Name: Beoordeling van cellulaire Stress en ontsteking in Discrete oxytocine-afscheidende kernen van de hersenen in de neonatale Rat vóór en na de eerste biest voeding (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-14T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Leer hoe je hersenkernen isoleert uit neonatale ratten om stresssignalering tijdens de eerste biestvoeding te bestuderen. Deze methode maakt ex-vivo analyse van weefsel mogelijk voor inzicht in hersenontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken Manon Ranger en Alexandra Schulz voor hun hulp bij de voorbereiding van dit protocol.

Deze studie werd goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik comités op Columbia University en de New York State psychiatrische Institute.
1. de weefsels voorbereiding
<ol><li>Getimede zwangere ratten bij de leverancier bestellen.</li>
	<li>Volg getimede zwangere ratten door het observeren van hun groeiende buikjes in de weken na hun aankomst en vervolgens op zoek naar pups op de verwachte leverdatum door de inspectie van de kooi elke 2 h tot levering begint.</li>
	<li>Pups met een gehandschoende hand verwijderen door hun staart vóór hun eerste Voer voor unprimed pups (geen witte melk buik is herkenbaar bij het bekijken van de buik) of na de eerste feed voor primer pups (op dat moment een witte buik zal zichtbaar zijn op hun buik) zoals beschreven in de timeli ne (Figuur S1). Opmerking: De eerste biest-feed wordt genoemd als priming de pup; Er is dus een pup unprimed tot de eerste feed, waarna ze biest-primer zijn.</li>
	<li>Decapitate snel de unanesthetized pup met behulp van scherpe, schone chirurgische scharen.</li>
	<li>Verwijder de hersenen door het snijden van de huid de middellijn en de bovenkant van de schedel naar de neus. Vervolgens, gebruik pincet, zachtjes loerder weg het bot voor het blootstellen van de hersenen (figuur 1A) en lokaliseren van de bregma, te markeren met een pen als de bot-platen worden verwijderd (figuur 1B).</li>
	<li>Plaats snel de hele hersenen in een polymethylmethacrylaat methacrylaat hersenen schimmel bij kamertemperatuur voor coronale snijden bij kamertemperatuur (Figuur 1 c).</li>
	<li>Maakt onverwijld, 500 mm dik segmenten met behulp van een verse scheermesje. Leg de plakjes rostraal van caudal in een petrischaal te handhaven oriëntatie van secties (Figuur 2).</li>
	<li>Snel toevoegen van kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF; 1,0 mM KH2PO4, 26 mM NaHCO3, 118.6 mM NaCl, 3.0 mM KCl, 203.3 mM MgCl2-6 H2O) zonder glucose en Incubeer de segmenten voor 60 min bij 28-30 ° C, voortdurend roeren op een rondschudapparaat metabolisch en differentieel uitdaging de unprimed versus biest-primer weefsels.</li>
	<li>De kernen van de hersenen die nodig zijn om de punch met behulp van een atlas hersenen33 en anatomische bezienswaardigheden op de weefselsectie te identificeren. Plaats dit segment met de kernen van belang in een petrischaal en verplaats het naar de ontleden Microscoop.</li>
	<li>Zodra gevisualiseerd, punch snel uit 4 van 6 verschillende kernen met een grondonderzoek, selecteren de grootte om beste punch de kern betrokken programma en consequent tussen monsters (Figuur 2). Opmerking: Het overige segment van de hersenen krijgen nu een gat waar hersenweefsel werd verwijderd. In deze studie, weggesneden we de volgende kernen met behulp van de onderstaande coördinaten. Alle anterior/posterior (A / P) coördinaten zijn van Bregma (met uitzondering van de NTS, die met betrekking tot de Calamus Scriptorius is). Alle dorsale/ventrale (D/V) coördinaten zijn van het oppervlak van de cortex (behalve NTS, die uit het oppervlak van de medulla is). Met de volgende coördinaten bevatten A / P, mediale/laterale (M/L) en D/V in mm: 1) eenzame tract nucleus (NTS, A / P, 0,4 tot 0,8; L, ± 0,2; D/V, 0,3 (van het oppervlak van de medulla), 2) paraventricular nucleus (PVN, -0,8; ± 0,2; 0), 3) supra-optische kern (zoon,-1.1, ± 1.4; 4.3), 4) cortex (CX, gedeeltelijke cortex gebied 1, -2,8; ± 1,5; 0,6), 5) striatum kernen (STR,-0.0, ± 1.6; 1.8), en 6) mediale preoptic Nucleus (MPO, -0,6; ± 0,2; 4.2).</li>
	<li>Snel onderdompelen de geponste kernen in 0.06 mL ijskoud, eiwit extractie buffer met proteaseinhibitors en phosphatase inhibitors gedurende 60 minuten (zie stap 2.3).</li>
</ol>2. eiwit extractie
<ol><li>Bereid de eiwit extractie-oplossing met behulp van het eiwit lysis kit (Tabel of Materials) op de dag vóór de levering van de verwachte pup.</li>
	<li>Ontdooien (op ijs) de waterige oplossing van de bevroren (-20 ° C) van het protease en phosphatase inhibitors van de lysis buffer kit en plaats de lysis-buffermengsel en DMSO oplossing van de proteasen/phosphatases remmers op ijs.</li>
	<li>Voeg 1.85 mL lysis-buffermengsel in een schone, ijskoude 15 mL-buis. Dan, Voeg 0,1 mL van een waterige oplossing van remmers en 0,05 mL van DMSO-opgelost-remmers. Ten slotte, GLB en kort vortex de buis en houd het bij-20 ° C tot gebruik.</li>
	<li>Label 24 schone microcentrifuge buizen (0,5 mL elk) voor de lysis van de procedure. Voorgedragen 12 buizen per hersenen voor de biest-unprimed fractie (U) [6 links (L) en 6 juiste kernen van de hersenen van het (R)], en het etiket wordt gegeven overeenkomstig de kernen acroniem, kant, en voorwaarde (bv., NTS-L-U, NTS-R-U, enz.). Label de tweede groep van 12 buizen voor de monsters biest-primer.</li>
	<li>Label twee extra sets van buizen zoals gedaan in stap 2.4 voor de voorraad eiwitten extracten (met behulp van 1,5 mL Eppendorf-stijl buizen) en voor de eerste reeks van de bereiding van de monsters (met behulp van 0,5 mL buizen). Houd deze buizen in twee afzonderlijke, gelabelde bevriezing vakken (elk ontworpen voor 100 buizen). Een doos zal worden gebruikt voor de unprimed monsters en de andere voor de voorbehandelde monsters.</li>
	<li>Ontdooien van de lysis van de oplossing op het ijs op de dag dat de pups worden geleverd, en terwijl het broeden van hersenen segmenten in ACSF, aliquoot 0.06 mL lysis van de oplossing in de buizen van lysis van de procedure (uit stap 2.4) en voeg kernen stoten en incubeer in ijs voor 60 min.</li>
	<li>Centrifugeer de bebroede lysed kernen gedurende 30 min. in een gekoelde mini centrifuge op 14000 rpm (10.000 x g) en zorgvuldig gecombineerd 0.055 mL van het supernatans dat met een goed ingestelde pipet. Breng het supernatant in de vooraf gekoelde 1,5 mL voorraad buizen (uit stap 2.5) en leg ze op het ijs. Voordat de bevriezing (bij-20 ° C) de eiwit voorraad buizen, Pipetteer 0.012 mL van het supernatans dat in de 0,5 mL pre gekoelde buizen voor de eerste monsterverwerking (uit stap 2.5) en laat ze op het ijs.</li>
</ol>3. monstervoorbereiding voor In-capillair eiwit meting
<ol><li>Gebruik een kit en voorbereiden van de reagentia op scheiding volgens de aanwijzingen van de fabrikant. 0.003 milliliters reagens van de meester-mix toevoegen aan elk van de 12 monsters in de 0,5 mL label buizen (uit stap 2.5) op ijs waarin 0.012 mL van de eiwit-extracten.</li>
	<li>Zet de verwarming blok tot 95 ° C en Voeg 0,004 mL van het reagens bereid in stap 3.1 naar een ladder biotinyleerd moleculair-gewicht (MW) in een buis met 0,016 mL gedeïoniseerd water. Te denatureren van de ladder en monsters, plaats de buis van de ladder en de 12 monsters van extracten van de unprimed eiwitten in de warmte blok bij 95 ° C gedurende 5 min en hen bewaren bij 4 ° C tot gebruik.</li>
	<li>Herhaal stap 2.0 te 3.2, van eiwit extractie naar de bereiding van de monsters, voor de kernen sloeg uit biest-primer ratten.</li>
</ol>4. elektroforese voorbereiding
<ol><li>Ontdooi de Biotine labeling reagens (opgeslagen in de diepvries bij-80 oC) op de Bank en bereiden het eiwit detectie kit op ijs bij 4 ° C na aanwijzingen van de fabrikant.</li>
	<li>Meng 0,15 mL luminol met 0,15 mL peroxide en laadt 0,01 mL in 25 putjes (rij E, putten 1-25) van de plaat voor de geautomatiseerde westerse machine. Laden 0.008 milliliters daar-HRP van de kit in putten D1 naar D25</li>
	<li>Laad 0,01 mL verdunningsmiddel antilichaam-oplossing in putten C1 C25 en B1.</li>
	<li>Draai de 24 EiwitSteekproeven en ladder buizen kort (2-3 seconden) in een minicentrifuge naar zwembad beneden verdampt water uit de tube caps.</li>
	<li>Laad 0.003 mL 12 unprimed monsters in putten A2 A13, 12 biest-primer monsters in putten A14 naar A25 0.003 mL en 0,005 mL van de ladder van de biotinyleerd in goed A1.</li>
	<li>Rij F leeg en laadt 0,45 mL was buffer in elk van de 5 compartimenten in elk van de 3 rijen onder rij F. Cover de plaat met de plastic deksel te vermijden van verdamping tijdens de overige procedures.</li>
	<li>Kort de ontdooide Biotine vortex labeling reagens en 0,15 mL van het reagens toe te voegen aan haar aangewezen buis; dan Voeg aan het 0,15 mL van de totale proteïne reconstitutie agent en meng ze aan homogeniteit.</li>
	<li>Verwijder de kap van de plaat en laadt 0,01 mL van agenten 1 en 2 in putten B2 naar B25. De afdekplaat en Centrifugeer het gedurende 10 minuten op 1000 x g luchtbellen verwijderen uit de verschillende oplossingen. Gebruik een lege plaat in de centrifuge voor evenwicht.</li>
</ol>5. elektroforese
<ol><li>Terwijl de plaat draait, een run bestand opent in de geautomatiseerde westerse machine-verbonden computer die aangeeft in de dropdown-pagina uit "bestand" om uit te voeren van een bepaling van de totale proteïne en te klikken op de respectieve plek.</li>
	<li>Aantekeningen van de monsters door goed in de computer. Verwijder vervolgens de plaat van de centrifuge verwijderen de cover en zorgvuldig afschilferen van de aluminium cover van de scheiding oplossing compartimenten.</li>
	<li>Plaats de plaat in het geautomatiseerde westerse instrument, afschilferen van de cover van het vak capillaire cartridge, plaats de cartridge in de aangewezen plaats en sluit de deur.</li>
	<li>Klik op de "Uitvoeren" knop, en wanneer souffleur van het type van de test ("total protein"), typ de naam van de monsters (bijvoorbeeld, "unprimed 2-13 en biest-primer 14-25"). Klik op "OK", en wanneer gevraagd door de geactiveerde looppasdatum en id-nummer van het beheerde bestand, maak een notitie van de tijd wanneer de termijn eindigt.</li>
	<li>Aan het eind van de run (170 min na het begin), open de deur van het instrument, verwijder de capillaire cassette en gooi het in de sharps verwijdering. Gooi de plaat in de verwijdering van biologisch materiaal.</li>
	<li>Klik op het pictogram Curven scheiding in de pagina van de analyse van het beheerde bestand en controleer of alle monsters correct hebt uitgevoerd en meerdere eiwit krommen in alle haarvaten tonen.</li>
</ol>6. analyse van signalering eiwitten
<ol><li>In een buis van gelabelde 1,5 mL, Voeg 0.003 mL konijn anti phospho-eIF2a (p-eIF2a) antilichaam en schorten in 0.3 mL (1:100 verdunning) in antilichaam verdunningsmiddel van de geschikte detectie kit. Dan houd het op ijs.</li>
	<li>Label een luminol buis en 0,15 mL luminol en 0,15 mL peroxide uit deze detectie module kit toevoegen en afzien van 0,01 mL in putten E1 naar E25 van een verse, geautomatiseerde westerse plaat.</li>
	<li>Afzien van 0,01 mL van de secundaire anti konijn antilichaam in putten D2 naar D25, en voeg daar-HRP 0,01 mL uit de kit aan goed D1.</li>
	<li>Afzien van 0,01 mL van het primaire antilichaam (uit stap 6.1) in putten C2 aan C25, en voeg toe van 0,01 mL verdunningsmiddel 2 oplossing van antilichaam aan putjes C1 en B1 naar B25.</li>
	<li>Laat de rij F putten leeg en vul 0,45 mL was buffer in de 5 compartimenten van 3 rijen onder de F-rij.</li>
	<li>Kort draaien de gekoelde monsters voor 3 s, en Voeg 0.003 mL van elk monster rij A in dezelfde volgorde als zij werden toegevoegd voor de bepaling van de totale proteïne, vanaf A2 tot A25. Voeg 0,005 mL van de biotinyleerd MW ladder goed A1 en de afdekplaat.</li>
	<li>Centrifugeer de plaat zoals gedaan in stap 4.8. Terwijl de plaat draait, een nieuwe run bestand (in de geautomatiseerde Western-geassocieerde software en computer) opent en geven in de dropdown-pagina uit "Bestand" om uit te voeren van een bepaling van moleculaire grootte door te klikken op de respectieve plek.</li>
	<li>In de test pagina, typt u de namen van het monster in elke capillair, dan typt u de naam van het primaire antilichaam in de toegewezen plek en het secundaire antilichaam anti-konijn eronder.</li>
	<li>Aan het einde van centrifugeren, herhaal stappen 5.3-5.5, behalve de naam gegeven aan het beheerde bestand ditmaal moet "p-eIF2a op unprimed 2 – 13 en 14-25 biest-primer".</li>
	<li>Na de scheiding van de elektroforese, Controleer het lopen bestand voor immuun-reactiviteit pieken van antigenen op grootte van 40-43 kDa. Indien MW van pieken deze grootte ontbreken, klik met de rechtermuisknop onder de curve en aangeven binnen de dropdown-lijst toe te voegen MW aan de piek, die ervoor zorgt dat de grootte en willekeurige hoeveelheid onder de curve worden vastgelegd.</li>
</ol>7. verwerking van de resultaten
<ol><li>Open een spreadsheet-bestand voor totale proteïne uitvoeren in de geautomatiseerde westelijke bestand uitvoeren en voorzien van een id-nummer.</li>
	<li>Open het run bestand van de bepaling van de totale eiwitten op de pagina van de analyse op de curve modus en Markeer alle de pieken in individuele haarvaten. Kopieer en plak ze in het werkblad en som van de gebieden die onder de curve van alle pieken in het gehele capillair opgenomen.</li>
	<li>Regelen in een aparte kolom, de totale hoeveelheid eiwit voor elke kolom met capillaire nummers, namen van de respectieve hersenen kernen, en de id-nummers van de beheerde bestanden.</li>
	<li>Open een werkblad voor de p-eIF2a-antigeen, en in één kolom, het oppervlak onder de kromme van elk capillaire side-by-side met haar respectieve capillaire nummer, de naam van de kern van de hersenen, en id-nummer van het beheerde bestand opnemen.</li>
	<li>De totale proteïne kolom (parallel aan de aantallen van de kromme p-eIF2a) te kopiëren naar een derde spreadsheet en berekenen van p-eIF2a:total eiwit verhoudingen in een derde kolom.</li>
	<li>Resultaten van de stappen 4 tot en met 6 voor elke kern hersenen verzamelen, schik ze in groepen van kernen en genereren een staafdiagram.</li>
</ol>

<ol><li>Hietaniemi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiles+in+fetal+and+neonatal+rat+offspring+of+energy-restricted+dams%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nutrigenetics+and+Nutrigenomics%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiles in fetal and neonatal rat offspring of energy-restricted dams.</a> Journal of Nutrigenetics and Nutrigenomics. 2 (4-5), 173-183 (2009).</li>
<li>Okabe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogenous+glycine+receptor+expression+in+cortical+plate+neurons+and+Cajal-Retzius+cells+of+neonatal+rat+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Homogenous glycine receptor expression in cortical plate neurons and Cajal-Retzius cells of neonatal rat cerebral cortex.</a> Neuroscience. 123 (3), 715-724 (2004).</li>
<li>Mailleux, P., Takazawa, K., Erneux, C., Vanderhaeghen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+the+neurons+containing+inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate+3-kinase+and+its+messenger+RNA+in+the+developing+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Distribution of the neurons containing inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase and its messenger RNA in the developing rat brain.</a> Journal of Comparative Neurology. 327 (4), 618-629 (1993).</li>
<li>Carter, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxytocin+and+Human+Evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Oxytocin and Human Evolution.</a> Current Topics in Behavioral Neuroscience. , (2017).</li>
<li>Sippel, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxytocin+and+Stress-related+Disorders%3A+Neurobiological+Mechanisms+and+Treatment+Opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Chronic+Stress+%28Thousand+Oaks%29%22%5BJournal%5D)">Oxytocin and Stress-related Disorders: Neurobiological Mechanisms and Treatment Opportunities.</a> Chronic Stress (Thousand Oaks). 1, (2017).</li>
<li>Agnati, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspects+on+the+integrative+actions+of+the+brain+from+neural+networks+to+%22brain-body+medicine%22%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Receptors+and+Signal+Transduction+Research%22%5BJournal%5D)">Aspects on the integrative actions of the brain from neural networks to "brain-body medicine".</a> Journal of Receptors and Signal Transduction Research. 32 (4), 163-180 (2012).</li>
<li>Welch, M. G., Margolis, K. G., Li, Z., Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxytocin+regulates+gastrointestinal+motility%2C+inflammation%2C+macromolecular+permeability%2C+and+mucosal+maintenance+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+Physiology%3A+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Oxytocin regulates gastrointestinal motility, inflammation, macromolecular permeability, and mucosal maintenance in mice.</a> American Journal Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 307 (8), G848-G862 (2014).</li>
<li>Welch, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+developmental+regulation+of+oxytocin+%28OT%29+and+oxytocin+receptors+%28OTR%29+in+the+enteric+nervous+system+%28ENS%29+and+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Expression and developmental regulation of oxytocin (OT) and oxytocin receptors (OTR) in the enteric nervous system (ENS) and intestinal epithelium.</a> Journal of Comparative Neurology. 512 (2), 256-270 (2009).</li>
<li>Prakash, B. S., Paul, V., Kliem, H., Kulozik, U., Meyer, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+oxytocin+in+milk+of+cows+administered+oxytocin%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Determination of oxytocin in milk of cows administered oxytocin.</a> Analytica Chimica Acta. 636 (1), 111-115 (2009).</li>
<li>Solangi, A. R., Memon, S. Q., Mallah, A., Khuhawar, M. Y., Bhanger, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+separation+of+oxytocin%2C+norfloxacin+and+diclofenac+sodium+in+milk+samples+using+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Chromatography%22%5BJournal%5D)">Quantitative separation of oxytocin, norfloxacin and diclofenac sodium in milk samples using capillary electrophoresis.</a> Biomedical Chromatography. 23 (9), 1007-1013 (2009).</li>
<li>Klein, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxytocin+modulates+markers+of+the+unfolded+protein+response+in+Caco2BB+gut+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+and+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Oxytocin modulates markers of the unfolded protein response in Caco2BB gut cells.</a> Cell Stress and Chaperones. 19 (4), 465-477 (2014).</li>
<li>Klein, B. Y., Tamir, H., Hirschberg, D. L., Glickstein, S. B., Welch, M. G. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X13002398">Oxytocin modulates mTORC1 pathway in the gut.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 432 (3), 466-471 (2013).</li>
<li>Klein, B. Y., Tamir, H., Ludwig, R. J., Glickstein, S. B., Welch, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colostrum+oxytocin+modulates+cellular+stress+response%2C+inflammation%2C+and+autophagy+markers+in+newborn+rat+gut+villi%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+an+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Colostrum oxytocin modulates cellular stress response, inflammation, and autophagy markers in newborn rat gut villi.</a> Biochemical an Biophysical Research Communications. 487 (1), 47-53 (2017).</li>
<li>Donnet-Hughes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+role+of+the+intestinal+microbiota+of+the+mother+in+neonatal+immune+education%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Nutritional+Society%22%5BJournal%5D)">Potential role of the intestinal microbiota of the mother in neonatal immune education.</a> Proceedings of the Nutritional Society. 69 (3), 407-415 (2010).</li>
<li>Perez, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+imprinting+of+the+neonatal+immune+system%3A+lessons+from+maternal+cells%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Bacterial imprinting of the neonatal immune system: lessons from maternal cells?</a> Pediatrics. 119 (3), e724-e732 (2007).</li>
<li>Takeda, S., Kuwabara, Y., Mizuno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentrations+and+origin+of+oxytocin+in+breast+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinolcia+Japonica%22%5BJournal%5D)">Concentrations and origin of oxytocin in breast milk.</a> Endocrinolcia Japonica. 33 (6), 821-826 (1986).</li>
<li>Quintana, D. S., Outhred, T., Westlye, L. T., Malhi, G. S., Andreassen, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+oxytocin+administration+on+brain+activity%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Systematic+Reviews%22%5BJournal%5D)">The impact of oxytocin administration on brain activity: a systematic review and meta-analysis protocol.</a> Systematic Reviews. 5 (1), 205(2016).</li>
<li>Dobbing, J., Sands, J. <a target="_blank" href="http://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/download?doi=10.1.1.463.8516&rep=rep1&type=pdf">Comparative aspects of the brain growth spurt.</a> Early Human Development. 3 (1), 79-83 (1979).</li>
<li>Orr, M. E., Garbarino, V. R., Salinas, A., Buffenstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+Postnatal+Brain+Development+in+the+Longest-Lived+Rodent%3A+Prolonged+Maintenance+of+Neotenous+Traits+in+the+Naked+Mole-Rat+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Extended Postnatal Brain Development in the Longest-Lived Rodent: Prolonged Maintenance of Neotenous Traits in the Naked Mole-Rat Brain.</a> Frontiers in Neuroscience. 10, 504(2016).</li>
<li>Hansson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+quantitative+proteome+analysis+of+in+vivo+intestinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Time-resolved quantitative proteome analysis of in vivo intestinal development.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 10 (3), (2011).</li>
<li>Mochizuki, K., Yorita, S., Goda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+changes+in+the+jejunum+of+rats+during+the+transient+suckling-weaning+period%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nutritional+Science+and+Vitaminology+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Gene expression changes in the jejunum of rats during the transient suckling-weaning period.</a> Journal of Nutritional Science and Vitaminology (Tokyo). 55 (2), 139-148 (2009).</li>
<li>Rinaman, L., Banihashemi, L., Koehnle, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+life+experience+shapes+the+functional+organization+of+stress-responsive+visceral+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Early life experience shapes the functional organization of stress-responsive visceral circuits.</a> Physiology and Behavior. 104 (4), 632-640 (2011).</li>
<li>Johannes, G., Sarnow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap-independent+polysomal+association+of+natural+mRNAs+encoding+c-myc%2C+BiP%2C+and+eIF4G+conferred+by+internal+ribosome+entry+sites%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Cap-independent polysomal association of natural mRNAs encoding c-myc, BiP, and eIF4G conferred by internal ribosome entry sites.</a> RNA. 4 (12), 1500-1513 (1998).</li>
<li>Rinaman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hindbrain+noradrenergic+A2+neurons%3A+diverse+roles+in+autonomic%2C+endocrine%2C+cognitive%2C+and+behavioral+functions%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Regulatory%2C+Integrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hindbrain noradrenergic A2 neurons: diverse roles in autonomic, endocrine, cognitive, and behavioral functions.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (2), R222-R235 (2011).</li>
<li>Walker, C. D., Toufexis, D. J., Burlet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothalamic+and+limbic+expression+of+CRF+and+vasopressin+during+lactation%3A+implications+for+the+control+of+ACTH+secretion+and+stress+hyporesponsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Hypothalamic and limbic expression of CRF and vasopressin during lactation: implications for the control of ACTH secretion and stress hyporesponsiveness.</a> Progress in Brain Research. 133, 99-110 (2001).</li>
<li>Montiel-Castro, A. J., Gonzalez-Cervantes, R. M., Bravo-Ruiseco, G., Pacheco-Lopez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbiota-gut-brain+axis%3A+neurobehavioral+correlates%2C+health+and+sociality%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Integrative+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The microbiota-gut-brain axis: neurobehavioral correlates, health and sociality.</a> Frontiers in Integrative Neuroscience. 7, 70(2013).</li>
<li>Blevins, J. E., Ho, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+oxytocin+signaling+in+the+regulation+of+body+weight%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Endocrine+and+Metabolic+Disorders%22%5BJournal%5D)">Role of oxytocin signaling in the regulation of body weight.</a> Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders. 14 (4), 311-329 (2013).</li>
<li>Welch, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+administration+of+secretin+and+oxytocin+inhibits+chronic+colitis+and+associated+activation+of+forebrain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterology+Motility%22%5BJournal%5D)">Combined administration of secretin and oxytocin inhibits chronic colitis and associated activation of forebrain neurons.</a> Neurogastroenterology Motility. 22 (6), 654(2010).</li>
<li>Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+chemical+anatomy+of+the+afferent+vagal+system%5BTitle%5D)+AND+%22Autonomic+Neuroscience%3A+Basic+and+Clinical%22%5BJournal%5D)">Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system.</a> Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 85 (1-3), 1-17 (2000).</li>
<li>Taniuchi, S., Miyake, M., Tsugawa, K., Oyadomari, M., Oyadomari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+stress+response+of+vertebrates+is+regulated+by+four+eIF2alpha+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Integrated stress response of vertebrates is regulated by four eIF2alpha kinases.</a> Scientific Reports. 6, 32886(2016).</li>
<li>Altschuler, S. M., Bao, X. M., Bieger, D., Hopkins, D. A., Miselis, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscerotopic+representation+of+the+upper+alimentary+tract+in+the+rat%3A+sensory+ganglia+and+nuclei+of+the+solitary+and+spinal+trigeminal+tracts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Viscerotopic representation of the upper alimentary tract in the rat: sensory ganglia and nuclei of the solitary and spinal trigeminal tracts.</a> Journal of Comparative Neurology. 283 (2), 248-268 (1989).</li>
<li>Shapiro, R. E., Miselis, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+central+neural+connections+of+the+area+postrema+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">The central neural connections of the area postrema of the rat.</a> Journal of Comparative Neurology. 234 (3), 344-364 (1985).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. (1997).</li>
<li>Nayak, R., Pintel, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+viruses+can+induce+phosphorylation+of+eIF2alpha+via+PKR+activation%2C+which+can+be+overcome+by+helper+adenovirus+type+5+virus-associated+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated viruses can induce phosphorylation of eIF2alpha via PKR activation, which can be overcome by helper adenovirus type 5 virus-associated RNA.</a> Journal of Virology. 81 (21), 11908-11916 (2007).</li>
<li>Zaborske, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+tRNA+charging+and+activation+of+the+eIF2+kinase+Gcn2p%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (37), 25254-25267 (2009).</li>
<li>Hollis, J. H., Lightman, S. L., Lowry, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+systemic+and+visceral+sensory+information+by+medullary+catecholaminergic+systems+during+peripheral+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Integration of systemic and visceral sensory information by medullary catecholaminergic systems during peripheral inflammation.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1018, 71-75 (2004).</li>
<li>Klein, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxytocin+opposes+effects+of+bacterial+endotoxin+on+ER-stress+signaling+in+Caco2BB+gut+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Oxytocin opposes effects of bacterial endotoxin on ER-stress signaling in Caco2BB gut cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (2), 402-411 (2016).</li>
<li>Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB in the nervous system.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (3), a001271(2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een techniek voor microdissection van discrete, OTR-rijke kernen van de hersenen in de neonatale rat hersenen wordt gepresenteerd in deze white paper. Het is goed herkend dat neuronen zijn zeer gespecialiseerd, zelfs binnen goed gekarakteriseerd kernen in de hersenen. Deze zeer reproduceerbaar aanpak te isoleren van de specifieke OTR-rijke kernen stelt gebruikers robuuste hypothese te testen. Met behulp van geautomatiseerde westelijke bevlekken, werden de samenhang en de reproduceerbaarheid van de resultaten verder verbe...

In tegenstelling tot ons begrip van de vroege ontwikkeling van de hersenen die zich voordoen in de loop van dagen-naar-weken postpartum, is relatief weinig bekend over de talloze dynamische veranderingen die zich voordoen in de eerste uren van het leven bij ratten. Een belangrijke uitdaging is het kleine formaat van de neonatale rat hersenen en een eis van high-tech hulpmiddelen te isoleren van de afzonderlijke hersengebieden of afzonderlijke cellen. Studies schatten vaak gene transcriptie en niet vertaling1,2, dat een stevige begrip van functionaliteitsniveaus van geactiveerde signalering moleculen niet geeft. Anderen bekijken expressie met behulp van immunohistochemistry aan referentie hersengebieden, wie niet voor de kwantificering van expressie niveau3 verstrekken doet. Geen studie tot op heden heeft de activering van de trajecten die zijn gekoppeld aan de eerste biest ratten feed in discrete hersengebieden, waarvoor snelle isolatie en offer en meting van eiwit expressie en proteïne fosforylatie met behulp van Western signalering bevlekken. Terwijl op oudere en grotere hersenen hersenen microdissection wordt uitgevoerd, hebben we een verwijzing uitvoeren van een niet-eencellige hersenen punch in de hersenen van een P0 niet geïdentificeerd. Dit document stelt een protocol voor het isoleren van beperkte regio's van de neonatale hersenen met behulp van een relatief low-tech punch techniek en een Western-blottingtechniek voor het meten van de eiwituitdrukking in relatief kleine steekproeven. Dit protocol kan worden geschikt voor onderzoeksvragen die de beoordeling van eiwit expressie en posttranslationele modificaties vereisen (bv., fosforylatie) in relatief beperkte regio's van de kleine hersenen van alle soorten, op voorwaarde dat de gebruiker kan visueel inleven in de regio van de hersenen van belang een atlas en herkenbare monumenten.
Deze techniek werd ontwikkeld om te begrijpen van de veranderingen in de hersenen als gevolg van de neonatale ratten eerste biest feed, die is rijk aan oxytocine (OT). OT is lang gekend voor haar vermogen te stimuleren van melk laat-down en uteriene contractie. Echter, OT is nu bekend dat een brede waaier van rollen te spelen bij de regulering van vele lichaamsfuncties en gedrag4. Bijvoorbeeld, OT verzet zich tegen stress en ontsteking in combinatie met adaptieve affiliërend gedrag5, vertraagt het leegmaken van de maag en intestinale transit vertraagt. OT receptoren (OTR) geconstateerd in de darmen neuronen en intestinale epitheel6,7,8. De gastro-intestinale effecten van OT zijn vooral belangrijk voor de baby tijdens de vroege postnatale periode. Bijvoorbeeld, borstvoeding wordt geassocieerd met de levering van aanzienlijke hoeveelheden OT aan de neonatale gut9,10, en uit de gegevens blijkt dat de OTR is zwaar overexpressie in duodenale villi tijdens de melk periode8zuigen.
In vitro experimenten met behulp van een gut cellijn hebben aangetoond op cellulair niveau dat oxytocine moduleert belangrijke moleculen in de stress signalering traject11,12 en een regulerende rol speelt in de vertaling van eiwitten 12. deze studies suggereren dat onderdelen van melk, met inbegrip van exogene oxytocine van de moeder, belangrijk in de reactie van de ongevouwen eiwitten bij pasgeborenen zijn te verminderen van cellulaire spanning13.
In vivo en ex vivo studies hebben aangetoond dat biest OT de cellulaire stress respons, ontsteking, en autophagy markers in pasgeboren rat gut villi moduleert. Pasgeboren enterocyten lijden aanzienlijke cellulaire stress aan hun luminal kant wanneer de darm wordt gelijktijdig blootgesteld aan microbiota van de moeder in biest14,,15 en talrijke proteïnen, met inbegrip van hormonen zoals OT9 , 10 , 16.
De effecten van OT op de hersenen geweest bestudeerde17. De OT signalering mechanismen aangetoond in de darm tijdens de vroege postnatale periode zijn echter niet in de hersenen bestudeerd. In dit document wordt een methode voor het isoleren van discrete hersenen kernen in de hersenstam neonatale rat en hypothalamus met behulp van elektroforese gebruikt profileren geïsoleerde hersengebieden. Het algemene doel van deze methode is om vast te leggen van de staat van cel signalering in hersengebieden zo dicht mogelijk bij de geboorte, vóór en na de eerste melk zuigen, in hersenweefsel met de laagste gliale/neuronale index. De reden voor de ontwikkeling van deze techniek is dat het mogelijk maakt voor de snelle isolatie van beperkte, microscopische hersengebieden in neonatale pups met een meer homogene verzameling van neuronen voor ex vivo studies met behulp van een geautomatiseerde westelijke bevlekken methodologie, aanbieden zeer consistente resultaten op relatief kleine ontleed monsters. Een tekortkoming van voorafgaande werk omvat meer bruto dissectie (hersenen segmenten of hele hersenen) en oudere dieren18,19. De hersenen van jonge pups zijn ongelooflijk dynamisch, met golven van gliale differentiatie na de geboorte. Om te kunnen studeren hersenen wijzigingen beïnvloed door de pups eerste voeding, is studeren beperkt neuronale kernen met reproduceerbare dissectie noodzakelijk.
Melk feed is meestal geanalyseerd voor de immunologische en nutritionele gevolgen daarvan voor de gezondheid of gen expressie (bijvoorbeeld in de enterocyten20,21) Overwegende dat het effect daarvan op hersengebieden tijdens de ontwikkeling van de hersenen zelden wordt bestudeerd. Het effect van melk doorvoer in de darm op hersenfunctie werd geanalyseerd met betrekking tot de darm Cholecystokinine receptoren vagale estafette aan kernen van de hersenstam, maar niet aan intracellulaire signalering trajecten22. Er is een enorme literatuur op de kwetsbaarheid van de ontwikkelende hersenen van de pasgeborene voor ondervoeding van moeders tijdens zwangerschap23, maar ook de stress en ontsteking signalen niet worden behandeld. Nog belangrijker is, is de huidige methode maakt gebruik van een fenomeen in de dag-nul rat pasgeborenen waarmee de bloed-geboren biest prikkels van vagale relay van viscerale stimuli worden geïsoleerd. Dit is de zogenaamde stress hypo-reactievermogen periode gekenmerkt door onrijpe nucleus tractus solitarius (NTS)-hypothalame circuit onmiddellijk na de geboorte24,25 , die beperkt NTS, paraventricular nucleus (PVN), en supraoptic nucleus (zoon) signalen op stimuli bloed komaf.
Deze methode is nuttig voor analyse van meerdere signaalroutes en relatief beperkt tot neuronale cellen, mits hersenweefsel wordt geoogst op postnatale dag-0 bij ratten, naast of moeders zijn aangevochten of niet door enige vorm van behandeling tijdens de zwangerschap. Nesten kunnen worden geanalyseerd voor de effecten van colostrum feed versus pre voederen signalering. Bij het vergelijken van signalen tussen hersengebieden met armen versus rijke eiwit opbrengst, kan deze methode in-capillair bepaling van totaal eiwit van de polypeptide bands in haarvaten lopen parallel aan de immuun-kwantificatie van eiwit antigenen. Deze methode kan de kwantitatieve vergelijking, met behulp van willekeurige eenheden, van de resultaten verkregen door het dezelfde antilichaam zonder standaard kwantitatieve curven en verwijzing naar totaal eiwit per capillair. Het vergelijken van resultaten die zijn verkregen door verschillende antilichamen is mogelijk alleen met behulp van kwantitatieve standaard curven.
Deze methode voor de beoordeling van bidirectionele signalering die zich voordoen tussen de darm en de hersenen en dat kan van invloed zijn functie in beide organen26toegestaan. De associatie tussen oxytocine en voedsel inname, die is uitgebreid bestudeerd in de afgelopen jaren27, ondersteunt een verband tussen verhoogde oxytocine signalering en de beschikbaarheid van nutriënten. Deze studies ondersteunen ook het omgekeerde concept die energie die tekorten zijn in combinatie met reducties in de hypothalamische oxytocine signalering.
Eerdere studies van het effect van OT op hersenactiviteit aangetoond dat ontsteking van de darm van de geïnduceerde ontlokte CFO's transcriptie in hypothalame PVN, amygdala en piriform cortex, die vuurvaste vagotomy28 was. Systemische infusie van OT met secretine daalde echter de hersenen CFO's reactie op de uitgelokt ontstekingsreactie in de darm28. Dit stelde dat het effect van exogene OT werd uitgevoerd door routes dan vagale Relais, eventueel via bloed overgedragen signalering moleculen doorgevoerd op het gebied postrema6,29.
In deze studie, werden de cellulaire stress signaalroutes die eerder in de darm hebben waargenomen beoordeeld in de hersenen. De hypothese was dat melkbestanddelen kunnen beschermen of uitstellen van het effect van ontsteking op de doorlaatbaarheid van de darm aan microbiële en andere metabolieten, en op zijn beurt, de gevolgen voor de hersenfunctie. De duidelijke antagonistische verschillen in IkB versus BiP signalering gevonden in villi, vóór en na de priming biest13, stelde dat de hersenen van pasgeborenen, nog steeds bezig, deze darm biest-geïnduceerde signalen kunnen voelen.
Signalering eiwitten markeringen gebruikt in vorige gut experimenten die gekoppeld aan het endoplasmatisch reticulum-stress zijn werden gemeten. Zij omvatten de ER chaperon BiP, vertaling initiatie factor eIF2a (die dient als een stress reactie integrator30), eIF2a kinase p-PKR, en twee ontsteking-signalering eiwitten (NF-kB en de Inhibitor van de omwenteling, IkB).
Zes hersengebieden op basis van hun vermogen in volwassenen afscheiden of reageren op OT werden gekozen. De NTS, gelegen op de bovenste medulla, is de eerste slag van de viscerale input en ontvangt directe signalering van vagale sensorische neuronen in de darm31 en eventueel bloed-geboren cytokines, toxines en hormonen via het aangrenzende gebied-postrema-32. De PVN, supraoptic nucleus (zoon), striatum kernen (STR), hersenschors (CX) en mediale preoptic nucleus (MPO) ontvangen signalering uit de darm via de NTS.
Resultaten toonden aan dat de cellulaire stressrespons gedurende de onmiddellijke postnatale periode vóór biest priming en onmiddellijk na de eerste voeding verschilt in NTS in vergelijking met de PVN en zoon. Signalering in CX, STR, en MPO verschilden van die van de PVN en zoon, als goed. De afzonderlijke beschermende functies van OT om te moduleren cel stress en ontsteking in de darm zijn waarschijnlijk gevoeld door sommige gebieden van de hersenen. Collectief, blijkt uit de gegevens dat op het cellulaire niveau, tijdens de eerste uren na de geboorte, de hersenen op de metabolische stress nutriënten insufficiëntie is gekoppeld reageert. Uit de gegevens blijkt ook dat de omvang en de richting van de effecten van de feed biest regio-afhankelijk zijn, en dat in sommige regio's ze OT effecten die zijn aangetoond eerder in de darm weerspiegelen.

<table><tbody><tr><td>Bradford oplossing</td><td>Bio Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eiwit lyseerkit</td><td>Eiwit simple</td><td>CBS403</td><td>Bicine/CHAPS</td></tr><tr><td>WES kits</td><td>Eiwit simple</td><td>WES-Muis 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Konijn 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa totaal Eiwit master kit (PS-TP07)</td><td></td></tr><tr><td>anti-muis IgG HRP-conjugaat</td><td>Eiwit simple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konijn anti-fosfo-eIF2a</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>SER51, 9721</td><td></td></tr><tr><td>Muis mAb anti-PKR</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2103</td><td></td></tr><tr><td>Konijn anti-fosfo-PKR</td><td>Millipore</td><td>Thr451, 07-886</td><td></td></tr><tr><td>Konijn mAb anti-PKR</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>12297</td><td></td></tr><tr><td>Konijn mAb anti-GAPDH</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2118</td><td></td></tr><tr><td>Muis mAb anti-fosfo-IKB</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9246</td><td></td></tr><tr><td>Muis mAb anti-IKB</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4814</td><td></td></tr><tr><td>Konijn anti-BiP</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3183</td><td></td></tr><tr><td>Konijn anti GCN2</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3302</td><td></td></tr><tr><td>Konijn mAb anti-fosfo-GCN2</td><td>BIORBYT</td><td>T899</td><td></td></tr><tr><td>Zwangere Sprague-Dawley ratten</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Punch apparaat</td><td>WellTech Rapid Core of Harris Uni-Core</td><td>0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50</td><td></td></tr></tbody></table>

beoordeling van cellulaire stress en ontsteking in discrete oxytocine-afscheidende kernen van de hersenen in de neonatale rat vóór en na de eerste biest voeding

Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding

Het doel van dit protocol is te isoleren van oxytocine-receptor rijke hersenen kernen in de neonatale hersenen vóór en na de eerste biest voeding. De expressie van eiwitten bekend om te reageren op een metabole stress werd gemeten in de hersenen-kernen isolaten gebruikend het westelijke bevlekken. Dit werd gedaan om te beoordelen of metabole stress-geïnduceerde nutriënten insufficiëntie in het lichaam neuronale stress veroorzaakt. Wij hebben eerder aangetoond dat nutriënten insufficiëntie in pasgeborenen metabole stress in de darm lokt. Bovendien, biest oxytocine moduleert cellulaire stress respons, ontsteking, en autophagy markeringen in pasgeboren rat gut villi vóór en na de eerste diervoeders. Signalering eiwitten markeringen die is gekoppeld aan het endoplasmatisch reticulum-stress [ER chaperon bindend immunoglobuline-proteïne (BiP), eukaryote vertaling initiatie factor 2A (eIF2a), en eIF2a kinase proteïne kinase R (p-PKR)], evenals twee ontsteking-signalering eiwitten [nucleaire factor-recombination (NF-kB) en remmer recombination (IkB)], werden gemeten in pasgeboren hersenen kernen [kern van de eenzame tractus (NTS) paraventricular nucleus (PVN), supra-optische kern (zoon), cortex (CX), striatum kernen (STR), en mediale preoptic nucleus (MPO)] vóór de eerste feed (unprimed door biest) en na het begin van de verpleegkunde (primer door biest). Uitdrukking van BiP/GRP78 en p-eIF2a waren upregulated in unprimed en werden in primer NTS weefsel. NF-kB werd behouden (hoog) in het cytoplasma CX, STR en MPO overwegende dat NF-kB lager en ongewijzigd in NTS, PVN en zoon in beide voorwaarden was. De collectieve BiP en p-eIF2 bevindingen zijn consistent met een stress-respons. eIf2a was in de zoon, CX, STR en MPO phosphorylated door dsRNA afhankelijk kinase (p-PKR). Echter was in de NTS (en in mindere mate in de PVN), eIf2a phosphorylated door een ander kinase, algemene controle nonderepressible-2 kinase (GCN2). De stress-modulerende mechanismen eerder waargenomen in pasgeboren darm enterocyten lijken te worden weerspiegeld in bepaalde hersengebieden OTR-rijk. De NTS en de PVN kan gebruik maken van een mechanisme van de verschillende fosforylatie (onder voedingsstoffen tekort) vanuit andere gebieden en worden vuurvaste aan de gevolgen van nutriënten insufficiëntie. Collectief, suggereren deze gegevens dat hersenen reacties op nutriënten insufficiëntie stress worden gecompenseerd door signalering van enterocyten biest-primer.

De representatieve bands van immunoreactivity ten opzichte van de totale proteïne blijkt dat er hersenen kernen met zeer lage geoogste eiwit. Dit vereist het gebruik van de geautomatiseerde westelijke vlek-techniek, die zeer gevoelige in vergelijking met de canonieke westelijke vlek. Deze aanpak kan worden uitgevoerd met fortyfold minder eiwit per capillair ten opzichte van de per-baan in Western blots.
Differentiele effecten van b...

Hier presenteren we een protocol om te isoleren van de kernen van de hersenen in de neonatale rat hersenen in combinatie met het eerste biest voeden. Deze techniek maakt het mogelijk de studie van nutriënten insufficiëntie stress in de hersenen zoals gemoduleerd door enterocyte signalering.

Beoordeling van cellulaire Stress en ontsteking in Discrete oxytocine-afscheidende kernen van de hersenen in de neonatale Rat vóór en na de eerste biest voeding

The goal of this protocol is to isolate oxytocin-receptor rich brain nuclei in the neonatal brain before and after first colostrum feeding. The expression ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de postnatale ontwikkeling veld over de manier waarop melk zogen beïnvloedt stress signalering in de hersenen. Deze techniek kan worden gebruikt om specifieke hersengebieden vast te leggen tijdens de eerste natuurlijke hongerperiode en om ze te vergelijken met de respectieve gebieden kort na de eerste natuurlijke biest feed. Begrijpen hoe zogen de fysiologie van gedrag en emotie beïnvloedt, maakt het gebruik van een antagonist voor verschillende receptoren mogelijk tijdens ex-vivo hersenweefselanalyse.Om de kernen stoten te verkrijgen, verwijder de rat pups door hun staart met een gehandschoende hand. Na het oogsten van de hersenen, plaats snel het hele orgaan in een polymethyl methacrylaat hersenmal bij kamertemperatuur en onmiddellijk gebruik maken van een nieuw scheermesje om 500 micrometer dikke plakjes van het weefsel te maken. Leg de plakjes rostral te caudal in een petrischaal als ze worden verkregen om de juiste oriëntatie van de secties te behouden.Wanneer de hele hersenen is geneusd, snel toe te voegen kunstmatige cerebrale spinale vloeistof zonder glucose aan de schotel en de plakjes incuberen gedurende 60 minuten op 28 tot 30 graden Celsius met constante roeren op een orbitale shaker. Gebruik een hersenatlas en anatomische oriëntatiepunten op elk weefsel om de hersenkernen te identificeren die moeten worden geslagen en plaats de slice met de kernen van belang in een nieuwe petrischaal onder een ontledenmicroscoop. Eenmaal gevisualiseerd, gebruik maken van een coring tool om snel punch uit vier tot zes verschillende kernen en snel onder te dompelen elke geponste kern in 0,06 mL van ijskoude eiwit extractie buffer in de juiste gelabelde microcentrifuge buis met proteus remmers en fosfatase remmers voor 60 minuten.Aan het einde van de incubatie, centrifugeren de geëxtraheerde kernen in een gekoelde mini-centrifuge, en gebruik een micro-pipet om zorgvuldig over te brengen 0,055 mL supernatant uit elke buis in de juiste pre-gekoelde 1,5 mL microcentrifuge buis op ijs. Voordat de opslag van 20 graden Celsius negatief wordt opgeslagen, moet u 0,012 mL supernatant van elke eiwitvoorraadbuis in de juiste 0,5 mL voorgekoelde buis op ijs overbrengen voor het eerste monsterbereiding. Om de monsters voor te bereiden op in-capillaire eiwitmeting, voeg 0,003 mL master mix reagens van een eiwitlyse kit aan elk van de monsters in de 0,5 mL gelabelde buizen.Voeg vervolgens 0,004 mL master mix reagens toe aan een biotinylated moleculair gewichtsladderoplossing in 0,016 mL gedeïmiseerd water, en denature de ladder- en eiwitextractmonsters in een celsius warmteblok van 95 graden Celsius, waarbij alle buizen na vijf minuten op vier graden Celsius worden opgeslagen. Voeg voor signaaleiwitanalyse 0,01 mL vers bereide luminolperoxideoplossing toe aan putten E-1 tot E-25 van een nieuwe geautomatiseerde westerse plaat, 0,01 mL secundair antimuisantilichaam aan putten D-2 tot D-25 en voeg 0,01 mL streptavidin mierikswortel peroxidase toe aan de kit tot en met D-1. Voeg 0,01 mL vers bereid primair antilichaam toe aan putten C-2 tot C-25 en 0,01 mL antilichaamverwijdingsmiddel twee oplossing voor putten C-1 en B-1 tot B-25.Laat de rij F putten leeg en vul de vijf compartimenten van de drie rijen onder de F-rij met 0,45 mL wasbuffer. Draai vervolgens kort de gekoelde monsters gedurende 30 seconden en voeg 0,03 mL van elk monster toe aan elke put van rij A, te beginnen met A-2. Voeg vervolgens 0,005 mL van de biotinylated moleculair gewichtsladder toe aan goed A-1 en bedek de plaat voor centrifugatie.Terwijl de plaat is centrifuged, open een nieuwe run bestand in de geautomatiseerde westerse geassocieerde software en initiëren van een moleculaire grootte test. Voer op de testpagina de monsternamen in elke capillaire en de namen van de primaire en secundaire antilichamen in. Plaats de plaat aan het einde van de centrifugatie in het geautomatiseerde westerse instrument en pel de hoes uit de capillaire cartridgebox.Na centrifugatie, vergeet niet te inspecteren op luchtbellen, omdat luchtbellen in de capillaire kan de elektroforetische stroom te blokkeren en niet de hele ronde. Plaats de cartridge in de aangewezen positie in het instrument en sluit de deur. Klik op start.Voer de naam van het experiment in het juiste tekstvak in het juiste tekstvak in wanneer u wordt gevraagd bij het type test. Wanneer u wordt gevraagd door de geactiveerde rundatum en het ID-nummer in het uitvoerenbestand, maakt u een notitie van het tijdstip waarop de run eindigt. Gooi aan het einde van de run de capillaire cartridge in de afvalverwerking van de scherpe en de plaat in de verwijdering van biogevaarlijke materialen.Controleer na de elektroforesescheiding de runbestanden op immuunreactiviteitspieken van antigenen bij 40 tot 43 kilodaltons die staan voor fosforyleerde eukaryotische vertaalinitiatiefactor 2A. Wanneer moleculaire gewichtspieken van deze grootte ontbreken, klikt u met de rechtermuisknop onder de curve en selecteert u moleculair gewicht toevoegen om te pieken om ervoor te zorgen dat de maten en willekeurige hoeveelheden onder de curve worden geregistreerd. Binnen de unprimeds weefsel monsters, bindende amino globuline eiwitniveaus in de kernen van de solitaire track zijn aanzienlijk hoger in vergelijking met alle andere regio's.Priming van het darmweefsel met biest vermindert de binding aminoglobuline eiwitniveaus in de kernen van het solitaire spoor en heeft geen effect op paraventriculaire kernen en super-optische kernen. Omgekeerd, priming verhoogt bindende amino globuin eiwitniveaus in de cortex, strepen kernen, en mediale preoptische kernen ten opzichte van de ongeprimeerde weefsel, wat impliceert dat bindende amino globuin eiwitniveaus in de verschillende geteste hersenkernen anders reageren op gut priming en er is nog geen aangetoonde crosstalk tussen de verschillende kernen getest. Eukaryotische vertaalinitiatiefactor 2A en fosforyleerde eukaryotische vertaalinitiatiefactor 2A-niveaus worden in de niet-geprimte toestand verhoogd ten opzichte van andere kernen.Na priming worden de niveaus van zowel eukaryotische vertaalinitiatiefactor 2A als fosforyleerde eukaryotische vertaalinitiatiefactor 2A verminderd ten opzichte van kernen van het solitaire spoor in vergelijking met ongeprimed weefsel. In alle andere geteste kernen verhoogt priming de niveaus van eukaryotische vertaalinitiatiefactor 2A en fosforyleerde eukaryotische vertaalinitiatiefactor 2A ten opzichte van ongeprimeerd weefsel. Echter, niveaus van fosforyleerde eiwit kinase receptor zijn laag in unprimed monsters ten opzichte van geprimede monsters in kernen van het solitaire spoor, sterk suggereert dat een andere kinase betrokken is bij de fosforylatie van eukaryotische vertaling initiatie factor 2A.Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van postnatale ontwikkeling om de signaleringstrajecten te verkennen die betrokken zijn bij weefselgroei en -differentiatie en of ze worden beïnvloed door of onafhankelijk van zogen. Vergeet niet dat het werken met vluchtige reducerende middelen zoals bijvoorbeeld dithiothreitol gevaarlijk kan zijn, en voorzorgsmaatregelen zoals voorbereiding in de chemische kap moeten altijd worden genomen bij de voorbereiding van deze procedure.

assessing-cellular-stress-inflammation-discrete-oxytocin-secreting

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We beschrijven een rat model van post-traumatische stress-stoornis (PTSS) dat de aanhoudende veranderingen in neuro-endocriene functie en de vertraagde lange termijn, overdreven angst reactie, kenmerkend voor PTSS-patiënten laat zien. Het diermodel en de hier beschreven methoden zijn nuttig voor het correleren van biomarkers in hersenkernen, die mechanisch maar kan niet worden gemeten in patiënten met biomarkers in perifere witte bloedcellen, die kan.

Biomarkers in een diermodel voor het openbaren van Neural, hematologische, en gedragsmatige correlaten van PTSS

This video demonstrates the isolation of oxytocin receptor-rich nuclei from the neonatal rat brain. Coronal slicing, followed by identification and precise punching of oxytocin receptor-rich brain nuclei, enables the effective extraction of oxytocin receptor-rich nuclei for further analysis.

Isolation of Oxytocin Receptor-Rich Nuclei from a Neonatal Rat Brain

Dit artikel beschrijft het gebruik van chronische inwoner indringer sociale spanning als een ethologically relevante paradigma naar model postpartum depressie en angst bij lacterende knaagdieren.

Met behulp van Chronische Sociale Stress om model postnatale depressie bij zogende Knaagdieren

Dit artikel beschrijft de procedures voor de tactiele stimulatie van pups rat en de daaropvolgende Golgi-Cox kleuring van neuronale morfologie. Tactiele stimulatie is een positieve ervaring die wordt toegediend in de perinatale periode door strelen pups met een huishouden stofdoek. Golgi-cox kleuring is een betrouwbare procedure waardoor de visualisatie van hele neuronen.

Visualiseren van de effecten van een positieve vroege Experience, Tactiel Stimulatie, op dendritische morfologie en Synaptic Connectiviteit met Golgi-Cox kleuring

Wij meten perigenital mechanische gevoeligheid en mestcel activering in de prostaat van mannelijke C57BL / 6 muizen die een vroege levensspanning paradigma ondergingen - neonatale maternale scheiding teneinde een preklinisch model van chronische prostatitis / chronisch bekkenpijnsyndroom induceren.

Beoordeling van Perigenital Sensitivity en Prostatic mestcelactivatie in een muismodel van Neonatale Maternal Separation

Stressvolle levensgebeurtenissen schaden de cognitieve functie, waardoor het risico op psychiatrische stoornissen toeneemt. Dit protocol illustreert hoe stress de cognitieve flexibiliteit beïnvloedt met behulp van een geautomatiseerd operante strategieverschuivingsparadigma bij mannelijke en vrouwelijke Sprague Dawley-ratten. Specifieke hersengebieden die ten grondslag liggen aan bepaald gedrag worden besproken en translationele relevantie van resultaten wordt onderzocht.

Beoordeling van stresseffecten op cognitieve flexibiliteit met behulp van een operante strategieverschuivingsparadigma

Het chronische psychosociale stress (CGS) paradigma maakt gebruik van klinisch relevante stressoren tijdens de zwangerschap bij muizen om psychiatrische stoornissen van moeders en zuigelingen te modelleren. Hier bieden we een stapsgewijze procedure voor het toepassen van het CGS-paradigma en downstream-beoordelingen om dit model te valideren.

Het gebruik van een Murine Model van Psychosociale Stress tijdens de Zwangerschap als een Translationeel Relevant Paradigma voor Psychiatrische Stoornissen bij Moeders en Zuigelingen

Hier presenteren we een beknopt protocol voor het maken van een te vroeg geboren rattenmodel, dat onderzoek naar vroege postnatale pijnbestrijding vergemakkelijkt. De methode omvat het uitvoeren van een keizersnede drie dagen voor de verwachte geboorte, het extraheren van premature rattenpups via hysterectomie en het integreren ervan met de biologische nakomelingen van een draagmoeder.

Een te vroeg geboren rattenmodel voor pijnstudies

Vroeggeboorte (bevalling &lt; 37 weken) is een urgent wereldwijd gezondheidsprobleem met suboptimale preventie- en behandelingsopties. We presenteren een muismodel van oplopende vaginale bacteriële infectie-geïnduceerde vroeggeboorte en schetsen hoe de resulterende neonatale morbiditeit en mortaliteit kunnen worden geanalyseerd.

Modellering van oplopende vaginale infectie, vroeggeboorte en neonatale morbiditeit bij muizen

Dit protocol beschrijft een diermodel om te bestuderen hoe tegenspoed in het vroege leven, veroorzaakt door een verarmde omgeving en onvoorspelbare moederlijke zorg tijdens de vroege postnatale periode, de ontwikkeling van de hersenen en het toekomstige risico op psychische stoornissen beïnvloedt.

Beperkte bodembedekking en nesten als model voor tegenspoed in het vroege leven bij muizen

Het artikel biedt een uitgebreid protocol om een muizenmodel voor moederlijke immuunactivatie (MIA) te genereren om de effecten van vroege zwangerschapsontsteking op de neuroontwikkeling te bestuderen, inclusief belangrijke meetwaarden om betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid te waarborgen.

Generatie van het vroeg-zwangerschapsmodel van moederlijke immuunactivatie om prenatale ontsteking op de neuroontwikkeling te beoordelen

Leer hoe je hersenkernen isoleert uit neonatale ratten om stresssignalering tijdens de eerste biestvoeding te bestuderen. Deze methode maakt ex-vivo analyse van weefsel mogelijk voor inzicht in hersenontwikkeling.

Beoordeling van cellulaire Stress en ontsteking in Discrete oxytocine-afscheidende kernen van de hersenen in de neonatale Rat vóór en na de eerste biest voeding (Video) | JoVE Journal

Beoordeling van cellulaire Stress en ontsteking in Discrete oxytocine-afscheidende kernen van de hersenen in de neonatale Rat vóór en na de eerste biest voeding

Meer video's verkennen