Name: Lever-on-a-Chip culturen van primaire hepatocyten en Kupffer cellen voor Hepatitis B-virusinfectie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Leer hoe je primaire hepatocyten en Kupffer-cellen kweekt in een lever-op-een-chip-model voor Hepatitis B-virusinfectie. Deze methode maakt langdurige weefselkweek en farmacologisch onderzoek mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van de Starter van de European Research Council (637304), een Wellcome Trust Investigator Award (104771/Z/14/Z), en door CN Bio innovaties.

<ol><li>Verrier, E. R., Colpitts, C. C., Schuster, C., Zeisel, M. B., Baumert, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Culture+Models+for+the+Investigation+of+Hepatitis+B+and+D+Virus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Cell Culture Models for the Investigation of Hepatitis B and D Virus Infection.</a> Viruses. 8 (9), (2016).</li>
<li>Elaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+underlying+the+dedifferentiation+process+of+isolated+hepatocytes+and+their+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Drug+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms underlying the dedifferentiation process of isolated hepatocytes and their cultures.</a> Current Drug Metabolism. 7 (6), 629-660 (2006).</li>
<li>Konig, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+the+bile+acid+transporter+and+hepatitis+B+virus+receptor+Na%2B%2Ftaurocholate+cotransporting+polypeptide+%28NTCP%29+in+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Kinetics of the bile acid transporter and hepatitis B virus receptor Na+/taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) in hepatocytes.</a> Journal of Hepatology. 61 (4), 867-875 (2014).</li>
<li>Ortega-Prieto, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+microfluidic+liver+cultures+as+a+physiological+preclinical+tool+for+hepatitis+B+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">3D microfluidic liver cultures as a physiological preclinical tool for hepatitis B virus infection.</a> Nature Communications. 9 (1), 682(2018).</li>
<li>Allweiss, L., Dandri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+cccDNA+in+HBV+Maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The Role of cccDNA in HBV Maintenance.</a> Viruses. 9 (6), (2017).</li>
<li>Guo, J. T., Guo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+and+function+of+hepatitis+B+virus+cccDNA%3A+Implications+for+the+development+of+cccDNA-targeting+antiviral+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Metabolism and function of hepatitis B virus cccDNA: Implications for the development of cccDNA-targeting antiviral therapeutics.</a> Antiviral Research. 122, 91-100 (2015).</li>
<li>Lucifora, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+antiviral+properties+of+TLR+ligands+against+HBV+replication+in+immune-competent+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Direct antiviral properties of TLR ligands against HBV replication in immune-competent hepatocytes.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5390(2018).</li>
<li>Hosel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+Virus+Activates+Signal+Transducer+and+Activator+of+Transcription+3+Supporting+Hepatocyte+Survival+and+Virus+Replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B Virus Activates Signal Transducer and Activator of Transcription 3 Supporting Hepatocyte Survival and Virus Replication.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (3), 339-363 (2017).</li>
<li>Mazza, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+production+of+human+liver+scaffolds+for+functional+tissue+engineering+by+high+shear+stress+oscillation-decellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rapid production of human liver scaffolds for functional tissue engineering by high shear stress oscillation-decellularization.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5534(2017).</li>
<li>Hang, T. C., Lauffenburger, D. A., Griffith, L. G., Stolz, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipids+promote+survival%2C+proliferation%2C+and+maintenance+of+differentiation+of+rat+liver+sinusoidal+endothelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Lipids promote survival, proliferation, and maintenance of differentiation of rat liver sinusoidal endothelial cells in vitro.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (3), G375-G388 (2012).</li>
<li>Hwa, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+liver+sinusoidal+endothelial+cells+survive+without+exogenous+VEGF+in+3D+perfused+co-cultures+with+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Rat liver sinusoidal endothelial cells survive without exogenous VEGF in 3D perfused co-cultures with hepatocytes.</a> The FASEB Journal. 21 (10), 2564-2579 (2007).</li>
<li>Khetani, S. R., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+culture+of+human+liver+cells+for+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microscale culture of human liver cells for drug development.</a> Nature Biotechnology. 26 (1), 120-126 (2008).</li>
<li>March, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterned+coculture+of+primary+human+hepatocytes+and+supportive+cells+for+the+study+of+hepatotropic+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Micropatterned coculture of primary human hepatocytes and supportive cells for the study of hepatotropic pathogens.</a> Nature Protocols. 10 (12), 2027-2053 (2015).</li>
<li>Bell, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+primary+human+hepatocyte+spheroids+as+a+model+system+for+drug-induced+liver+injury%2C+liver+function+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease.</a> Scientific Reports. 6, 25187(2016).</li>
<li>Tong, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constrained+spheroids+for+prolonged+hepatocyte+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture.</a> Biomaterials. 80, 106-120 (2016).</li>
<li>Griffith, L. G., Wells, A., Stolz, D. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4176555/">Engineering liver.</a> Hepatology. 60 (4), 1426-1434 (2014).</li>
<li>Domansky, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfused+multiwell+plate+for+3D+liver+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Perfused multiwell plate for 3D liver tissue engineering.</a> Lab Chip. 10 (1), 51-58 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De uitdagingen bij het handhaven van langdurige culturen van PHH verdreven de ontwikkeling van verschillende cultuur modellen met verbeterde functionaliteit en levensduur, elk exposeren differentiële voor- en nadelen. Het wordt nu algemeen erkend dat statische 2D culturen van PHH zijn het nabootsen van bepaalde aspecten van de hepatocyte biologie voor zeer beperkte hoeveelheid tijd. Zo micropatterned12,13, sferoïde culturen14,15, cocultures en 3D lever-on-a-chip culturen16,17 zijn snel ter vervanging van deze meer basissystemen. Vooral bij de studie van besmettelijke ziekten, die coevolved hebben met hun gastheer voor het gebruiken van specifieke microenvironments, wordt de eis voor het verstrekken van fysiologische omgevingen geschraagd door de vaak uitdagend aard van het kweken van de mens-tropic besmettelijke ziekten, zoals hepatitis C-virus, HBV en malaria.
De meest kritische stap in het uitvoeren van 3D lever-on-a-chip culturen is de kwaliteit van het aanvankelijk afkomstige primaire celtypes. Deze cellen dienen te worden getest op hun naleving van capaciteit en alleen vezinkbaar PHH veel moeten worden gebruikt met het oog op succesvolle weefsel vorming en cultuur generatie. Hoewel vers geïsoleerde PHH kan worden gebruikt, hun cryopreservatie is meestal complex en vereist speciale tarief-gecontroleerde diepvriezers.
In tegenstelling tot conventionele statische 2D culturen, de genetische achtergrond van gastheer is te verwaarlozen met betrekking tot de gevoeligheid voor HBV-infectie, en alle hij-tot nu toe geteste hepatocyte donoren kunnen vast te stellen van de HBV-infectie4.
Hoewel de patiënt afkomstige HBV vaststelt infecties van 3D culturen, het is noodzakelijk om gebruik maken van PEG-neergeslagen en sacharose kussen-gezuiverd HBV wanneer met behulp van afleidbare HBV producent cel voor de generatie van virale entmateriaal lijnen. Cel cultuur supernatant direct toegepast op de 3D lever-on-a-chip culturen, of door de aanwezigheid van remmende factoren of als gevolg van een incompatibiliteit van huidige groeifactoren met hepatocyten, niet gemakkelijk leiden tot infectie. Bovendien, bij het selecteren van virale entmateriaal patiënt afkomstige, moet alleen serum worden gebruikt, aangezien plasma onvermijdelijk stolt en verstopping van de microfluidic verspreiding van de cultuur-platform.
Ongeacht de virale entmateriaal gebruikt, is cellulaire levensvatbaarheid en differentiatie, evenals het zorgen voor volledige verwijdering van de eerste HBV entmateriaal, sleutel tot succesvolle langetermijnstudies infectie. De handigste manier om dit te doen is bemonstering culturen volgend op het verwijderen van de virale entmateriaal, evenals het meten van menselijk serum albumine niveaus gedurende de cultuur. Van de nota, ook voor alle andere beschreven platformen, HBV-infectie, als tot stand gebracht, is niet gemakkelijk verspreid naar niet-geïnfecteerde cellen. Het onderliggende mechanisme hiervoor blijft ongrijpbaar aangezien HBV-infectie in vivo gemakkelijk de meerderheid van de hepatocyten binnen de lever infecteert.
Met betrekking tot cocultures PHH en Kupffer cellen is het raadzaam voor het uitvoeren van veel tests van Kupffer cellen te evalueren IL6 en TNFα secretie in reactie op de stimulatie van de LP's, aangezien niet alle verkrijgbare Kupffer cel donoren een gelijke responsiviteit hebben.
Nog belangrijker is, voor alle drugs behandelingen of eerste infectie van culturen met HBV, moet het totale volume van de put (1,4 mL), evenals vanaf het microfluidic kanaal (0,2 mL), men in aanmerking voor de berekening van de drug of entmateriaal concentraties. Om te verzekeren nauwkeurige dosering, wordt een wassen stap met medium dat HBV of drugs uitgevoerd om het kanaal microfluidic prime.
Het gebruikte platform maakt gebruik van 600.000 PHH per putje, waarbij meerdere lagen hepatocyten binnen de steigers. Hoewel het nummer van de cel kan worden gevarieerd, de concentratie van de gekozen cel zorgt voor optimale resultaten. De indeling van de plaat behaalde een totaal van 12 steigers, die kan worden opgewaardeerd tot 36 steigers. Als gevolg van de eisen van de microfluidic is opschalen naar hoge goed cijfers echter niet mogelijk is tot nu toe.
Met behulp van deze benaderingen, kunnen culturen worden gehandhaafd met optimale mobiele prestaties voor ten minste 40 dagen, die tot dusver ongekende mogelijkheden biedt te evalueren van de roman drugkandidaten, evenals het bestuderen van de complexe wisselwerking tussen verschillende hepatische cel populaties tijdens HBV-infectie.

De studie van HBV is door de slechte gevoeligheid van cultuur systemen, waarvoor honderden tot duizenden HBV genoom kopieën per cel tot de infectie1is ingewikkeld. Bovendien, primaire menselijke hepatocyten zijn over het algemeen bijzonder kwetsbaar en snel dedifferentiate tijdens conventionele culturen2. Dit is voornamelijk te wijten aan het feit dat de vlakke en harde kunststof oppervlakken niet na te de natuurlijke extracellulaire omgevingen binnen de lever en het algemene gebrek aan oxygenatie van de culturen in de afwezigheid van microfluidic circulatie gevonden bootsen doen. Conventionele statische hepatocyte culturen op collageen beklede platen snel dedifferentiate en verliezen hun gevoeligheid voor HBV-infectie3. Hier beschrijven we de set-up en besmetting van PHH gegroeid in 3D lever-on-a-chip culturen, die enorm voordelig voorbij conventionele 2D statische PHH culturen op collageen beklede platen als gevolg van hun uitgebreide metabole en functionele bevoegdheid zijn, te vergemakkelijken op lange termijn culturen van ten minste 40 dagen4. In dit systeem worden PHH overgeënt op collageen beklede steigers, die voortdurend zijn geperfundeerd met groeimedium voor de levering van zuurstof en voedingsstoffen naar de cellen. Hoewel alternatieve cultuur systemen voor PHH gebaseerd op complexe cocultures van lymfkliertest fibroblasten of 3D groei in spheroïden zijn gevalideerd en vatbaar zijn voor HBV-infectie met behulp van multipliciteit van infectie van 500 genoom equivalenten (GE) van HBV per cel, 3D lever-on-a-chip culturen blijven de enige in vitro modelsysteem die vatbaar zijn voor 0.05 GE van HBV per cel4. Dit wordt bovendien ondersteund door de noodzaak van het gebruik van hoge concentraties van dimethylsulfoxide (DMSO) en polyethyleenglycol (PEG) om vast te stellen van de HBV-infectie in deze culturen, die is overbodig voor de infectie van 3D lever-on-a-chip cultuur systemen 4. onder de belangrijke kenmerken van HBV-infectie is het zwembad van cccDNA, die als de transcriptionele sjabloon voor alle de novo-geproduceerd virionen5,6 fungeert. Hoewel cccDNA kan worden opgespoord in conventionele hepatocyte culturen7,8, het blijft onduidelijk of de regulering van cccDNA en eventuele therapeutische benaderingen, gericht op de afschaffing zijn gerecapituleerd gedeeltelijk of volledig dedifferentiated hepatocyten. We hebben aangetoond dat cccDNA functioneel wordt gevormd in 3D lever-on-a-chip culturen, reageert op fysiologische stimuli, en kan worden gericht door te interfereren met de toegankelijkheid van de transcriptionele machine de cccDNA genoom4.
Host-Reacties op HBV-infectie in 3D lever-on-a-chip mimic die bij HBV-geïnfecteerde patiënten waargenomen, zodat de identificatie van biomarkers voor infectie, evenals therapeutisch succes. Onder de unieke kenmerken van de culturen van de lever-on-a-chip is de mogelijkheid om op lange termijn host reacties tussen PHH en andere cellen van de nonparenchymal binnen de lever, met inbegrip van Kupffer cellen4Notti cellen9en lever sinusvormige evalueren endotheliale cellen10,11. Dit biedt de unieke kans om te evalueren van de cel/interacties in een complexe 3D communicatie.
De periode van de uitgebreide cultuur van dit platform vergemakkelijkt bovendien de beoordeling van de sequentiële drug behandelingen en hun impact op HBV persistentie, die niet mogelijk met behulp van conventionele hepatocyte cultuur systemen.
Dit protocol beschrijft hoe 3D-lever-on-a-chip culturen worden gegenereerd, monocultuur van PHH of voor cocultures van PHH met Kupffer cellen. Daarnaast beschrijven we de productie van gezuiverde HBV voor lage-multipliciteit-van-infectie studies, evenals de daaropvolgende analyse van host en virale reacties.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>William's E Medium, no phenol red</td><td>GIBCO</td><td>A12176-01</td><td></td></tr><tr><td>Hepatocyte Thaw Medium</td><td>GIBCO</td><td>CM7500</td><td></td></tr><tr><td>Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements</td><td>GIBCO</td><td>CM3000</td><td></td></tr><tr><td>Primary Hepatocyte Maintenance Supplements</td><td>GIBCO</td><td>CM4000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>GIBCO</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM</td><td>GIBCO</td><td>12491023</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td><td>GIBCO</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100x</td><td>GIBCO</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat Inactivated, sterile-filtered, suitable for cell culture</td><td>SIGMA</td><td>12106C</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>SIGMA</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Merck</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Collagen from calf skin</td><td>Merck</td><td>C9791</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>SIGMA</td><td>G418-RO</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>SIGMA</td><td>T3258</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene glycol 8000</td><td>SIGMA</td><td>P2139</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>SIGMA</td><td>SO389</td><td></td></tr><tr><td>Sodium carbonate anhydrous</td><td>SIGMA</td><td>451614-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>SIGMA</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>SIGMA</td><td>S2002-5G</td><td></td></tr><tr><td>Sulfuric acid, 99.999%</td><td>SIGMA</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde</td><td>SIGMA</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>SIGMA</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>SIGMA</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>Albumin (human)</td><td>SIGMA</td><td>A9731</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagent&nbsp;Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9701-100</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix II, no UNG</td><td>Applied Biosystems</td><td>4440040</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Select Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4472903</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-eklps</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Kits/Consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile membrane</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>LiverChip Perfusion cell culture plate</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC12</td><td></td></tr><tr><td>LiverChip culture plate lid</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>Sterile round filter paper</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>Cell attachment scaffold</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>Retaining ring</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>Sterile plunger</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC-ST</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy blood &amp; tissue kit</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Human Magnetic Luminex assay</td><td>R&amp;D Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp Viral RNA Mini Accessory Set</td><td>Qiagen</td><td>1048147</td><td>Bevat RNA-drager</td></tr><tr><td>Millicell HY 5-layer cell culture flask, T-1000, sterile</td><td>Millipore (Merck)</td><td>PFHYS1008</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode</td><td>Life technologies</td><td>4309849</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td><td>Life technologies</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>442404</td><td></td></tr><tr><td>Sealing Tape for 96-Well Plates</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15036</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top Filters with PES Membrane</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>295-3345</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp;Microscopic Slides with Ground Edges, Twin Frost</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB58628</td><td></td></tr><tr><td>Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 mL, 25 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Primary cells / Cell lines</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human Plateable Hepatocytes, Transporter Qualified</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HMCPTS</td><td></td></tr><tr><td>Cryopreserved Human Kupffer Cells</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HUKCCS</td><td></td></tr><tr><td>HepDE19 cell line</td><td>Haitao Guo (Indiana University, IN, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Primers/Probes/Standards</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBV DNA forward primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GTGTCTGCGGCGTTTTATCA-3'</td></tr><tr><td>HBV DNA reverse primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GACAAACGGGCAACATACCTT-3'</td></tr><tr><td>HBV DNA probe</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'FAM-CCTCTKCATCCTGCTGCTATGCCTCATC-3'TAMRA</td></tr><tr><td>pgRNA forward primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GAGTGTGGATTCGCACTCC-3'</td></tr><tr><td>pgRNA reverse primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GAGGCGAGGGAGTTCTTCT-3'</td></tr><tr><td>RPS11 forward primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GCCGAGACTATCTGCACTAC-3'</td></tr><tr><td>RPS11 reverse primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-ATGTCCAGCCTCAGAACTTC-3'</td></tr><tr><td>pCMV-HBV</td><td>Professor Christoph Seeger (Fox Chase Cancer Centre, PA, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr>

"lever-on-a-chip" culturen van primaire hepatocyten en kupffer cellen voor hepatitis b-virusinfectie

"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

Ondanks de uitzonderlijke infectiviteit van het hepatitis B-virus (HBV) in vivo, waar slechts drie virale genoom in een chroniciteit van experimenteel geïnfecteerde chimpansees resulteren kunnen, vereisen meest in vitro modellen verschillende honderden tot duizenden virale genoom per cel in om te beginnen een voorbijgaande infectie. Bovendien kunnen statische 2D culturen van primaire menselijke hepatocyten (PHH) alleen op korte termijn studies als gevolg van hun snelle dedifferentiation. Hier beschrijven we 3D lever-on-a-chip culturen van PHH, monoculturen of in cocultures met andere cellen van de lever-ingezetene nonparenchymal. Deze bieden een significante verbetering aan het bestuderen van langdurige HBV infecties met fysiologische host cel reacties. Naast het vergemakkelijken van de drug werkzaamheid studies, toxicologische analyse en onderzoek naar pathogenese, inschakelen deze microfluidic cultuur systemen de evaluatie van genezende therapieën voor HBV-infectie ter opheffing van covalent gesloten, circulaire (ccc) DNA. Dit gepresenteerd methode beschrijft de set-up van PHH monoculturen en co celculturen PHH/Kupffer, hun infectie met gezuiverde HBV en de analyse van de antwoorden van de gastheer. Deze methode geldt met name voor de evaluatie van de effecten op lange termijn van HBV-infectie behandeling combinaties en pathogenese.

Beschrijven we een eenvoudig en veelzijdig platform voor de langetermijnkweek van primaire menselijke cellen van de Kupffer en/of hepatocyten en hun infectie met HBV. Primaire menselijke cellen worden overgeënt op collageen beklede polystyreen steigers binnen een microfluidic plaat vergadering, die voortdurend het perfuses van de cellen met groeimedium (Figuur 1a).
PHH, die meestal alleen stabiel voor een beperkte hoeveelheid tijd in conventionele cultuur systemen, kan functioneel worden gehandhaafd voor langere tijd. Menselijke albumine, die is afgescheiden door functionele hepatocyten en wordt beschouwd als de beste teller voor de evaluatie van hepatische metabolisme, is stabiel en sterk uitgedrukt door 3D culturen tot dag 40 na zaaien (Figuur 2). Voor cocultures, kunnen Kupffer cel functionaliteit en levensvatbaarheid worden geëvalueerd door de afscheiding van bepaalde cytokinen (bijvoorbeeld IL6 en TNFα). Voor het meten van cytokine productie, verdient het gebruik van vangst gebaseerde detectie technieken op LPS-stimulatie van de cocultures (Figuur 3).
Cellen vormen hepatische microtissues, meestal binnen 3 dagen na het zaaien van PHH, demonstreren van functionele gal canaliculi en volledige cel polarisatie (Figuur 2). Naast het behoud van hun fysiologische cellulaire metabolisme, worden deze culturen uitzonderlijk vatbaar voor HBV-infectie. HBV-DNA en andere virale markers, in tegenstelling tot andere systemen van cultuur, worden gemakkelijk opspoorbaar vanaf dag 2 na infectie (Figuur 4). Naast secreted markers van virale infectie, hepatocyte-bevattende steigers kunnen worden opgehaald van de culturen en gebruikt voor de immunofluorescentie opsporing van virale antigenen (bijvoorbeeld, HBsAg, HBcAg) (Figuur 4). Waar conventionele hepatocyte culturen vereisen inoculatie met ten minste 500 HBV GE per cel en de toevoeging van 2% DMSO en 4% PEG, zo weinig als 0,05 HBV GE zijn kunnen initiëren infectie in 3D-culturen zonder de eis van DMSO of PEG (Figuur 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig1.jpg"> Figuur 1: opzet van 3D-lever-on-a-chip culturen. (een) Dit is een schematische lay-out voor de montage van de cultuur-plaat met het oog op de oprichting van microfluidic verkeer. (b) dit paneel toont een vergrote weergave van de putten van de cultuur, met inbegrip van het filtreerpapier, steiger en borgring. (c) dit paneel toont het proces van plaat evenwichtsinstelling vóór het zaaien van de culturen. De volgende twee panelen tonen het proces van zaaien voor (d) hepatocyte monoculturen en (e) hepatocyte/Kupffer-cel cocultures. (f) dit paneel toont de stappen wassen die betrokken zijn bij de middellange wijzigingen. (g) dit paneel toont de HBV-infectie set-up, met inbegrip van de verwijdering van entmateriaal. S.M. = seeding medium, M.M. = onderhoud medium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig2.jpg"> Figuur 2: vorming en hepatocyte levensvatbaarheid van hepatische microtissue. (een) dit paneel toont longitudinale helderveld beelden van 3D hepatocyte monoculturen demonstreren microtissue formatie na zaaien. (b) dit paneel toont immunofluorescentie beeldvorming van culturen voor kernen (blauw) en menselijke albumine (groen). (c) dit paneel toont longitudinale totale albumine, evenals per cel aangepast albumine productie, gedurende 40 dagen van hepatocyte monoculturen, zoals bepaald door ELISA. De gegevens zijn gemiddelde ± SD. Dit percentage is aangepast van Ortega-Prieto et al.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig3.jpg"> Figuur 3: Kupffer cel functionaliteit in de 3D-cocultures. Deze panelen tonen de secretie van (een) IL6 en (b) TNFα in hepatocyte monoculturen en hepatocyte/Kupffer cel 11 dagen na zaaien in reactie op exogenously toegevoegde LPS op dag 9 post zaaien, zoals bepaald met behulp van menselijke magnetische cocultures Luminex assay. Dit percentage is aangepast van Ortega-Prieto et al.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig4.jpg"> Figuur 4: HBV-infectie in de lever-on-a-chip culturen. (een) dit paneel toont de immunofluorescentie microscopie detectie van HBcAg (rood), HBsAg (groen) en kernen (blauw) 10 dagen na de infectie van de culturen met HBV. (b) dit paneel toont de gevoeligheid van de culturen voor HBV-infectie met behulp van verschillende multipliciteit van infectie, zoals bepaald door een kwantificering van HBV-DNA in het supernatant van cultuur. (c) dit paneel toont de kwantificering van de longitudinale accumulatie van HBV pgRNA ten opzichte van het huishouden gen RPS11. De gegevens zijn gemiddelde ± SD. Dit percentage is aangepast van Ortega-Prieto et al.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Het doel van dit protocol is bedoeld als een stapsgewijze handleiding om uit te voeren van de experimenten van de 3-D "lever-on-a-chip" infectie met het hepatitis B-virus.

"Lever-on-a-Chip" culturen van primaire hepatocyten en Kupffer cellen voor Hepatitis B-virusinfectie

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in hepatotropische infecties en leverziekte velden. Zoals de bijdrage van lever ingezeten celpopulaties, aan virale pathogenese, longitudinale infectiekinetiek, mechanismen van virale replicatie, immuuninvasie, in een fysiologisch modelsysteem en medicijnteststudies. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om een levermicro-omgeving samen te vatten.Die langere tijd kan worden gehandhaafd en van nature vatbaar is voor hepatitis B-infectie op fysiologische relevante niveaus. Dit is eerder een fundamentele beperking op het gebied van hepatitis B geweest. De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot therapie of diagnose van HBV-infectie, omdat drug testen studies kunnen worden uitgevoerd in een fysiologisch platform voor langere duur.Dit maakt de evaluatie van sequentiële medicamenteuze behandelingen mogelijk naast het analyseren van de werkzaamheid van bestaande en nieuwe behandelingsstrategieën. Deze methode kan inzicht geven in hepatitis B, en kan ook worden toegepast op andere studies van de ziekte, met inbegrip van andere hepatotropische infecties, leverziekten, of drug metabolisme studies. Over het algemeen, individuen nieuw op deze methode zal worstelen, omdat het aandacht vereist voor bepaalde details om het succesvolle onderhoud van leverweefsel voor langere tijd mogelijk te maken.En ook vertrouwd met de gespecialiseerde gereedschappen en apparatuur. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang. Inclusief de montage van de platen, evenals ontdooien en zaaien van de cellen.Aangezien stappen die betrokken zijn bij de lange termijn cultuur van lever-afgeleide cellen zijn uitdagend bij het gebruik van een nieuw cultuursysteem. Schakel eerst zowel de compressor als de vacuümpomp in die is gekoppeld aan het leverchipplatform. Ga naar een glazen buis kast te monteren en equilibreren van de platen.Plaats een steriel membraan op de plaatbasis om aseptisch de microfluïde platen te monteren. Zorg ervoor dat het steriele membraan soepel op de twee pinnen van de baseplate rust. Voeg vervolgens de goed bevattende bovenplaat toe.Voeg een steriele plaat deksel. En gebruik een geautomatiseerd precisie koppel, ingesteld op 33 pond. Met behulp van een spiraal aanscherping sequentie om de schroeven aan de onderkant van de plaat aan te draaien.Met behulp van een handmatig koppel, zorg ervoor dat alle schroeven worden aangescherpt tot 35 pond. Vervolgens verwarm de hepatocyte zaaien medium tot 37 graden Celsius voor priming. Plaats de volledig geassembleerde plaat in het wasdok.En zorg ervoor dat de plaat volledig inklikt. Voeg 400 microliters hepatocyte zaaien medium aan het reservoir kant van elke put om de plaat prime. Na deze, initiëren stroom in de opwaartse richting gedurende 3,5 minuten op een microliter per seconde.De rode indicatoren aan de zijkant van de plaat geven aan of de microfluïde circulatie goed functioneert. Zodra het medium is gepompt naar de cel-groei kant van de plaat, voeg een extra 1,2 milliliter hepatocyte zaaien medium. Breng de plaat voorzichtig over naar het dockingstation in een bevochtigde couveuse bij 37 graden Celsius en 5% CO2.Start de stroom in de opwaartse richting met een stroomsnelheid van één microliter per seconde gedurende 16 uur. Breng hierna de plaat over naar een wasdok. Voorzichtig pipette op en neer om eventuele bubbels te elimineren.Met behulp van een steriele tang, voeg een steriele ronde filter papier aan elke put. Voeg vervolgens een cel bevestigingsteiger en een behoudende ring aan elke put. Gebruik een steriele zuiger naar beneden te duwen elke put en vergrendelen de ringen en steigers op zijn plaats.Vervolgens, aspirate alle van het medium. En voeg voorzichtig 400 microliters van voorverwarmde hepatocyten zaaien medium over het schavot. Start de stroom in een neerwaartse richting op een microliter per seconde gedurende 3 1/2 minuten.Aspirate alle medium gepompt uit het reservoir kant van de plaat. Voeg 1,4 milliliter hepatocyten zaaien medium aan elke put. Breng de plaat vervolgens terug naar het dok om het totale volume per put tot 1,6 milliliter te brengen.Eerst, pre-warm de hepatocyte ontdooien medium en hepatocyte zaaien medium tot 37 graden Celsius. Vervolgens ontdooien een flesje primaire menselijke hepatocyten volgens de instructies van de leverancier. In een glazen buis kast, resuspend de cellen in een milliliter van hepatocyte zaaien medium.Plaats vervolgens de geresuspendeerde cellen op ijs. Met behulp van trypan blauw, tel de cellen om ervoor te zorgen dat de levensvatbaarheid van de cellen is boven 90%Breng de volledig gemonteerde plaat naar het wasdok. En alle mediums uit de putten aanzuigen.Haal de cellen uit het ijs en voeg 600.000 hepatocyten toe aan elke put in een 500-microliter volume van hepatocyten zaaimedium. Start de stroom in de neerwaartse richting met een stroomsnelheid van één microliter per seconde. Voeg 900 microliter hepatocyten zaaimedium toe aan elke put om het totale volume in elk tot 1,6 milliliter te brengen.Breng de plaat naar het dockingstation in een bevochtigde couveuse bij 37 graden Celsius en met 5% CO2. Start de stroom in de neerwaartse richting met een stroomsnelheid van één microliter per seconde gedurende acht uur. Daarna, draai de stroom naar de opwaartse richting met een stroomsnelheid van een microliter per seconde gedurende acht uur.Breng vervolgens de plaat over naar het wasdok en spoel alle medium uit de putten aan. Voeg 400 microliters van hepatocyte onderhoud medium aan elke put. En initiëren stroom in de neerwaartse richting bij een stroomsnelheid van een microliter per seconde gedurende 3 1/2 minuten.Vervolgens, aspirate alle medium uit het reservoir, en voeg 1,4 milliliter van hepatocyte onderhoud medium. Breng de plaat in het dockingstation in een bevochtigde couveuse op 37 graden Celsius en 5% CO2. Start de stroom in de opwaartse richting met een stroomsnelheid van één microliter per seconde gedurende 48 uur.Na 48 uur, was de plaat door het over te dragen aan het wasdok. Aspirate alle medium uit de putten. En voeg 400 microliter onderhoudsmedium toe.En initiëren stroom in de neerwaartse richting op een microliter per seconde gedurende 3,5 minuten. Dan aspirate alle medium verschijnen in het reservoir kant van de putten. Voeg 1,4 milliliter hepatocyten onderhoudsmedium toe.Breng de plaat vervolgens terug naar het dockingstation in de bevochtigde couveuse. Start de stroom in de opwaartse richting met een stroomsnelheid van één microliter per seconde gedurende 48 uur. Vervang het medium met behulp van dit was-en-vervang proces om de 48 uur.Primaire menselijke hepatocyten zijn meestal slechts stabiel voor een beperkte hoeveelheid tijd bij het gebruik van conventionele cultuursystemen. Echter, met behulp van het protocol hier beschreven, kunnen ze functioneel worden onderhouden voor langere perioden. Menselijke albumin wordt afgescheiden door functionele hepatocyten, en wordt beschouwd als de beste marker voor de evaluatie van hepatische functionaliteit.Albumin wordt gezien als stabiel en zeer uitgedrukt door 3D-culturen tot ten minste dag 40 na het zaaien. Voor coculturen worden de functionaliteit en levensvatbaarheid van Kupffer-cellen geëvalueerd door de afscheiding van specifieke cytokinen te meten. Zoals hier te zien, geven de gemeten niveaus van IL-6 en TNF alpha aan dat cellen functioneel onderhouden en levensvatbaar waren.Naast het behoud van hun fysiologische cellulaire metabolisme, werden deze culturen uitzonderlijk gevoelig voor HBV-infectie. HBV DNA en andere virale markers zijn gemakkelijk detecteerbaar vanaf dag twee na infectie. Terwijl conventionele culturen inenting vereisen met ten minste 500 HBV genoomequivalenten aangevuld met DMSO en PEG, zijn deze 3D-culturen besmet met slechts 05 niet-aangevulde genoomequivalenten.Naast uitgescheiden markers van virale infectie, hepatocyte-bevattende steigers worden opgehaald uit deze culturen. Immunofluorescentie microscopie blijkt dat deze steigers virale antigenen bevatten. Tijdens een poging deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om voorzichtig te zijn bij de behandeling van de hepatocyten voor het zaaien om celdood te voorkomen.Daarnaast is het essentieel om ervoor te zorgen dat de platen correct worden gemonteerd en alle stroomkanalen een correcte mediacirculatie mogelijk maken voordat de hepatocyten worden ingezaaid. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals immunofluorescentie worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden. Inclusief de locatie en frequentie van geïnfecteerde cellen in het weefsel.De fysiologische toestand van de hepatocyten kan ook worden beoordeeld door kleuring voor albumine of leverstructuren, waaronder strak knooppunteiwit ZO-1. Na deze ontwikkeling maakt deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van virologie om hepatitis B-infectie en immuunresponsen in een fysiologisch 3D-modelsysteem te onderzoeken. Vergeet niet dat het werken met het hepatitis B-virus gevaarlijk kan zijn, en voorzorgsmaatregelen zoals eerdere vaccinatie, het gebruik van geschikte beschermingsmiddelen en het werken volgens passende bioveiligheidsrichtlijnen moeten altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

liver-on-chip-cultures-primary-hepatocytes-kupffer-cells-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Er wordt een techniek beschreven om menselijke hepatocyten en niet-parenchymale levercellen van dezelfde donor te isoleren. De verschillende leverceltypen vormen de basis voor functionele levermodellen en weefselengineering. Deze nieuwe methode streeft ernaar om levercellen met een hoge opbrengst en levensvatbaarheid te isoleren.

Protocol voor isolatie van primaire menselijke hepatocyten en Overeenkomstige Major Populaties van niet-parenchymale Liver Cells

Hier beschrijven we een nieuw ontwikkelde hepatitis B-virus (HBV) reportersysteem de vroege stadia van de levenscyclus HBV controleren. Deze vereenvoudigde in vitro systeem zal helpen bij het screenen van anti-HBV middelen met een high-throughput strategie.

Ontwikkeling van een Hepatitis B Virus reportersysteem de vroege stadia van de replicatiecyclus Monitor

Hier tonen wij een enzymatische benadering van primaire hepatocyten te isoleren van volwassen muizen, en beschrijven we de kwantificering van een ontstekingsreactie middels ELISA en real-time PCR.

Inductie van een ontstekingsreactie in het jeugdwerk hepatocytenculturen van Muizen

Hier is een protocol voor de effectieve onderdrukking van replicatie van het hepatitis B-virus (HBV) in muizen door gebruik te maken van de adoptieve celoverdracht (ACT) van stamcel afkomstige virale antigeen (AG)-specifieke T-lymfocyten. Deze procedure kan worden aangepast voor mogelijke op ACT gebaseerde immunotherapie van HBV-infectie.

Stamcel afkomstige virale AG-specifieke T-lymfocyten onderdrukken HBV-replicatie bij muizen

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor hepatitis B-virus (HBV) infectie in nieuwe 293T cellen (293T-NE-3NRs, uitdrukken van menselijke NTCP, HNF4α, RXRα en PPARα) en traditionele levercellen (HepG2-NE, uitdrukken van menselijke NTCP).

Modellering hepatitis B-virusinfectie in niet-leverloze 293T-NE-3NRs-cellen

Dit protocol beschrijft het gebruik van een speciale intraveneuze katheter, gestandaardiseerde steriele wegwerpslangen, temperatuurregeling aangevuld met real-time monitoring en een alarmsysteem voor tweestaps collagenaseperfusieprocedure om de consistentie in de levensvatbaarheid, opbrengst en functionaliteit van geïsoleerde primaire rathepatocyten te verbeteren.

Isolatie van primaire rattenhepatocyten met multiparameterperfusiecontrole

Een langdurig ex vitro 3D-organoïde kweeksysteem werd opgezet uit muizenhepatocyten. Deze organoïden kunnen worden gepasseerd en genetisch gemanipuleerd door lentivirusinfectie van shRNA / ectopische constructie, siRNA-transfectie en CRISPR-Cas9-engineering.

Vaststelling en genetische manipulatie van Murine Hepatocyte Organoïden

We presenteren een protocol om anti-hepatitis B-virus (HBV) verbindingen te screenen gericht op pre- en post-virale entry lifecycle stadia, met behulp van isothermische titratie calorimetrie om bindingsaffiniteit (KD) te meten met gastheer natrium taurocholaat cotransporting polypeptide. Antivirale werkzaamheid werd bepaald door de onderdrukking van virale levenscyclusmarkers (cccDNA-vorming, transcriptie en virale assemblage).

Een competent hepatocytenmodel dat de toegang tot het hepatitis B-virus onderzoekt via natrium taurocholaat cotransporterend polypeptide als een therapeutisch doelwit

Hier presenteren we een niet-genetische methode om menselijke autologe leversferoïden te genereren met behulp van mononucleaire cellen geïsoleerd uit steady-state perifeer bloed.

Humane leversferoïden uit perifeer bloed voor leverziektestudies

Hier beschrijven we een platform dat niet-invasieve in vivo beeldvorming mogelijk maakt van leversferoïden die zijn geënt in de voorste oogkamer van het oog van de muis. De workflow strekt zich uit van het genereren van sferoïden van primaire levercellen tot transplantatie in het oog van de muis en in vivo beeldvorming met cellulaire resolutie door confocale microscopie.

In vivo beeldvorming van leversferoïden geënt in de voorste oogkamer van het muizenoog

Dit protocol presenteert een geoptimaliseerde tweestaps collagenase-leverperfusietechniek in een rattenmodel en toont het gebruik van geïsoleerde hepatocyten voor in vitro langdurige kweek van 3D-organoïden.

Perfusie van rattenlever en isolatie van primaire hepatocyten: een oude procedure die cruciaal is voor geavanceerde 3D-organoïdencultuur

Leer hoe je primaire hepatocyten en Kupffer-cellen kweekt in een lever-op-een-chip-model voor Hepatitis B-virusinfectie. Deze methode maakt langdurige weefselkweek en farmacologisch onderzoek mogelijk.

"Lever-on-a-Chip" culturen van primaire hepatocyten en Kupffer cellen voor Hepatitis B-virusinfectie

Meer video's verkennen