter verschillende technische uitdagingen in het isoleren van gezonde en overvloedige primaire hepatocyten van muizen voor cellulaire en moleculaire gebaseerde evaluaties: ten eerste, inbrengen van de canule aan het perfuse van de lever met buffer reagentia is zeer moeilijk te behandelen vanwege de kleine en dunne muis portal ader of vena cava inferior; Ten tweede, een langere tijd van de manipulatie van cellen tijdens de isolatie vermindering kan veroorzaken in cel hoeveelheid en kwaliteit; derde, niet-enzymatische mechanische scheidingsmethoden kunnen leiden tot ernstige schade en een lage opbrengst van levensvatbare geïsoleerde primaire hepatocyten32,33. In de jaren 1980, collagenase perfusie techniek geïntroduceerd voor het isoleren van hepatocyten uit de lever van de dieren34. Deze methode is gebaseerd op collagenase perfusie van de lever35,36,,37, infusie van de lever met calcium complexvormer oplossing38,39, enzymatische spijsvertering en mechanische dissociatie van de hepatische parenchym35. In de eerste stap is de lever van een muis met een calcium [Ca2 +] gratis buffer met een [Ca2 +] complexvormer (ethyleendiamine Dinatriumethyleendiaminetetra-azijnzuuroplossing, NA2EDTA) geperfundeerd. In de tweede stap, is de muis lever geperfundeerd met een buffer van collagenase-bevattende te hydrolyseren van de mobiele-extracellulaire matrix interacties. In tegenstelling tot de buffer die wordt gebruikt in stap 1, de aanwezigheid van [Ca2 +]-ionen in de buffer van de tweede stap is vereist voor effectieve collagenase activiteit, waarna de verteerd lever heeft verder zachtjes en mechanisch gescheiden met behulp van de verlostang tussen de hepatische capsule en parenchymateuze weefsel. Ten slotte, bindweefsel wordt verwijderd door te filteren, en latere centrifugeren scheidt levensvatbare hepatocyten uit zowel niet-parenchymal cellen en niet-levende hepatocyte met het gebruik van dichtheid kleurovergang buffer40,41 ,42. In de huidige studie tonen we een gemodificeerde tweestaps collagenase perfusie techniek te isoleren van de primaire hepatocyten uit de lever van een muis voor de analyse van de eiwitsynthese.
De radiolabeling van eiwitten wordt veel gebruikt om te kwantificeren van de expressie-niveaus, omzet tarieven, en bepalen de biologische distributie van eiwitten,43 , vanwege de hoge gevoeligheid van detectie van radioactiviteit44. Echter, vereist het gebruik van radioactieve isotopen onderzoek sterk gecontroleerde omstandigheden en procedures45. Alternatieve niet-radioactieve methoden zijn ontwikkeld en steeds meer aan populariteit hebben gewonnen. De reactie van de chemo-selectieve afbinding met een Tetramethylrhodamine (TAMRA) methode voor de detectie van de eiwitten is een van hen en is gebaseerd op de chemo-selectieve reactie tussen een azide en alkyn groepen46, die kan worden gebruikt voor het analyseren van cellulaire gebeurtenissen zoals opsporen ontluikende eiwitsynthese en subklassen van glycoproteïnen bewerkt met een azide groep. Voor ontluikende eiwitsynthese, zijn L-Azidohomoalanine (L-AHA, een aminozuur azide gemodificeerde) metabolisch opgenomen in eiwitten en opgespoord door middel van de TAMRA eiwit detectie methode47. Met behulp van deze test in primaire muisknop hepatocyten, laten we zien dat het ontluikende eiwit synthese tarief is strak gekoppeld aan de beschikbaarheid van ATP van mitochondriale en AMPK activering (Figuur 1).
Kortom, gebruik van primaire muisknop hepatocyten is cruciaal voor het onderzoeken van het metabolisme van eiwitten en energie en kwantificeren van de ontluikende eiwitsynthese is waardevol voor het verkrijgen van inzicht in de fysiologische rol van trajecten die relevant zijn voor de ontwikkeling en genezen van hepatocyte-gerelateerde ziekten.

<table><tbody><tr><td>HEPES buffer</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol-bis(&beta;-aminoethyl ether)-tetraacetic acid</td><td>AmericanBio</td><td>AB00505-00025</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (10x) no calcium, magnesium, phenol red</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Density gradient buffer</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvate</td><td>Gibco</td><td>11885-084</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS) (1x)</td><td>Gibco</td><td>1897141</td><td></td></tr><tr><td>Williams medium E, no glutamine</td><td>Gibco</td><td>12551-032</td><td></td></tr><tr><td>L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type X</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>039-17864</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion pump</td><td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex L/S</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>IV administration set</td><td>EXELINT</td><td>29081</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>A water bath</td><td>REVSCI</td><td>RS-PB-200</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Tube heater</td><td>Fisher Scientific</td><td>Isotemp</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Lab, Inc</td><td>0-39613</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>PHOENIX</td><td>10250</td><td></td></tr><tr><td>Autoclaved Cotton Tips</td><td>Fisherbrand</td><td>23-400-124</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Petri Dish</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>Connector (Male Luer Lock Ring)</td><td>Cole-Parmer instrument</td><td>EW-4551807</td><td></td></tr><tr><td>24 G catheters</td><td>TERUMO</td><td>Surflo 24Gx3/4'</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu;m Filter (CELL STRAINERS)</td><td>VWR</td><td>10199-658</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical-bottom centrifuge tubes</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical-bottom centrifuge tubes</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNE</td><td>Invitrogen</td><td>C33370</td><td></td></tr><tr><td>AHA (L-azidohomoalanine)</td><td>Invitrogen</td><td>C10102</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (methionine free)</td><td>Gibco</td><td>21013024</td><td></td></tr><tr><td>L-Cystine Dihydrochloride</td><td>SIGMA</td><td>C2526</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli sample buffer</td><td>BioRad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>SIGMA</td><td>P9599</td><td></td></tr><tr><td>SDS solution (20%)</td><td>BioRad</td><td>161-0418</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL (1M)</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB14044-01000</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase Inhibitor Cocktail</td><td>SIGMA</td><td>P5726</td><td></td></tr><tr><td>Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA)</td><td>BioRad</td><td>500-0207</td><td></td></tr><tr><td>6-well tissue culture plate</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>Digital Heatblock</td><td>VWR</td><td>12621-092</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Multi-Rotator</td><td>Grant-bio</td><td>PTR-60</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Ultrasonic Sonicator</td><td>Cole-Parmer</td><td>GE130PB</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Standard Heavy-Duty Vortex Mixer</td><td>VWR</td><td>97043-566</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>A variable mode laser scanner</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>FLA 9500</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Coomassie-dye reagent</td><td>Thermo Scientific</td><td>24594</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Olympus</td><td>CKX53</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Western Blotting apparatus</td><td>BioRad</td><td>1658004</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Automated cell counter</td><td>BioRad</td><td>TC20</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>FluorChem R system</td><td>proteinsimple</td><td>-</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>p-Ampka (T172) antibody</td><td>Cell signaling</td><td>2535</td><td></td></tr><tr><td>Total-AMPK antibody</td><td>Cell signaling</td><td>5832</td><td></td></tr><tr><td>Albumin antibody</td><td>Cell signaling</td><td>4929</td><td></td></tr><tr><td>beta actin antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-130656</td><td></td></tr><tr><td>Fine scissors and forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie van primaire muisknop hepatocyten door niet-radioactieve l-azidohomoalanine labeling methode p.a. ontluikende eiwit synthese

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Hepatocyten parenchymal cellen van de lever en in dienst nemen van meerdere metabole functies, met inbegrip van synthese en secretie van eiwitten essentieel voor systemische energie homeostase. Primaire hepatocyten geïsoleerd uit de lymfkliertest lever vormen een waardevolle biologische hulpmiddel om te begrijpen van de functionele eigenschappen of de veranderingen die zich voordoen in de lever. Hierin we beschrijven een methode voor het isoleren en de cultuur van de primaire muisknop hepatocyten door het uitvoeren van een tweestaps collagenase perfusie techniek en hun gebruik voor het onderzoeken van eiwit metabolisme te bespreken. De lever van een volwassen muis is sequentieel geperfundeerd met ethyleenglycol-bis Dinatriumethyleendiaminetetra-azijnzuuroplossing (EGTA) en collagenase, gevolgd door de isolatie van hepatocyten met de dichtheid kleurovergang buffer. Deze geïsoleerde hepatocyten levensvatbaar op cultuur platen zijn en de meerderheid van de begiftigde kenmerken van hepatocyten te handhaven. Deze hepatocyten kunnen worden gebruikt voor de beoordeling van eiwit metabolisme met inbegrip van ontluikende eiwitsynthese met niet-radioactieve reagentia. We laten zien dat de geïsoleerde hepatocyten gemakkelijk worden gecontroleerd en bestaan uit een hogere stabiliteit van de kwaliteit en het volume van eiwitsynthese gekoppeld aan energiemetabolisme door gebruik te maken van de chemo-selectieve afbinding reactie met een Tetramethylrhodamine (TAMRA) eiwit detectiemethode en westelijke bevlekkende analyses. Deze methode is daarom waardevol voor het onderzoeken van hepatische ontluikende eiwitsynthese gekoppeld aan energie homeostase. Het volgende protocol worden de materialen en methoden voor de isolatie van kwalitatief hoogwaardige primaire muisknop hepatocyten en opsporing van ontluikende eiwitsynthese.

Primaire muisknop hepatocyten isolatie resulteert in een opbrengst van ongeveer 20 x 106 totaal cellen/muis. Histologisch, live en bijgevoegde primaire hepatocyten verschijnen veelhoekige of typische zeshoekige vorm met duidelijk omschreven membraanachtig grens na een incubatieperiode van 24 h (Figuur 2).
We vergeleken om te bevestigen of geïsoleerde cellen primaire hepatocyten zijn, expr...

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van gezonde en functionele primaire muisknop hepatocyten. Instructies voor het opsporen van hepatische ontluikende eiwitsynthese door niet-radioactieve labeling substraat werden verstrekt om te helpen begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de eiwitsynthese in het kader van de homeostase van de energie-metabolisme in de lever.

Isolatie van primaire muisknop hepatocyten door niet-radioactieve L-azidohomoalanine Labeling methode p.a. ontluikende eiwit synthese

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in verschillende gebieden van metabole ziekte onderzoek over moleculaire veranderingen van leverenergie en eiwit biosynthese in obesitas, niet-alcoholische vette lever, en type twee diabetes. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het de isolatie van functionele primaire muis hepatocyten en detectie leververblijvende eiwitten via een niet-radioactieve etikettering substraat vergemakkelijkt. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang als de perfusie stap is moeilijk te leren vanwege de kleine en dunne muis bloedvaten.Voor leverperfusie, voorzichtig een 24-meter katheter in de Inferieure Vena Cava of IVC net bij de splitsing met de juiste nierader. Verwijder de katheteraaald die de positie van de canule in het IVC behoudt en sluit een 24-meter canule aan met perfusiebuis met behulp van de connector. Begin met het doorsluipen van de lever met warme HBSS-min bij een permanente stroomsnelheid van vier milliliter die snel de miltader snijdt om het interne bloed uit te voeren.Na 10 minuten, doorsnede de muis lever met 35 milliliter HBSS plus aangevuld met Collagenase Type X met een stroomsnelheid van vier milliliter per minuut, klemmen de milt ader voor ongeveer 10 seconden om de paar minuten om de distributie van het perfusaat in de lever te vergemakkelijken. Wanneer alle collagenase is geperfundeerd, breng de lever op een lab weefsel voor het stoppen van de pomp om te voorkomen dat de bloed terugstroom in de lever. Gebruik tangen om de galblaas te verwijderen en veeg de lever voorzichtig af met een vers laboratoriumweefsel om bloed te verwijderen.Plaats de lever in een petrischaaltje van 100 millimeter met vijf milliliter verse warme HBSS plus aangevuld met Collagenase en gebruik verdwaalde tangen om de levercapsule voorzichtig te verwijderen. Gebruik de tangen om het parenchymale weefsel zorgvuldig te verspreiden en voeg 15 milliliter koude DMEM toe aan de petrischaal. Schud de gescheurde lever voorzichtig om de resterende parenchymale cellen los te laten in het medium en voeg nog eens 15 milliliter koude DMEM toe aan de schotel om de rest van de cellen te verwerven.Vervolgens filter de weefseldrijfmest door een 100 micron celzeef in een 50 milliliter conische buis op ijs. Om de primaire muis hepatocyten te isoleren, verzamel de cellen door centrifugatie en resuspend de pellet in 10 milliliter verse DMEM. Leg de cellen voorzichtig over een gradiëntbuffer van 40% voor dichtheidsgradiëntscheiding en gooi de cellen uit de bovenste en middelste lagen na centrifugatie.Resuspend de primaire parenchymale hepatocyte pellet met twee tot drie milliliter van William's Medium E om te voorkomen dat het verzamelen van dode cellen uit de wand van de buis en de overdracht van de cellen in een nieuwe 50 milliliter buis. Meng de cellen met een extra zeven tot acht milliliter van William's E Medium voor centrifugatie en resuspend de pellet in 10, 20, of 30 milliliter verse William's Medium E, afhankelijk van de grootte van de pellet. Na het tellen, zaad zes keer 10 tot de vijfde cellen om elke put van een zes-put plaat voor een twee tot drie uur incubatie bij 37 graden Celsius.Vervang aan het einde van de incubatie het medium door DMEM aangevuld met 10% Foetaal Runderserum en anti-anti om de dode en ongebonden cellen te verwijderen en de cellen 's nachts terug te brengen naar de couveuse. Voeg voor azide-gemodificeerde ontluikende eiwitlabeling 20 tot 40 microgram cellysaat toe aan 50 microliter 2x-reactiebuffer. Breng het volume op 80 microliter met gedestilleerd gedeïsized water en vortex de eiwitoplossing gedurende vijf seconden.Voeg vijf microliter kopersulfaat toe aan de cellen voor nog eens vijf seconden vortex, gevolgd door vijf microliters van reactiebuffer additief een met vijf seconden vortexing. Voeg na een incubatie van drie minuten 10 microliters gereconstitueerde reactiebuffer additief twee toe aan de cellen voor nog eens vijf seconden vortex en draai het monster gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius op een multi-rotator machine beschermd tegen licht. Voeg aan het einde van de rotatie 300 microliter methanol toe aan het lysaat, gevolgd door 75 microliter chloroform en 200 microliter dubbel gedestilleerd water.Verzamel het gelabelde eiwit door centrifugatie en voeg 250 microliters verse methanol toe aan de pellet. Na het vortexen, centrifugeren het lysate opnieuw en bedek de kale pellet met een pluisvrij weefsel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Voor pagina-analyse, oplos de gedroogde pellet in 20 microliter van laadbuffer zonder beta-mercaptoethanol en vortex de pellet gedurende 10 minuten.Verwarm vervolgens het eiwit in een warmteblok van 70 graden Celsius gedurende 10 minuten en laad het monster op een 10% natriumdolkekhylfaatgel voor detectie van tetramethylrhodamine. Gebruik vervolgens een laserscanner in variabele modus voor de precieze kwantificering van de AHA-gelabelde ontluikende eiwitten. Histologisch, levend en bijgevoegd primaire hepatocyten verschijnen typisch veelhoekige of zeshoekige vorm met een duidelijk geschetste membranous grens na 24 uur van cultuur.Om te bevestigen of de geïsoleerde cellen primaire hepatocyten zijn, werden in dit experiment albumine eiwitexpressieniveaus vergeleken in embryonale fibroblasten van muizen, een muizenhepatomacellijn, geïsoleerde primaire muishepatocyten en muislevers. De albumine eiwitexpressie werd gedetecteerd in primaire muishepatocyten en muislevers, maar was niet detecteerbaar in embryonale fibroblasten van muizen of hepatoma cellijncellen. Primaire hepatocyte behandeling met 10 micromolar Rotenone gedurende vier tot zes uur bleek een robuuste inductie van lever-geactiveerde eiwit kinase zoals gedetecteerd door verhoogde fosforylatie niveaus op hepatische AMP-geactiveerde eiwit kinase T172 vergelijkbaar met die waargenomen in vivo.Inderdaad, vijf uur van 10 micromolar Rotenone behandeling had diepgaande remmende effecten op ontluikende eiwitsynthese in behandelde primaire hepatocyten in vergelijking met onbehandelde controlecellen, zoals aangetoond door een chemoselectieve ligatie reactietest. Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om alle vereiste reagentia en mediums op voorhand voor te bereiden. Deze techniek maakte de weg vrij voor de onderzoeker op het gebied van leverabolische pathofysiologie om het moleculaire mechanisme van energie-eiwitregulatie bij obesitas en type twee diabetes in geïsoleerde primaire muishopatocyte te verkennen.

isolation-primary-mouse-hepatocytes-for-nascent-protein-synthesis

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

De novo lipogenese en β-vetzuuroxidatie vormen belangrijke metabole routes in hepatocyte, trajecten die zijn verstoord in verschillende metabole stoornissen, met inbegrip van vette lever ziekte. Hier laten we de isolatie van muizen primaire hepatocyten en beschrijven kwantificering van β-vetzuuroxidatie en lipogenese.

Bepaling van vetzuuroxidatie en Lipogenese in Mouse primaire hepatocyten

Hier worden geoptimaliseerde methoden beschreven om in vivo en in vitro modellen van hepatische steatose te genereren en om de steatotische fenotypes en gerelateerde fysiologische parameters te analyseren.

Geoptimaliseerd Analyse van<em&gt; In Vivo</em&gt; en<em&gt; In Vitro</em&gt; Leversteatose

Het doel van dit protocol is te verkrijgen van hoge levensvatbaarheid en hoog rendement van hepatocyten en sinusoïdale endotheliale cellen van lever. Dit wordt bereikt door zoogdierlevercellen de lever met een type IV collagenase oplossing via de portal ader, gevolgd door differentiële centrifugeren hepatocyten en sinusoïdale endotheliale cellen te verkrijgen.

Zuivering van hepatocyten en sinusvormige endotheliale cellen van lever muis perfusie

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van een menselijke lever chimeer muismodel van familiale hypercholesterolemie met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige hepatocyten. Dit is een waardevol model voor het testen van nieuwe therapieën voor hypercholesterolemie.

Een familiale hypercholesterolemie menselijke lever chimeer muismodel met behulp van geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige hepatocyten

Vertalen van ribosoom affiniteits zuivering (trap) maakt snelle en efficiënte isolatie van celtypespecifieke vertalen mRNA. Hier demonstreren we een methode die hydrodynamische staart-ader injectie combineert in een muismodel van lever repopulatie en val om het uitdrukkings Profiel van het herbevolkende hepatocyten te onderzoeken.

Celtype-specifieke genexpressie profilering in de muis lever

Hier gepresenteerd is een protocol voor de isolatie van muizen hepatocyten van volwassen muis levers met behulp van een gemodificeerde Collagenase perfusie techniek. Ook beschreven is de lange termijn cultuur van hepatocyten in een 3D collageen sandwich setting evenals immunolabeling van de cytoskelet componenten om gal canaliculaire vorming en de respons op de behandeling te bestuderen.

Isolatie en 3D collageen sandwich cultuur van primaire muis hepatocyten te bestuderen van de rol van Cytoskeleton in Gal Canalicular vorming in vitro

Primaire hepatocyten zijn een waardevol hulpmiddel om leverrespons en metabolisme in vitro te bestuderen. Met behulp van in de handel verkrijgbare reagentia werd een verbeterd tijd- en arbeidsefficiënt protocol voor primaire hepatocytenisolatie bij muizen ontwikkeld.

Een verbeterd tijd- en arbeidsefficiënt protocol voor primaire hepatocytenisolatie bij muizen

Vetzuur β-oxidatie is een essentiële metabole route die verantwoordelijk is voor het genereren van energie in veel verschillende celtypen, waaronder hepatocyten. Hier beschrijven we een methode om vetzuur β-oxidatie te meten in vers geïsoleerde primaire hepatocyten met behulp van 14C-gelabeld palmitinezuur.

Meting van vetzuur β-oxidatie in een suspensie van vers geïsoleerde muizenhepatocyten

Hier schetsen en demonstreren we een protocol voor primaire muis lever sinusoïdale endotheelcel (LSEC) isolatie. Het protocol is gebaseerd op levercollageaseperfusie, niet-parenchymale celzuivering door centrifugeren met lage snelheid en CD146 magnetische kraalselectie. We fenotyperen en karakteriseren deze geïsoleerde LSEC's ook met behulp van flowcytometrie en scanning elektronenmicroscopie.

Isolatie en karakterisering van primaire leverbijholteelcellen van muizen

Dit protocol beschrijft hoe celtypespecifieke eiwitetikettering kan worden uitgevoerd met azidonorleucine (ANL) met behulp van een muislijn die een mutant L274G-Methionine-tRNA-synthetase (MetRS*) tot expressie brengt en de noodzakelijke stappen voor gelabelde celtypespecifieke eiwitisolatie. We schetsen twee mogelijke ANL-toedieningsroutes bij levende muizen door (1) drinkwater en (2) intraperitoneale injecties.

Celtypespecifieke eiwitzuivering en identificatie van complexe weefsels met behulp van een mutante methionine-tRNA-synthetasemuislijn

Leer de isolatie van primaire muizenhepatocyten via leverperfusie met niet-radioactieve L-azidohomoalanine-labeling. Deze methode detecteert nieuw gevormde eiwitten voor metabool onderzoek naar obesitas en diabetes.

Isolatie van primaire muisknop hepatocyten door niet-radioactieve L-azidohomoalanine Labeling methode p.a. ontluikende eiwit synthese (Video) | JoVE Journal

Isolatie van primaire muisknop hepatocyten door niet-radioactieve L-azidohomoalanine Labeling methode p.a. ontluikende eiwit synthese

Meer video's verkennen