High-throughput meting van plasmamembraan opnieuw verzegelen efficiëntie bij zoogdiercellen

Deze test is ontwikkeld om belangrijke vragen op het gebied van plasmamembraanbiologie aan te pakken en vast te stellen hoe efficiënt beschadigde cellen hun plasmamembraan kunnen herssepen. Deze techniek kan worden gebruikt om de efficiëntie van plasmamembraanherseten in een hoge doorvoercapaciteit te meten en om specifieke eiwitten en overeenkomstige trajecten te identificeren die plasmamembraan hersluiten. Begin met het toevoegen van 20 milliliter van een 2,5 keer 10 aan de vijfde HeLa cellen per milliliter groeimedium suspensie in een steriel pipetbekken en gebruik een 10 milliliter serologische pipet om de cellen grondig te mengen.

Gebruik vervolgens een multichannel micropipet om 100 microliter cellen per put in drievoud te zaaien in een 96-well platte, heldere bodem, zwarte polystyreen weefselkweek behandelde plaat. Vergeet niet dat een homogene celverdeling de sleutel is tot een succesvol experiment, omdat vergelijkingen tussen alle experimentele omstandigheden gelijkwaardige celtellingen vereisen. Na 24 uur in de bevochtigde celkweek incubator op 37 graden Celsius en 5% CO2, prewarm de plaatlezer op 37 graden Celsius en stel de optische configuratie op monochromator, de leesmodus op fluorescentie, en het leestype kinetisch.

Selecteer onder de golflengte-instellingen een excitatie van negen nanometer en een 15 nanometer emissiebandpass. Voor tests met behulp van propidium jodide, stel de excitatie en emissie golflengten op 535 nanometer en 617 nanometer, respectievelijk. Selecteer onder het plaattype 96-putten voor het plaatformaat en selecteer een vooraf ingestelde plaatconfiguratie die overeenkomt met een zwarte wandheldere bodemplaat.

Onder leesgebied, markeer de putten die zullen worden geanalyseerd in de kinetische test. Onder PMT en optica, vooraf ingestelde de flitsers per lezen tot zes en schakel het vakje voor lezen van onderen. Voer onder timing nul uur 30 minuten en nul seconden in de totale looptijd voor een kinetische test van 30 minuten in en voer nul uur vijf minuten en nul seconden in voor het interval.

Bevestig de opgegeven instellingen in de instellingengegevens en klik op OK. Klik vervolgens op lezen om de kinetische run te starten. Als u de beeldparameters in de instellingenmodus wilt instellen, stelt u MiniMax in voor de optische configuratie, de weergave voor de leesmodus en het eindpunt voor het leestype. Selecteer onder golflengten het uitgezonden licht en de juiste fluorescentieboxen die overeenkomen met de experimentele opwinding en emissiegolflengten.

Stel het plaattype en het leesgebied in zoals net is aangetoond en stel onder de putgebiedinstelling het aantal sites in binnen een put die moet worden weergegeven. Stel onder de instellingen voor het verkrijgen van afbeeldingen voor GFP het apparaat in op het geheel goed weergeven met een belichtingstijd van 20 milliseconden per afbeelding. Voor uitgezonden licht, het verwerven van een enkel beeld van het centrum van elke put met een acht milliseconde belichtingstijd.

Voor propidium jodide, het verwerven van een enkel beeld in het midden van elke put met een 20 milliseconde belichtingstijd. Bevestig vervolgens de instellingen in de instellingen-informatie en klik op OK en lees om de beeldvorming te starten. Om een op hoge doorvoerfluorescentie gebaseerde test voor de reparatie tolerante omstandigheden, was de cellen twee keer met 200 microliters van 37 graden Celsius M1 medium per goed en voeg 100 microliters van verse 37 graden Celsius M1 medium aangevuld met 30 micromolar propidium jodide na het weggooien van de tweede wasbeurt.

Voor reparatie beperkende voorwaarden, was de cellen een keer met 200 microliter van 37 graden Celsius M2 medium aangevuld met vijf millimolar EGTA per goed gevolgd door een wasbeurt met 200 microliter van M2 medium alleen. Voeg na het weggooien van de tweede was 100 microliter verse 37 graden Celsius M2 medium toe, aangevuld met 30 micromolar propidium jodide per put. Beeld vervolgens de plaat onder uitgezonden licht, GFP en PI zoals net aangetoond.

Terwijl de plaat wordt afgebeeld, plaats een 96 goed ronde bodem polypropyleen microplate op ijs en configureren van de plaat zoals net aangetoond voor de vorige plaat. Voor reparatie tolerante omstandigheden, voeg 100 microliters van ijskoude M1 medium aangevuld met 60 micromolar propidium jodide per goed gevolgd door de toevoeging van 100 microliters van ijskoude M1 met of zonder 4X listeriolysine O per goed. Voor reparatie beperkende voorwaarden, voeg 100 microliters van ijskoude M2 medium aangevuld met 60 micromolar propidium jodide per goed gevolgd door de toevoeging van 100 microliters van ijskoude M2 met of zonder 4X listeriolysine O per goed.

Het is absoluut noodzakelijk om listeriolysine O ongeveer vijf minuten voor het begin van de kinetische test op de juiste experimentele concentratie op ijs te bereiden wanneer plaat één op ijs staat en plaat twee wordt voorbereid. Wanneer de eerste plaat klaar is met beeldvorming, breng de plaat onmiddellijk over op een vel aluminiumfolie op ijs. Na vijf minuten, breng 100 microliter van elke put van de tweede plaat naar de juiste overeenkomstige goed in de eerste gekoelde plaat, het invoegen van de pipet tips onder de meniscus van de oplossing in elke goed voor het uitwerpen van het volume zonder te mengen voor een goede verdeling van het toxine.

Laat het toxine gedurende één minuut aan de gastheercellen binden en breng de eerste plaat onmiddellijk over naar de plaatlezer voor de post-kinetische test met behulp van de spectrofluorometermodus. Aan het einde van de kinetische test, onmiddellijk verwerven van een post-kinetische beeldvorming van de plaat beeld zoals aangetoond voor de pre-kinetische beeldvorming. Als u het aantal cellen wilt bepalen op basis van de nucleaire fluorescentie, selecteert u in de opsomkingssoftware microplatecel onder instellingen re-analyse en selecteert u in de instellingen van de beeldanalyse discrete objectanalyse met 541 als golflengte voor het vinden van objecten.

Gebruik in de optie Objecten zoeken de methode tekenen op afbeeldingen, selecteer nuclei's en klik op toepassen en klik vervolgens op OK en lees om het celtelalgoritme te starten. GFP-expressie interfereert niet met propidium jodide intensiteitsmetingen bij de aanwezigheid of afwezigheid van listeriolysine O-behandeling. De expressie van propidium jodide kan bloeden door middel van GFP fluorescentie zoals blijkt uit een toename van de GFP fluorescentie intensiteit in HeLA H2B-GFP cellen in de post-kinetische beeldvorming test in vergelijking met de pre-kinetische analyse.

Belangrijk is echter dat deze cross-over niet van invloed is op het tellen van cellen, omdat het segmentatieproces dat betrokken is bij de opsomring van de kernen niet wordt beïnvloed door een toename van de GFP-fluorescentie. Bij afwezigheid van listeriolysine O blijft de plasmamembraanintegriteit constant in de aanwezigheid of afwezigheid van extracellulair calcium, terwijl de listeriolysine O-behandeling in aanwezigheid van calciumgevulde medium resulteert in een gestage toename van de propidium jodidefluorescentieintensiteit. Bij afwezigheid van extracellulair calcium is er echter een aanzienlijk steilere toename van propidium jodidefluorescentie, als gevolg van de afwezigheid van membraanherseving.

Als alternatief kan een carbocyanine nucleïnezuurbindingskleurstof met fluorescentie in het verre rood worden vervangen door propidiumjodide om de spectrale overlap met GFP te minimaliseren. Bovendien vertoont de grotere opwindingscoëfficiënt voor de verre rode kleurstof een hogere signaal-ruisverhouding en een betere resolutie tussen de reparatie tolerante en reparatiebeperkende voorwaarden. Tijdens een poging tot deze procedure wordt aanbevolen om alle buizen een dag voor het experiment te labelen, omdat dit u voorbereidt op alle reagensvoorbereiding op de dag van het experiment.

Na deze procedure kunnen andere methoden zoals beeldcytometrie worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals een porievormend toxine, alle cellen gelijkmatig beschadigt of zijn sommige cellen vatbaarder dan andere. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van infectieziekten en plasmamembraanreparatie om de effecten van poriegrootte op de reparatie-efficiëntie van verschillende celtypen te onderzoeken.