Cell Cycle analyse in de C. elegans Germline met de Thymidine analoge EdU

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de celcyclus en kiemlijn stamcel populatiedynamiek in C.elegans. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het geen transgenes vereist, het is compatibel met immunofluorescente kleuring, en het kan worden gewijzigd om cellen te bestuderen onder veel verschillende omstandigheden. Ik was erg opgewonden toen ik voor het eerst zag deze methode wordt gebruikt in de Scheda lab.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in de C.elegans celcyclus, kan deze ook worden toegepast op bredere vragen over veroudering, voeding of gewijzigde genotypen. Over het algemeen labs nieuw voor deze methode kan worstelen met de eerste idiodisprepatie of C.elegans hematoxylin kleuring. Begin met het gebruik van steriele techniek om 200 microliter van 10 millimolar EdU toe te voegen in 100 milliliter M9 buffer en de juiste supplementen voor vier milliliter vers geteelde 's nachts MG 1693 E.coli cultuur.

Het maken van idiodiscious vereist een delicaat evenwicht tussen EdU en thymidine suppletie. Aangezien de hoeveelheid thymidine voldoende moet zijn om de E coli goed te laten groeien, terwijl de hoeveelheid EdU voldoende moet zijn voor het robuuste schild tegen nivellering. Na niet meer dan 24 uur bij 37 graden Celsius en 200 RPM, gebruik steriele techniek om de cultuur te splitsen tussen twee tot vier steriele 50 milliliter conische buizen voor centrifugatie.

Resuspend de pellaline vier milliliter verse M9 buffer en gebruik dezelfde pipet toe te passen ongeveer 8 druppels van EdU gelabeld E Coli MG1693 oplossing om het centrum van de individuele kamertemperatuur 60 milliliter M9 Een bewaker petrischaaltjes. Om de EdU gelabelde bacteriën aan de aaltjes te voeren, gebruikt u verse PBS om de C.Elegans van een nematode groeimedium in een buis van 1,5 milliliter te wassen en de dieren kort te laten nestelen door de zwaartekracht. Was de dieren een tot twee keer met een milliliter PBS en gebruik een glazen pasteur pipet om de aaltjes over te brengen op het centrum van de EdU gazon in een kleine druppel PBS.

Wacht een paar minuten tot de vloeistof wordt geabsorbeerd en de cultuur volgens het experimentele protocol minstens 30 minuten bij 20 graden Celsius uitbroedt. Gebruik aan het einde van de incubatie twee milliliter PBS om de wormen van de EdU-kweekplaat in een glazen ontledende schotel te spoelen. Na dissectie en fixatie van de nematode gonaden zoals eerder beschreven, spoel een kleine een milliliter borosilicaat glazen buis en een lange glazen pasteur pipet met PBS aangevuld met 0,1%tween 20 en gebruik de pipet om de vaste klieren over te brengen naar de buis in een kleine hoeveelheid PBS tween.

Verzamel de gonaden door centrifugatie en gebruik een lange, uitgesponnen glazen weide pipet om zoveel mogelijk supernatent te verwijderen zonder de gonad pellet te verstoren. Voor EdU-detectie voegt u 100 microLiters klikedu-cocktail toe aan de gaijnen en bedek de buis met laboratoriumfolie voor een incubatie van 30 tot 60 minuten bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, was de kloven een keer met 100 microLiters van reactie spoelbuffer, en vier keer met een milliliter PBS tween.

Voeg na de laatste wasbeurt 25 microLiters anti-fade montagemedium toe, aangevuld met DAPI aan het monster. Terwijl het medium zich over de klieren nestelt, plaatst u een groot 2,5%-agarosepad op een standaard glazen microscoopplaat. Maak vervolgens af met een tweede dia.

Gebruik vervolgens een lange glazen pasteur pipet en houd alle vloeistof en gonaden in de smalle punt van de pipet om monsterverlies te minimaliseren bij het overbrengen van de nagels naar het pad. Met behulp van een wimper gelijmd aan een tandenstoker, verdeel de nagels over de agarose pad en verwijder eventuele stofdeeltjes. Dan langzaam lager een rechthoekige glazen deksel slip op de nagels, het verzorgen van luchtbellen te voorkomen, en het verwijderen van overtollige oplossing met een lab weefsel.

Het tellen van cellen in drie dimensies neemt op betrouwbare wijze enige oefening in. Met behulp van Fiji's cel teller plug-in en een script zoals markeert de cellen om eventuele duplicaten te verwijderen helpt de tellingen reproduceerbaar. Nadat u de afdeksel 's nachts heeft laten bezinken, gebruiken u de plug-in van de celteller en Fiji om elke kern handmatig te tellen, waarbij elke afzonderlijke kern wordt gelabeld op basis van de aanwezigheid of afwezigheid van fosfohistone drie EdU- of pregenetorzoneceletikettering.

EdU signaal co-localiseert met DAPI signaal. In sommige kernen bedekt het EdU-signaal alle chromosomen, terwijl in andere kernen het EdU-signaal lokaliseert naar een tot twee heldere punkta, waarschijnlijk op het X-chromosoom, dat laat in de S-fase repliceert. EdU signaal van een succesvolle 30 minuten etikettering lokaliseert tot ongeveer de helft van de kernen in de pregenetor zone.

Terwijl de techniek werkt consequent in het wild type jonge volwassen dieren, een aanzienlijke fractie van de gedekte 5 dagen oude hermafrodieten niet te etiketteren in een 30 minuten EdU puls. De duur van G2 kan worden geschat door het percentage kernen in de M-fase te analyseren dat EdU-positief is over de tijdscursus, waardoor de mediaan en de maximale duur van G2 kunnen worden berekend. De duur van G2 en G1 kan worden geschat op basis van het percentage van alle pregenetor zone kernen die EdU positief zijn, waardoor de maximale duur van de gecombineerde fasen kan worden berekend. Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om dezelfde partij EdU-gerechten te gebruiken om de inter-experimentele variabiliteit te minimaliseren.

Na deze procedure kunnen andere methoden worden uitgevoerd, zoals vlekken met extra antilichamen of aanvullende vragen beantwoorden over de celcyclus, het lot van de cel of signaleringstrajecten. Vergeet niet dat het werken met nucleicide analogen en parafermeldahyde gevaarlijk kan zijn, en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van nitrol handschoenen, altijd moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.