Name: Ex Vivo Beeldvorming van cel-specifieke Calcium signalering in de tripartiete Synaps van het middenrif muis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Leer calciumsignaalbeeldvorming in spier- en Schwann-cellen bij de neuromusculaire synaps van muizen. Deze ex vivo methode maakt real-time visualisatie van cel-specifieke dynamiek tijdens zenuwstimulatie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund met fondsen van de National Institutes of Health (NIH) GM103554 en GM110767 aan (T.W.G.) en van het National Center for onderzoeksmiddelen 5P20RR018751 en het National Institute of General Medical Sciences 8P 20 GM103513 (voor G.W.H.).

Veeteelt en experimenten werden uitgevoerd overeenkomstig de nationale instituten van gezondheid gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en de IACUC bij de Universiteit van Nevada.
1. bereiding van het pessarium en de Phrenic van de zenuwen van transgene muizen
<ol><li>Aankoop transgene muizen en oligonucleotide inleidingen te genotype deze muizen. Opmerking: De inleidingen zijn vermeld op de pagina 'Informatie' voor elk van deze muizen.<ol>
<li>Fokken van een 3 - tot 6-maand-oude muis uiting van één exemplaar van de passende transgene/knock-in Cre-driver allel en nul kopieën van het voorwaardelijke GCaMP3/6 -allel met een tweede muis van dezelfde leeftijd uiting geven aan een of twee exemplaren van de voorwaardelijke GCaMP3 / 6 -allel en nul kopieën van het Cre-driver-allel.</li>
		<li>Genotype de pups en mark degene die zowel Cre en voorwaardelijke GCaMP3/6 allelen — deze zullen voortaan worden genoemd dubbel-transgene muizen (bijvoorbeeld Myf5-Cre, voorwaardelijke GCaMP3)6. Opmerking: Op deze manier alle gegevens zal ontlenen muizen uiting van één exemplaar van de Cre zowel voorwaardelijke GCaMP3/6 allelen. Dit is vooral belangrijk als in andere mutant muizen (b.v., uitsparingen) toe te voegen aan deze kruizen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wanneer de dubbele-transgene muizen zijn van de juiste leeftijd (bv, postnatale dag 0 of 5 [P0 of P5] of volwassen), de muizen gewoon door het onthoofden van hen met een schaar (voor muizen jonger dan P10) of door ze te plaatsen in een zaal van de inademing Isofluraan euthanaseren — wanneer ze zijn niet langer inspelen op de staart met een paar pincet te knijpen, ze zijn klaar voor offer.</li>
	<li>Het dier offeren door onthoofding met een schaar.</li>
	<li>Sectie dwars over het gehele dier net onder de lever en net boven het hart en de longen met een iridectomy schaar.</li>
	<li>Ontleden weg de lever, het hart en de longen, voorzichtig om een lengte van de phrenic zenuw die voldoende lang is om te worden getrokken in het een zuiging-elektrode (d.w.z., 1-2 cm). Opmerking: De linker phrenic zenuw kan worden geïdentificeerd als een wit stukje weefsel waarmee u invoert van de mediale gedeelte van het linker diafragma. Het moet niet worden verminderd bij het verwijderen van de longen. De juiste phrenic zenuw loopt in een stuk van de fascia die ook bevat de superieure vena cava en dunner en witter dan de vena cava. Samen, doordringen ze allebei het recht mediale middenrif.</li>
	<li>Verder de ribbenkast en de wervelkolom, met uitzondering van de dunne rand rond het middenrif te verwijderen.</li>
	<li>Plaats het middenrif en de phrenic zenuw monster in een microfuge buis met Krebs-Ringer-oplossing met 1 µg/mL 594-αBTX voor 10 min in het donker. Opmerking: Deze concentratie van 594-αBTX etiketten ACh-receptoren (AChRs) zonder hun functie (persoonlijke observatie) blokkeren.</li>
</ol>2. stimulatie en opname van de spier-actie-mogelijkheden
<ol><li>Met behulp van minutien pinnen, het middenrif immobiliseren door vastzetten op een 6-cm schotel bedekt met diëlektrische siliconengel en gevuld met ~ 8 mL zuurstofrijk Krebs-Ringer-oplossing en plaatst u deze op het podium van de Microscoop. Perfuse het middenrif met meer Krebs-Ringer-oplossing (8 mL/min) voor 30 min. Opmerking: Dit rinses van de niet-afhankelijke 594-αBTX, evenals equilibrates van het weefsel na dissectie.</li>
	<li>Het maken van een zuignap elektrode volgens de gevestigde methoden7.<ol>
<li>Op 4 X vergroting, met behulp van een micromanipulator, de zuig elektrode overgaan in de linker phrenic zenuw en afzuigen door te trekken uit het vat van een 5 mL-spuit verbonden met de slang die is gekoppeld aan de zuiging elektrode. Opmerking: Als u met succes tekenen in de zuig elektrode, de phrenic zenuw is strak. Zet de stimulator aan en stimuleren de phrenic zenuw door flipping de handmatige schakelaar 1 x.</li>
		<li>Zorg ervoor dat het middenrif in reactie op de 1-Hz-stimulatie contracten door visueel onderzoek van het met helderveld verlichting. Als dat niet het geval is, de kruisspanning door te draaien aan de knop spanning stapsgewijs om een puls-supramaximal, die door een visueel onderzoek van de spiercontractie kan worden geverifieerd. Als nog niet zichtbaar, de zenuw blazen met de spuit en proberen te trekken het opnieuw door het toepassen van zuiging.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Uitschakelen van de perfusie en de spier-specifieke myosin remmer BHC6 of de spanning-gated natrium kanaal antagonist µ-conotoxin8 toevoegen om een eindconcentratie van 100 µM.<ol>
<li>Om 100 µM BHC, Pipetteer 4 µL van 200 mM voorraad in DMSO en predilute het in 1 mL Krebs-Ringer-oplossing.</li>
		<li>1 mL van Krebs-Ringer-oplossing verwijderen uit de schotel.</li>
		<li>De prediluted BHC, aan het gerecht toevoegen. Opmerking: Deze predilution voorkomt dat de inductie door onverdund DMSO van een niet-voorbijgaande fluorescerende antistofrespons uiting van GCaMP3 cellen.</li>
		<li>30 min wachten en schakel vervolgens, op de perfusie van verse Krebs-Ringer-oplossing voor een ander 20-30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De opname-elektrode voor te bereiden.<ol>
<li>Dragen handschoenen, een filamented borosilicaatglas met een buitendiameter (OD) van 1 mm en een binnendiameter (ID) van 0,4 mm plaats in een micropipet trekker en draai de wijzerplaten om klem het naar de gewenste positie. Sluit de deur van de trekker.</li>
		<li>De volgende instelling met behulp van een P-97 puller, program: warmte op 900, trek op 120, snelheid op 75, tijdstip 250, druk op 500, en geen extra lussen. Opmerking: Resistance (R) is gemeten met behulp van de besturingselementen van de software van de versterker: de data acquisitie software bevestigt weerstand door het oplossen van de formule V = IR. De controller software passeert een bekende stroom (I) (meestal 1 nA) door de elektrode en meet de verandering in spanning (V), zodat wij voor R. op te lossen</li>
		<li>Voor embryonale pessarium, ervoor zorgen dat de weerstand in de buurt van 60 MΩ en voor oudere pessarium, 10-20 MΩ. De opname-elektrode met 3 M KCl laden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Op 10 X vergroting, verlaagt u de elektrode in de spier, met behulp van een tweede micromanipulator aan de andere kant van het werkgebied als een stimulerende elektrode.</li>
	<li>Met behulp van elektrofysiologische data acquisitie software, wachten totdat de rustpotentiaal membraan van 0 in-65 verandert mV of lager.</li>
	<li>Stimuleren van 1 Hz en controleer of de aanwezigheid van een actiepotentiaal spier door te controleren voor een groot potentieel, dat een bescheiden overschrijding vertoont (potentieel dat boven 0 stijgt mV wanneer bij-65 begint mV of lager). Verwar niet stimulatie artefact met een actiepotentiaal. Opmerking: Potentials zijn aanzienlijk langer in duur (~ 5 ms) dan stimulatie artefacten.</li>
</ol>3. beeldvorming van de fluorescentie van het monster
<ol><li>Op 20 X vergroting, de eindplaat band in het midden van de spier te vinden door te zoeken naar 594-αBTX-label NMJs onder groen/geel licht excitatie (550 nm). Overschakelen naar de blauwe lichte excitatie (470 nm) naar afbeelding Ca2 + antwoorden in de spier, motor neuron of cellen van Schwann.</li>
	<li>Indien gewenst, instellen de afbeelding splitter met bandpass filters en een dichroïde single-rand-filter voor de beeldvorming van de dual-golflengte.</li>
	<li>Oog op de berekening van de maximale fluorescentie (Fmax) tentoongesteld door GCaMP3/6-uiten weefsel, toevoegen u 12 µL van 3 M kaliumchloride (KCl) aan de middenrif preparaten6.<ol>
<li>Experimenten met de brightness-balk op de lookup tabel bar ingesteld op 110% van het niveau waarop het weefsel GCaMP3/6-uiten verzadiging op 20 X vergroting, vertoont zonder weggooien in reactie op KCl uitvoeren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Een snelle gebeurtenissen registreren bij 20 kaders per seconde om niet missen.</li>
	<li>Met 1-45 s van 20-40 Hz van zenuwstimulatie stimuleren door het leveren van een trein van impulsen met behulp van de zuiging elektrode of farmacologische agonisten toevoegen door Bad toepassing of door perfusie en dynamische fluorescerende Ca2 + antwoorden in één cel subtype verzamelen samen met het statische 594-αBTX NMJ signaal. Opmerking: Als weefsel-specifieke rode of far-red GECI of GEVI muizen beschikbaar voor gebruik op de NMJ komen, ze kunnen worden gebruikt voor het verzamelen van twee dynamische signalen als gevolg van twee verschillende cellulaire elementen op de NMJ.</li>
	<li>Wanneer de imaging of elektrofysiologische experimenten worden voltooid omdat de gewenste resultaten zijn bereikt, perfuse van water door de linies perfusie en zuigen water 2 x - 3 x door de zuigkracht elektrode om ervoor te zorgen dat zouten niet doen opbouwen.</li>
</ol>4. uitvoer en analyse van de gegevens door een standaarddeviatie kaart van fluorescentie intensiteit (SDiu16)
<ol><li>Record beeldsequenties opgenomen als 16-bits TIFF-stapels en laad ze in de gewenste beeldvorming gegevens analysesysteem voor analyse.</li>
	<li>Selecteer afbeeldingsstapel van belang in de software van de 8d bestandsmenu, en klik om te laden.<ol>
<li>Zodra de video is geladen, scannen door de tijd om te identificeren van een sectie die geen cellulaire fluorescerende activiteit. Opmerking: Deze regio zal worden gebruikt om een monster van de achtergrond.</li>
		<li>Houd SHIFT ingedrukt en klik om het tekenen van een regio van belang (ROI) vak in het gebied aangewezen als het voorbeeldgebied achtergrond.</li>
		<li>Na het maken van het vak, druk op de SPATIEBALK voor het genereren van een perceel van achtergrond activiteit wijzigen.</li>
		<li>Met de rechtermuisknop op het spoor en de diverse optie de optie voorleggen Dump ROI tekstnotatie te maken van het spoor als een xy-coördinaat tekstbestand.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Terug naar de video van belang, scan opnieuw ter identificatie van de regio van de tijd waar de activiteit van belang plaatsvindt.<ol>
<li>Selecteer de regio van deze tijd met de middelste muisknop in het gele vak.</li>
		<li>Klik met de rechtermuisknop op de video en selecteer Stapel OPS en vervolgens Stat kaart optie 5. Opmerking: Dit zal genereren een standaarddeviatie-kaart (SD kaart) in het linker venster.</li>
		<li>Klik op de SD-kaart en vervolgens druk op de ] sleutel 19 x toepassen de gewenste kleur warmte-kaart.</li>
		<li>Met de rechtermuisknop op de SD-kaart en selecteer STM laden en opslaan, die de optie Opslaan als TIFF-stm te redden van de SD-kaart zal presenteren.</li>
		<li>Dan, druk op de [ sleutel 19 x terug te keren naar een kleurplan grijswaarden.</li>
		<li>Druk op C en vervolgens op D om dichtheid toewijzing hulpmiddelen. Gebruik de linker muisknop en muisknop in het midden, pas de drempel tot alle fluorescerende activiteit wordt weergegeven in de SD-kaart.</li>
		<li>Druk op C om de dichtheid tools met behoud van de drempel-instellingen te sluiten.</li>
		<li>Met de rechtermuisknop op de SD-kaart en selecteer STM deeltjes en dan Vinden PTCLS. Opmerking: Dit zal identificeren van afzonderlijke cellen uiten van fluorescerende activiteit.</li>
		<li>Nogmaals met de rechtermuisknop op de SD-kaart en selecteer Maken Particle ROIs. Opmerking: Dit zal de geselecteerde cellen op de oorspronkelijke video van belang superponeren.</li>
		<li>Houd SHIFT ingedrukten klik met de rechtermuisknop op een van de nu vastgestelde deeltje ROIs op de oorspronkelijke video.</li>
		<li>Selecteer ROI Marker en maatregel Int in ROI. Opmerking: Dit zal individuele fluorescerende activiteit percelen genereren voor elke geïdentificeerde ROI in de video van belang. Deze kunnen worden gered door met de rechtermuisknop op een van deze en selecteren Assorted, gevolgd door Dump ROI als tekst.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Raadpleeg voor gedetailleerde logica ten grondslag liggen aan deze operaties, de bron code bestand9.</li>
</ol>

<ol><li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).</li>
<li>Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+synaptogenesis%3A+coordinating+partners+with+multiple+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (11), 703-718 (2014).</li>
<li>Fatt, P., Katz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+the+end-plate+potential+recorded+with+an+intracellular+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">An analysis of the end-plate potential recorded with an intracellular electrode.</a> Journal of Physiology. 115 (3), 320-370 (1951).</li>
<li>Todd, K. J., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+modulation+of+synaptic+signalling+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archive%22%5BJournal%5D)">Purinergic modulation of synaptic signalling at the neuromuscular junction.</a> Pflugers Archive. 452 (5), 608-614 (2006).</li>
<li>Hennig, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Genetically+Encoded+Calcium+Indicators+%28GECIs%29+Combined+with+Advanced+Motion+Tracking+Techniques+to+Examine+the+Behavior+of+Neurons+and+Glia+in+the+Enteric+Nervous+System+of+the+Intact+Murine+Colon%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Use of Genetically Encoded Calcium Indicators (GECIs) Combined with Advanced Motion Tracking Techniques to Examine the Behavior of Neurons and Glia in the Enteric Nervous System of the Intact Murine Colon.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 9, 436(2015).</li>
<li>Heredia, D. J., Schubert, D., Maligireddy, S., Hennig, G. W., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Striated+Muscle-Specific+Myosin-Blocking+Drug+for+the+Study+of+Neuromuscular+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Novel Striated Muscle-Specific Myosin-Blocking Drug for the Study of Neuromuscular Physiology.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 10, 276(2016).</li>
<li>Johnson, B. R., Hauptman, S. A., Bonow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+simple+suction+electrode+for+extracellular+recording+and+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Undergraduate+Neuroscience+Education%22%5BJournal%5D)">Construction of a simple suction electrode for extracellular recording and stimulation.</a> Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 6 (1), A21-A26 (2007).</li>
<li>Hong, S. J., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+geographutoxin+II+%28mu-conotoxin%29+for+the+study+of+neuromuscular+transmission+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Use of geographutoxin II (mu-conotoxin) for the study of neuromuscular transmission in mouse.</a> British Journal of Pharmacology. 97 (3), 934-940 (1989).</li>
<li>Heredia, D. J., Feng, C. Y., Hennig, G. W., Renden, R. B., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-induced+Ca2%2B+signaling+in+perisynaptic+Schwann+cells+of+the+early+postnatal+mouse+is+mediated+by+P2Y1+receptors+and+regulates+muscle+fatigue%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Activity-induced Ca2+ signaling in perisynaptic Schwann cells of the early postnatal mouse is mediated by P2Y1 receptors and regulates muscle fatigue.</a> Elife. 7, e30839(2018).</li>
<li>Cho, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GCaMP-R+Family+of+Genetically+Encoded+Ratiometric+Calcium+Indicators%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">The GCaMP-R Family of Genetically Encoded Ratiometric Calcium Indicators.</a> ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Wij bieden hier enkele voorbeelden van het meten van Ca2 + reacties in specifieke cellen in intact neuromusculaire weefsel met behulp van GECI-uiten muizen. Om deze experimenten uitvoeren, is het absoluut noodzakelijk niet te verwonden de phrenic zenuw tijdens de dissectie. Naar image Ca2 + antwoorden in de cellen van Schwann op lage of hoge kracht (dat wil zeggen, 20 X of 60 X), moet het BHC of µ-conotoxin naar Blokverplaatsing gebruiken. Voor de beeldvorming van de spaarstand van Ca2...

De NMJ, zoals alle synapsen, bestaat uit drie elementen: een presynaptische terminal afgeleid van een neuron, een postsynaptisch neuron/effector cel, en een perisynaptic gliale cel1,2. Terwijl de basisaspecten van synaptische transmissie werden eerst gedemonstreerd op deze synapse3, blijven vele aspecten van dit proces onbekend, gedeeltelijk als gevolg van de expressie van de dezelfde moleculen door de verschillende cellulaire elementen van deze synapsen. Bijvoorbeeld, worden receptoren voor zowel de purine adenine nucleotide ATP en acetylcholine (ACh), die mede door motorische neuronen bij de gewervelde NMJ zijn vrijgegeven, uitgedrukt door spieren, cellen van Schwann en motorische neuronen, dus de interpretatie van een complicerende functioneel effect uitgeoefend door deze stoffen (b.v., zender release of reactie, spier strijdkrachtgeneratie)4. Bovendien, hoewel de tripartiete componenten van de NMJ eenvoudig zijn in vergelijking met, bijvoorbeeld neuronen in het centrale zenuwstelsel die vaak meerdere synaptic ingangen vertonen, of motorische neuronen, spiercellen, of cellen van Schwann in reactie op stimuli op basis verschillen op hun intrinsieke heterogeniteit (bijvoorbeeldembryonale afleiding, vezel subtype, morfologie) is onduidelijk. Om elk van deze kwesties, zou het voordelig voor het gelijktijdig het bijhouden van de reactie van veel cellen binnen één synaptic element, evenals spoor, op hetzelfde moment, een dergelijk antwoord op een van de andere afzonderlijke elementen. Conventionele strategieën door middel van chemische kleurstoffen te meten calcium signalering niet kunnen deze twee doelen, bereiken omdat Bad-toegepast kleurstof in beslag door meerdere celtypen na toepassing aan weefsel genomen wordt, en intracellulair geladen kleurstof kan alleen worden gebruikt om te visualiseren individuele of kleine cohorten van cellen. Hier, met behulp van transgene muizen uiting van GECIs ontworpen voor de meting van de cel-specifieke calcium signalering, samen met specifieke imaging en software tools5, we tonen de eerste van deze twee algemene doelstellingen en bespreken hoe de toevoeging van nieuwe transgene hulpmiddelen zou helpen met het bereiken van de tweede. Deze techniek zal zitten nuttig voor iedereen die geïnteresseerd is in het bijhouden van calcium dynamics of andere cellulaire gebeurtenissen waarneembare signalering via gen gecodeerde optische sensoren in meerdere cel populaties op hetzelfde moment.

<table><tbody><tr><td>Myf5-Cre muizen</td><td>Jax</td><td>#007893</td><td>Drijft spiercelexpressie zo vroeg als E136</td></tr><tr><td>Wnt1-Cre muizen</td><td>Jax</td><td>#003829</td><td>Drijft expressie naar alle&nbsp; Schwann-cellen bij E13 maar niet P209</td></tr><tr><td>Sox10-Cre muizen</td><td>Jax</td><td>#025807</td><td>Drijft Schwann-celexpressie op oudere leeftijden</td></tr><tr><td>Conditionele GCaMP3 muizen</td><td>Jax</td><td>#029043</td><td>Expresseert GCaMP3 op celspecifieke wijze</td></tr><tr><td>Conditionele GCaMP6f muizen</td><td>Jax</td><td>#024105</td><td>Expresseert GCaMP6f op celspecifieke wijze</td></tr><tr><td>BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-on)</td><td>Hit2Lead</td><td>#5102862</td><td>Blokkeert skeletspiermyosine maar niet neurotransmissie6</td></tr><tr><td>CF594-&alpha;-BTX</td><td>Biotium</td><td>#00007</td><td>Labelt acetylcholinereceptorclusters op NMJ</td></tr><tr><td>&micro;-conotoxine GIIIb</td><td>Peptides Int'l</td><td>#CONO20-01000</td><td>Blokkeert Nav1.4 spanningsafhankelijke natriumkanaal8</td></tr><tr><td>Silicone Dielectric Gel; ook bekend als Sylgard</td><td>Ellswoth Adhesives</td><td># Sil Dielec Gel.9KG&nbsp;</td><td>Maakt de immobilisatie van het diafragma mogelijk door middel van minutien-pins</td></tr><tr><td>Minutien-pins (0,1 mm diameter)</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>Immobiliseert diafragma op siliconen dielectric gel</td></tr><tr><td>Eclipse FN1 rechtopstaande microscoop&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MBA74100</td><td>Maakt staging en observatie van specimen mogelijk</td></tr><tr><td>Basisplatform voor vaste microscoop met handmatige XY-microscoopvertaler&nbsp;</td><td>Autom8</td><td>MXMScr</td><td>Maakt beweging van specimen mogelijk</td></tr><tr><td>Handmatige micromanipulator&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td>Houdt opname- en stimulatie-elektroden&nbsp; vast</td></tr><tr><td>Micro-elektrode versterker&nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>Axoclamp 900A</td><td>Maakt scherpe elektrode intracellulaire elektrofysiologische opname mogelijk</td></tr><tr><td>Micro-elektrode laag-ruis data-acquisitiesysteem</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1550&nbsp;</td><td>Maakt elektrofysiologische data-acquisitie mogelijk</td></tr><tr><td>Micro-elektrode data-analysesysteem</td><td>Molecular Devices</td><td>PCLAMP 10 Standard</td><td>Voert elektrofysiologische data-analyse uit</td></tr><tr><td>Vierkantgolfstimulator</td><td>Grass</td><td>S48</td><td>Stimuleert zenuw om spier te exciteren</td></tr><tr><td>Stimulatie-isolatie-eenheid</td><td>Grass</td><td>PSIU6</td><td>Vermindert&nbsp; stimulatie-artefacten</td></tr><tr><td>Borosilicaat filamenten, 1,0 mm buitendiameter, 0,5 mm binnendiameter&nbsp;</td><td>Sutter</td><td>FG-GBF100-50-15</td><td>Impaleert en neemt zenuw-geïnduceerde spierpotentiëlen op</td></tr><tr><td>Borosilicaat filamenten, 1,5 mm buitendiameter, 1,17 mm binnendiameter&nbsp;</td><td>Sutter</td><td>BF150-117-15</td><td>Verlengd en gebruikt voor zuigelektrode</td></tr><tr><td>Micropipet-trekker</td><td>Sutter</td><td>P-97&nbsp;</td><td>Trekt en bereidt opname-elektroden</td></tr><tr><td>1200x1200 pixel, achterverlichte cMOS-camera&nbsp;</td><td>Photometrics</td><td>Prime 95b</td><td>Gevoelige camera die hoge resolutie, hoge snelheid beeldvorming mogelijk maakt</td></tr><tr><td>Lichtbron</td><td>Lumencor</td><td>Spectra X</td><td>Zorgt voor verlichting vanaf LEDs voor fluorescentieobservatie</td></tr><tr><td>&nbsp;Oneindig gecorrigeerde fluorescente water-immersieobjectieven, W.D. 2 mm&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>CFI60</td><td>Biedt lange werkafstanden voor visualisatie van specimen</td></tr><tr><td>Vezeloptische verlichter met halogeenlamp</td><td>Sumita</td><td>LS-DWL-N</td><td>Zorgt voor verlichting voor brightfield-observatie</td></tr><tr><td>W-View Gemini Image Splitter&nbsp;</td><td>Hamamatsu</td><td>A12801-01</td><td>Projecteert 1 paar dual-wavelength beelden gescheiden door een dichroisch naar een enkele camera</td></tr><tr><td>Single-band Bandpass Filters&nbsp; (512/25-25 en 630/92-25)&nbsp;</td><td>SemRock</td><td>FF01-512/25-25; FF01-630/92-25</td><td>Maakt dubbele bandbeeldvorming mogelijk</td></tr><tr><td>560 nm Single-Edge Dichroic Beamsplitter</td><td>Sem Rock</td><td>FF560-FDi01-25x36</td><td>Dichroische spiegel die lichtbundels scheidt om dual-wavelength beeldvorming mogelijk te maken</td></tr><tr><td>Beeldvorming data-acquisitiesysteem</td><td>Nikon</td><td>NIS Elements - MQS31000</td><td>Maakt beeldvorming data-acquisitie mogelijk</td></tr><tr><td>Golflengte controle module</td><td>Nikon</td><td>MQS41220</td><td>Module voor beeldvorming data-acquisitie</td></tr><tr><td>Emissie splitter hardware module&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MQS41410</td><td>Module voor beeldvorming data-acquisitie</td></tr><tr><td>Beeldvorming data-analysesysteem</td><td>NA</td><td>Volumetry 8D5, Fiji</td><td>Maakt analyse van fluorescentie-intensiteit en andere beeldvormingsgegevens mogelijk</td></tr></tbody></table>

ex vivo beeldvorming van cel-specifieke calcium signalering in de tripartiete synaps van het middenrif muis

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

De elektrische activiteit van cellen in weefsels door elektrofysiologische technieken kan worden gecontroleerd, maar deze zijn meestal beperkt tot de analyse van afzonderlijke cellen. Aangezien een verhoging van intracellulair calcium (Ca2 +) in het cytosol wordt vaak door de elektrische activiteit veroorzaakt, of in antwoord op een groot aantal andere stimuli, dit proces kan worden gecontroleerd door de beeldvorming van cellen geladen met fluorescerende calcium-gevoelige kleurstoffen.  Het is echter moeilijk om het imago van deze reactie in een afzonderlijke celtype binnen hele weefsel, omdat deze kleurstoffen worden overgenomen door alle celtypes in het weefsel. In tegenstelling, genetisch gecodeerde calcium indicatoren (GECIs) kunnen worden uitgedrukt in een afzonderlijke celtype en lichten in antwoord op een verhoging van intracellulaire Ca2 +, dus de beeldvorming van Ca2 + signalering in hele bevolkingen van het toelaat individuele celtypes. Hier, wij het gebruik van de GECIs GCaMP3/6 van toepassing op de muis motorische eindplaat, een tripartiete SYNAPS tussen motorische neuronen, skeletspieren en terminal/perisynaptic cellen van Schwann. We tonen het nut van deze techniek in klassieke ex vivo weefsel preparaten. Met behulp van een optische splitter, voeren wij dual-golflengte beeldvorming van dynamische Ca2 + signalen en een statische label van de motorische eindplaat (NMJ) in een benadering die kan gemakkelijk aangepast worden aan twee cel-specifieke GECI of genetisch gecodeerde spanning controleren indicatoren (GEVI) tegelijk. Tot slot bespreken we de routines gebruikt voor het vastleggen van ruimtelijke kaarten van de intensiteit van de fluorescentie. Samen kunnen deze optische, transgene en analytische technieken worden toegepast om te bestuderen van de biologische activiteit van afzonderlijke cel subpopulaties op de NMJ in een breed scala van contexten.

Verschillende voorbeelden van fluorescentie intensiteit veranderingen, gemedieerd door verhogingen van intracellulaire Ca2 + binnen de gedefinieerde celtypes van het NMJ, tonen het nut van deze aanpak. Deze resultaten worden gepresenteerd als ruimtelijke fluorescentie intensiteit kaarten, waarmee de locatie van de reagerende cellen, alsmede de intensiteit van hun antwoorden, zodat voor de beoordeling van hoeveel cellen reageren en hoeveel elke cel reageert op een bepaalde stimu...

Hier presenteren we een protocol bij afbeelding calcium signalering bij populaties van individuele celtypes op de lymfkliertest motorische eindplaat.

Ex Vivo Beeldvorming van cel-specifieke Calcium signalering in de tripartiete Synaps van het middenrif muis

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het neuromusculaire veld, zoals de rol van calcium signalering in spier- of Schwanncellen in reactie op zenuwstimulatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat men de activering van specifieke celtypes kan beeld in reactie op zenuwstimulatie. Om te beginnen, verkrijgen van transgene muizen, en genotype ze zoals beschreven in het tekstprotocol.Na euthanasie, dwars doorsnede over het hele dier net onder de lever en net boven het hart en de longen met een irisctomieschaar. Ontleed de lever, het hart en de longen. Voorzichtig zijn om een lengte van de phrenic zenuw die voldoende lang genoeg is om te worden getrokken in een zuigelektrode te handhaven.Verwijder verder de ribbenkast en de wervelkolom, met uitzondering van de dunne nok rond het middenrif. Plaats het middenrif en het phrenic zenuwmonster in een microfugebuis met Krebs-Ringer oplossing die één microgram per milliliter fluorescerend gelabeld alfa bungarotoxine bevat. Laat het monster in het donker 10 minuten in de oplossing uitbroeden.Met behulp van minutien pinnen immobiliseren het middenrif door pinning het op een schaal van zes centimeter bekleed met siliconen diëlektrische gel en gevuld met ongeveer acht milliliter zuurstofrijke Krebs-Ringer oplossing. Leg de schotel op het microscooppodium. Vul vervolgens het middenrif door met meer Krebs-Ringer-oplossing met acht milliliter per minuut gedurende 30 minuten.Bij vier keer vergroting, met behulp van een micromanipulator, verplaats de zuigelektrode over de linker phrenic zenuw. Breng de zuigkracht aan door het vat van een vijf milliliter spuit eruit te trekken die is aangesloten op de slang die aan de zuigelektrode is bevestigd. Zorg ervoor dat het middenrif contracten in reactie op de ene hertz stimulatie door visueel te onderzoeken met Brightfield verlichting.Zo niet, pas de spanning door het draaien van de spanning knop stapsgewijs om een supramaximale puls die kan worden geverifieerd door visueel onderzoek van spiercontractie te bereiken. Als nog steeds niet zichtbaar, blaas de zenuw met de spuit en proberen om het te trekken in opnieuw door het toepassen van zuigkracht. Zet nu de perfusie uit om de spierspecifieke myosineremmer BHC of de spanning gated natriumkanaal antagonist mu-conotoxine toe te voegen.Bereid de BHC pre-verdunning door het pipetten van vier microliters van 200 millimolar voorraad BHC in DMSO in een milliliter van Krebs-Ringer oplossing. Haal een milliliter Krebs-Ringer-oplossing uit de schaal. Voeg vervolgens de voorverdunde BHC toe aan de schotel.Zet na 30 minuten de perfusie van verse Krebs-Ringer-oplossing nog 20 tot 30 minuten aan. Het dragen van handschoenen, bereiden de opname elektrode door het plaatsen van een borosilicaat filamented glas met een buitenste diameter van een millimeter en een binnendiameter van 0,4 millimeter in een micropipette trekker. Draai de wijzerplaten vast om deze in positie te klemmen en sluit de deur van de trekker.Programmeer vervolgens de trekker zoals beschreven in het tekstprotocol. Voor embryonale diafragma's meet u de weerstand met behulp van softwarebesturingselementen van de versterker. Zorg ervoor dat de weerstand is in de buurt van 60 megaohms en voor oudere diafragma's, 10 tot 20 megaohms.Laad de opnameelektrode met drie molaire kaliumchloride. Bij 10 keer vergroting, laat de elektrode in de spier met behulp van een tweede micromanipulator aan de andere kant van het podium als een stimulerende elektrode. Met behulp van elektrofysiologische data acquisitie software wachten tot de rustende membraan potentieel verandert van nul tot min 65 millivolt of lager.Stimuleren op een hertz en controleer de aanwezigheid van een spier actie potentieel door te controleren op een groot potentieel dat een bescheiden overshoot vertoont. Verwar stimulatieartefact niet met een actiepotentieel. Bij 20 keer vergroting lokaliseren van de eindplaat band in het midden van de spier door te zoeken naar fluorescerend gelabeld alpha bungarotoxine neuromusculaire knooppunten onder groen geel licht excitatie.Overschakelen naar blauw licht excitatie naar beeld calcium reacties in spier, motorneuron, of Schwann cellen. In dit voorbeeld wordt GCaMP drie uitgedrukt in spiercellen. Stel indien gewenst de beeldsplitser in met bandpassfilters en een dichroic single edge filter voor de dubbele golflengte beeldvorming.Voer experimenten uit met de helderheidsbalk op de opzoektafelbalk die is ingesteld op 110% van het niveau waarop de genetisch gecodeerde calciumindicator die weefsel uitdrukt, verzadiging vertoont bij 20 keer vergroting zonder binning in reactie op kaliumchloride. Record op 20 frames per seconde dus niet te missen snelle evenementen. Stimuleer met één tot 45 seconden van 20 tot 40 hertz zenuwstimulatie door een trein van impulsen te leveren met behulp van een zuigelektrode en verzamel dynamische fluorescerende calciumreacties in één celsubtype samen met het statische fluorescerende alfaimparotoxine neuromusculaire verbindingssignaal.Farmacologische agonisten kunnen ook worden toegevoegd door badtoepassing of perfusie en de dynamische fluorescerende calciumreacties kunnen op dezelfde manier worden verzameld. Wanneer de beeldvorming of elektrofysiologische experimenten zijn voltooid omdat de gewenste resultaten zijn bereikt, doorsneed water door de perfusielijnen en zuigen water twee tot drie keer door de zuigelektrode om ervoor te zorgen dat zouten niet opbouwen. Een ruimtekaart van de celcalciumreacties van Schwann aan phrenic zenuwstimulatie van een Wnt GCaMP drie muisdiafragma op post natale dag zeven toont een beperking aan terminale parasynaptische Schwann cellen bij de neuromusculaire verbinding.Hetzelfde diafragma werd afgebeeld na het labelen met fluorescerend gelabeld alpha bungarotoxine, die obligaties om acetylcholine receptoren van de neuromusculaire kruising mogelijk te maken. Hetzelfde diafragma werd ook afgebeeld onder Brightfield verlichting om een opname-elektrode te begeleiden naar de post-synaptische regio van de spier door de neuromusculaire verbinding. Hier wordt ruimtelijke afbakening van kleurgecodeerde cellen of gebieden van belang genomen voor de analyse van individuele calcium voorbijgaande stoffen.De ruimtelijke kaart van spiercel calcium reacties van een mth 5 GCaMP drie muis diafragma bij P vier tot phrenic zenuwstimulatie in aanwezigheid van de myosine remmer BHC toont een reactie in het hele gebied van alle diafragma spiercellen. In tegenstelling, stimulatie van hetzelfde diafragma in de aanwezigheid van mu-conotoxine veroorzaakt een ruimtelijk beperkte calciumrespons in het mediale gebied van alle diafragma spiercellen die overeenkomt met de acetylcholine receptor cluster verrijkt eindplaat band. Na deze procedure kunnen andere methoden worden uitgevoerd, zoals immuno-histochemie of immunoblotting om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals, wat is het moleculaire profiel van cellen geïdentificeerd door elektrofysiologie of calciumbeeldvorming?Deze methode kan inzicht geven in de reacties van de bevolking van Schwann cellen en spiercellen op zenuwstimulatie in normale neonatale muizen. Het kan ook worden toegepast op de studie van oudere muizen of op de studie van muizen die neuromusculaire ziekte geassocieerde eiwitten uitdrukken.

ex-vivo-imaging-cell-specific-calcium-signaling-at-tripartite-synapse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Source: Heredia, D. J., et. al. Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm. J. Vis. Exp. (2018) This video demonstrates fluorescence imaging of calcium dynamics at neuromuscular junctions (NMJs) in a transgenic mouse expressing genetically encoded calcium indicators. A NJM is identified by fluorescently tagged acetylcholine receptors in the diaphragm with the phrenic nerve. An image splitter is used to visualize multiple signals...

Fluorescence Imaging of Calcium Dynamics at Neuromuscular Junctions in the Diaphragm of a Transgenic Mouse

Source: Shannonhouse, J., et al.In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia. J. Vis. Exp. (2023).The video demonstrates an in vivo calcium imaging technique to monitor neuronal activity in the dorsal root ganglia (DRG) of a transgenic mouse. DRG neurons express a calcium indicator that increases fluorescence intensity upon binding to calcium. Mechanical or thermal stimuli applied to a hind paw generate action potentials that...

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in the Intact Dorsal Root Ganglia of a Mouse

Source: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates calcium imaging to visualize and analyze the activity of enteric neurons and glia in mouse Colonic Myenteric plexus preparations.

Calcium Imaging of Enteric Neuron and Glia Activities in a Mouse Colonic Myenteric Plexus

Source: Ishimoto, H. et. al., Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila. J. Vis. Exp. (2018) This video demonstrates calcium imaging to study Drosophila brain responses to neuropeptides. Neurons expressing a fluorescent calcium indicator reveal intracellular calcium dynamics and functional responses to signaling molecules.

Ex Vivo Calcium Imaging to Study Drosophila Brain Responses to Neuropeptides

Hier presenteren we technieken voor het beeldvormen van lokale IP3-gemedieerde Ca2+-gebeurtenissen met behulp van fluorescentiemicroscopie in intacte zoogdiercellen die zijn geladen met Ca2+-indicatoren, samen met een algoritme dat de identificatie en analyse van deze gebeurtenissen automatiseert.

Imaging Lokale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signalen in gekweekte zoogdiercellen

Dit witboek beschrijft een protocol voor ex vivo calcium beeldvorming van de hersenen van Drosophila . Bij deze methode, kunnen natuurlijke of synthetische verbindingen worden toegepast op de buffer voor het testen van hun vermogen om bepaalde neuronen in de hersenen activeren.

Ex Vivo Calcium Imaging voor het visualiseren van hersenen reacties op endocriene signalering in Drosophila

Hier presenteren we een protocol voorbeeld vorming en kwantificeren van de calcium dynamica in heterogene celpopulaties, zoals de eiland cellen van de alvleesklier. Fluorescerende verslaggevers worden geleverd in de perifere laag van cellen binnen het eilandje, die vervolgens wordt geïmmobiliseerd en imaged, en per-cel analyse van de dynamiek van de intensiteit van de fluorescentie wordt uitgevoerd.

Imaging calcium dynamica in subpopulaties van muizen pancreatic eilandje cellen

Het huidige protocol beschrijft het maken van een groot (6 x 3 mm2) schedelvenster met behulp van voedselwikkel, transparante siliconen en afdekglas. Dit schedelvenster maakt in vivo wide-field en twee-foton calcium imaging experimenten in dezelfde muis mogelijk.

In vivo Wide-Field en Two-Photon Calcium Imaging van een muis met behulp van een groot craniaal venster

Dit protocol beschrijft de chirurgische blootstelling van het dorsale wortelganglion (DRG) gevolgd door GCaMP3 (genetisch gecodeerde Ca2 + indicator; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ beeldvorming van de neuronale ensembles met behulp van Pirt-GCaMP3-muizen tijdens het toepassen van een verscheidenheid aan stimuli op de ipsilaterale achterpoot.

In Vivo Calciumbeeldvorming van neuronale ensembles in netwerken van primaire sensorische neuronen in intacte dorsale wortelganglia

Hier presenteren we een protocol voor ex vivo calciumbeeldvorming bij volwassen Drosophila met GCaMP6-expressie om epileptiforme activiteiten te monitoren. Het protocol biedt een waardevol hulpmiddel voor het onderzoeken van ictale gebeurtenissen bij volwassen Drosophila door middel van ex vivo calciumbeeldvorming, waardoor de mogelijke mechanismen van epilepsie op cellulair niveau kunnen worden onderzocht.

Ex Vivo Calciumbeeldvorming voor Drosophila-model van epilepsie

We presenteren calciumbeeldvormingsprotocollen voor een Drosophila-larvale olfactorische neuron, met behulp van een topische weefsellijm voor immobilisatie. Deze methode verbetert de stabiliteit en maakt betrouwbare in- en ex-vivo-experimenten mogelijk. Aangepaste R-scripts analyseren calciumsignalen en bieden een efficiënt platform voor gedetailleerd neurofysiologisch onderzoek.

In-vivo en ex-vivo calciumbeeldvorming van een reukcircuitneuron in de larve van de Drosophila melanogaster met een derde instar

Leer calciumsignaalbeeldvorming in spier- en Schwann-cellen bij de neuromusculaire synaps van muizen. Deze ex vivo methode maakt real-time visualisatie van cel-specifieke dynamiek tijdens zenuwstimulatie mogelijk.

Ex Vivo Beeldvorming van cel-specifieke Calcium signalering in de tripartiete Synaps van het middenrif muis

Meer video's verkennen