Fabricage van anisotrope polymere kunstmatige antigeen presentatie van cellen voor CD8 + T cel activatie

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van amino-engineering. Zoals, wat is de rol van deeltjes fysische eigenschappen op biomaterieel immuuncel interacties en activering. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een onafhankelijke controle van de grootte en de vorm van biomimetische deeltjes mogelijk maakt.

De implicaties van deze techniek uit te breiden tot de therapie van kanker als het is een off the shelf deeltjestherapie die kan leiden tot in vivo cel gemedieerde immuunreacties. Hoewel deze methode inzicht kan geven in kanker aminotherapie, kan het ook worden toegepast op andere systemen. Zoals infectieziekten of type 1 diabetes.

Voor microdeeltjessynthese, begin met het wegen van 100 milligram poly (melkzuur-co-glycolzuur) of PLGA, in een scintillatie flacon en het oplossen van de PLGA in vijf milliliter dichloormethaan door vortexing. Plaats een homogenisator in een bekerglas met 50 milliliter 1%polyvinylalcohol, of PVA-oplossing, zodat de homogenisator zo dicht mogelijk bij de bodem van het bekerglas ligt zonder het aan te raken. Zet de homogenisator op de juiste snelheid en voeg de PLGA-oplossing toe aan het bekerglas voor een minuut homogenisatie.

Giet aan het einde van de homogenisatie de polyvinylalcohol PLGA microdeeltjesoplossing in een beker met 100 milliliter 5%PVA-oplossing op een roerplaat in een chemische kap en roer de oplossing gedurende ten minste vier uur. Wanneer het oplosmiddel is verdampt, giet de deeltjesoplossing in 50 milliliter conische buizen en verzamel de deeltjes door middel van centrifugatie. Vervang de supernatant in elke buis door 20 milliliter gedeïoniseerd water en schort de deeltjes opnieuw op door vortexing.

Breng vervolgens het uiteindelijke volume in elke buis tot 50 milliliter met vers gedeïoniseerd water en was de deeltjes nog twee keer zoals net aangetoond. Los voor nanodeeltjessynthese 200 milligram PLGA op in vijf milliliter dichloormethaan en plaats een sonicatorsonde in een beker met 50 milliliter 1%PVA-oplossing op ijs zonder de onderkant van het bekerglas aan te raken. Begin met de sonicatie op 12 watt en voeg onmiddellijk de PLGA-oplossing toe aan het bekerglas voor een sonische soon van twee minuten om nanodeeltjes met een diameter van ongeveer 200 nanometer te genereren.

Giet na sonicatie de PLGA nanodeeltjesoplossing van 1%polyvinylalcohol in een beker met 100 milliliter 5 PVA-oplossing op een roerplaat gedurende vier uur oplosmiddelverdamping in een chemische rookkap. Wanneer alle van het oplosmiddel is verdampt, giet de deeltjesoplossing in 50 milliliter conische buizen voor centrifugatie om alle micro-deeltjes te verwijderen en verwijder de supernatants. Breng vervolgens de nanodeeltjes over in hoge snelheid centrifugebuizen voor drie wasbeurten in gedeïoniseerd water, zoals aangetoond.

Voor polymere deeltjesfabricage, na de laatste wasbeurt, opnieuw opschorten de deeltjes in ongeveer een milliliter vers gedeïoniseerd water en voeg film gieten oplossing aan de deeltjes aan een uiteindelijke concentratie van 2,5 milligram per milliliter deeltjes. Breng de deeltjessuspensie in 10 milliliter aliquots in 75 bij 50 millimeter rechthoekige petrischaaltjes voor een dimensionale stretching. Of in 15 milliliter aliquots in 100 bij 100 millimeter vierkante petrischaal voor tweedimensionale stretching.

Na het drogen 's nachts in een chemische kap, gebruik pincet om de films te verwijderen en trim de randen met een schaar. Voor 1D stretching, plaats de twee korte randen van een film tussen twee stukken van neopreen rubber voor montage op de aluminium blokken van een as van een geautomatiseerde dunne film stretching apparaat. Gebruik vervolgens een Allen-moersleutel om de metalen grepen bovenop het rubber te schroeven om de film op zijn plaats te houden.

Voor 2D stretching, monteren alle vier de randen op vier aluminium blokken om de film te rekken op beide assen meten en de lengte van de film tussen de aluminium blokken op een as voor een D stretching of beide assen voor 2D stretching en bereken de afstand die nodig is om de film te rekken in een of twee richtingen op basis van de gewenste vouw stretch. Plaats vervolgens de film geladen stretching apparaat in een oven op 90 graden Celsius naast een grotere beker van een kleine hoeveelheid water om de film op temperatuur te brengen meer dan 10 minuten. Wanneer het uitrekken is voltooid, laat de film afkoelen tot kamertemperatuur gedurende 20 minuten.

Voor 1D-stretching snijdt u de folie uit het rekapparaat aan de randen. Voor 2D stretching, uitgesneden en sla het middelste vierkant van de film die gelijkmatig is uitgerekt op beide assen. Plaats de films in 50 milliliter conische buizen met niet meer dan twee films per buis en voeg ongeveer 25 milliliter gedeïoniseerd water aan elke buis voor vortexing.

Wanneer de films zijn opgelost, was de deeltjes drie keer in gedeïoniseerd water zoals aangetoond. Het opnieuw opschorten van de deeltjes in ongeveer een milliliter vers gedeïoniseerd water per buis na de laatste wasbeurt. Bevries vervolgens de deeltjes bij min 80 graden Celsius gedurende een uur of 's nachts lyophilisatie.

De volgende ochtend, opnieuw opschorten van de lyophilized micro-of nano-deeltjes op 20 milligram per milliliter in vers voorbereide MES buffer met vortexing. Voeg 100 microliter van de deeltjesoplossing toe aan een polypropyleen microcentrifugebuis met 900 microliter MES-buffer en voeg 100 microliter vers bereide EDC NHS-oplossing toe. Meng de deeltjes door vortexing en incubeer de deeltjes op een omvormer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.

Verzamel aan het einde van de incubatie de deeltjes door centrifugatie en schort de microdeeltjespellets opnieuw op in één milliliter PBS door de nanodeeltjes in één milliliter PBS met vijf seconden sonicatie van twee tot drie watt te laten zweven of opnieuw op te schorten. Voeg vervolgens acht microgram van een geschikt signaal een eiwit en 10 microgram anti muis CD28 antilichaam aan de micro-deeltjes, of 16 microgram van het signaal een eiwit en 20 microgram anti muis CD28 aan de nano-deeltjes. Breng het uiteindelijke volume in elke buis op 1,1 milliliter met PBS en ontcubeer de deeltjes 's nachts op een omvormer bij vier graden Celsius.

De volgende dag, was de deeltjes drie keer in gedeïoniseerd water zoals aangetoond. Deze PLGA nano en micro-deeltjes werden gesynthetiseerd met behulp van de enkele emulsie technieken zoals aangetoond en afgebeeld met behulp van transmissie en scanning elektronenmicroscopie. Na homogenisatie vertoonden de microdeeltjes een gemiddelde diameter van ongeveer drie micrometer.

De bolvormige microdeeltjes hadden een aspect rantsoen van ongeveer een, terwijl de 1D uitgerekt prolaat ellipsoïdale deeltjes had een grotere aspect ratio van ongeveer drie en een half en de 2D uitgerekt oblate ellipsoïdale deeltjes had een aspect ratio van ongeveer 1,2, ruwweg behoud van een aspect ratio van een. Vervoeging efficiëntie resultaten onthullen de vergelijkbare hoeveelheden eiwit op het oppervlak van bolvormige en ellipsoïdale micro-kunstmatige antigeen presenteren cellen, of AAPC en nano-AAPC, waaruit blijkt dat eiwitkoppeling tijdens AAPC synthese optreedt in een concentratie afhankelijke manier. Prolaat ellipsoïdale AAPC bleken hogere niveaus van T-celproliferatie te veroorzaken bij subverzadigende doses dan sferische AAPC met de beste scheiding bereikt bij een dosis van 01 milligram.

Na zeven dagen, handmatig tellen van de T-cellen bleek dat prolaat ellipsoïdale AAPC effectiever stimuleren T-cellen in vergelijking met hun bolvormige tegenhangers op de micro-en nano-schaal in een dosis afhankelijke manier. Na deze procedure kan AAPC in vivo worden beheerd om hun therapeutische werkzaamheid en farmacokinetiek te meten. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van immuno-engineering om het effect van anisotropie op de werkzaamheid van het AAPC te onderzoeken.