Name: Imaging-cel interactie in tracheale Mucosa tijdens Influenza virusinfectie met behulp van twee-foton Intravital microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Leer twee-foton intravital microscopie voor immuunceldynamiek in de tracheale mucosa van muizen tijdens influenza-infectie. Deze methode maakt real-time analyse van neutrofielen en dendritische cellen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de Zwitserse nationale Stichting (SNF) subsidies (176124, 145038 en 148183), de Europese Commissie Marie Curie reïntegratietoelage (612742) en de SystemsX.ch voor een subsidie voor de D.U.P. (2013/124).

<ol><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li>
<li>Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+magic%3A+multiphoton+microscopy+in+the+biosciences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).</li>
<li>Fein, M. R., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caught+in+the+act%3A+revealing+the+metastatic+process+by+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Caught in the act: revealing the metastatic process by live imaging.</a> Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 580-593 (2013).</li>
<li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).</li>
<li>Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choreography+of+cell+motility+and+interaction+dynamics+imaged+by+two-photon+microscopy+in+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs.</a> Annual review of immunology. 26, 585-626 (2008).</li>
<li>Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Decade+of+Imaging+Cellular+Motility+and+Interaction+Dynamics+in+the+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Decade of Imaging Cellular Motility and Interaction Dynamics in the Immune System.</a> Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).</li>
<li>Coombes, J. L., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+host-pathogen+interactions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo.</a> Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).</li>
<li>Pulendran, B., Maddur, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+Immune+Sensing+and+Response+to+Influenza%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Journal%22%5BJournal%5D)">Innate Immune Sensing and Response to Influenza.</a> Life Science Journal. 6 (4), 23-71 (2014).</li>
<li>Lim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+trails+guide+influenza-+specific+CD8+%2B+T+cells+in+the+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil trails guide influenza- specific CD8 + T cells in the airways.</a> Science. 349 (6252), (2015).</li>
<li>Kim, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+tracheal+epithelial+cells+in+mice+during+airway+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration.</a> American journal of respiratory cell and molecular biology. 47 (6), 864-868 (2012).</li>
<li>Kretschmer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescence+multiphoton+microscopy+for+visualization+of+tissue+morphology+and+cellular+dynamics+in+murine+and+human+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+investigation%3B+a+journal+of+technical+methods+and+pathology%22%5BJournal%5D)">Autofluorescence multiphoton microscopy for visualization of tissue morphology and cellular dynamics in murine and human airways.</a> Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 96 (8), 918-931 (2016).</li>
<li>Veres, T. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intubation-free+in+vivo+imaging+of+the+tracheal+mucosa+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Intubation-free in vivo imaging of the tracheal mucosa using two-photon microscopy.</a> Scientific Reports. 7 (1), 694(2017).</li>
<li>Looney, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilized+imaging+of+immune+surveillance+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung.</a> Nature. 8 (1), 91-96 (2011).</li>
<li>Thornton, E. E., Krummel, M. F., Looney, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+the+Lung%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of the Lung.</a> Current Protocols in Cytometry. 60 (1), (2012).</li>
<li>Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+of+the+murine+pulmonary+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation.</a> Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).</li>
<li>Fiole, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+intravital+imaging+of+lungs+during+anthrax+infection+reveals+long-lasting+macrophage-dendritic+cell+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts.</a> Infection and immunity. 82 (2), 864-872 (2014).</li>
<li>Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+in+historic+and+contemporary+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy in historic and contemporary immunology.</a> Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).</li>
<li>Lambrecht, B. N., Hammad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+Dendritic+Cells+in+Respiratory+Viral+Infection+and+Asthma%3A+From+Protection+to+Immunopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lung Dendritic Cells in Respiratory Viral Infection and Asthma: From Protection to Immunopathology.</a> Annual Review of Immunology. 30 (1), 243-270 (2012).</li>
<li>Camp, J. V., Jonsson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+neutrophils+in+viral+respiratory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">A role for neutrophils in viral respiratory disease.</a> Frontiers in Immunology. 8, (2017).</li>
<li>van Gisbergen, K. P. J. M., Sanchez-Hernandez, M., Geijtenbeek, T. B. H., van Kooyk, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+mediate+immune+modulation+of+dendritic+cells+through+glycosylation-dependent+interactions+between+Mac-1+and+DC-SIGN%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Neutrophils mediate immune modulation of dendritic cells through glycosylation-dependent interactions between Mac-1 and DC-SIGN.</a> The Journal of experimental medicine. 201 (8), 1281-1292 (2005).</li>
<li>Gonzalez, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture+of+influenza+by+medullary+dendritic+cells+via+SIGN-R1+is+essential+for+humoral+immunity+in+draining+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Capture of influenza by medullary dendritic cells via SIGN-R1 is essential for humoral immunity in draining lymph nodes.</a> Nature Immunology. 11 (5), 427-434 (2010).</li>
<li>Lindquist, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+dendritic+cell+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Visualizing dendritic cell networks in vivo.</a> Nature immunology. 5 (12), 1243-1250 (2004).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+V%CE%B39V%CE%B42-T+cells+efficiently+kill+influenza+virus-infected+lung+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human Vγ9Vδ2-T cells efficiently kill influenza virus-infected lung alveolar epithelial cells.</a> Cellular and Molecular Immunology. 10 (2), 159-164 (2013).</li>
<li>Tran Cao, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+transgenic+cyan+fluorescent+protein+%28CFP%29-expressing+nude+mouse+for+%26%2334%3Btechnicolor%26%2334%3B+cancer+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Development of the transgenic cyan fluorescent protein (CFP)-expressing nude mouse for &#34;technicolor&#34; cancer imaging.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 107 (2), 328-334 (2009).</li>
<li>Jaber, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose+regimens%2C+variability%2C+and+complications+associated+with+using+repeat-bolus+dosing+to+extend+a+surgical+plane+of+anesthesia+in+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science+JAALAS%22%5BJournal%5D)">Dose regimens, variability, and complications associated with using repeat-bolus dosing to extend a surgical plane of anesthesia in laboratory mice.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 53 (6), 684-691 (2014).</li>
<li>Pizzagalli, D. U., et al. Leukocyte Tracking Database, a collection of immune cell tracks from intravital 2-photon microscopy videos. Scientific Data. , In press (2018).</li>
<li>Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. <a target="_blank" href="https://ieeexplore.ieee.org/document/5872394/">Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit.</a> 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 230-233 (2011).</li>
<li>Beltman, J. B., Marée, A. F. M., De Boer, R. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19834485">Analysing immune cell migration.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (11), 789-798 (2009).</li>
<li>Keller, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motility%2C+cell+shape%2C+and+locomotion+of+neutrophil+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+motility%22%5BJournal%5D)">Motility, cell shape, and locomotion of neutrophil granulocytes.</a> Cell motility. 3 (1), 47-60 (1983).</li>
<li>Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15357943">Intravital Microscopy.</a> Immunity. 21 (3), 315-329 (2004).</li>
<li>Lambert Emo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Influenza+Infection+of+the+Trachea+Reveals+Dynamic+Regulation+of+CD8%2B+T+Cell+Motility+by+Antigen%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Influenza Infection of the Trachea Reveals Dynamic Regulation of CD8+ T Cell Motility by Antigen.</a> PLOS Pathogens. 12 (9), e1005881(2016).</li>
<li>Kjos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright+fluorescent+Streptococcus+pneumoniae+for+live-cell+imaging+of+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bacteriology%22%5BJournal%5D)">Bright fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions.</a> Journal of bacteriology. 197 (5), 807-818 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit werk presenteert een gedetailleerd protocol voor de generatie van 4D beelden tonen van de migratie van adoptively overgedragen neutrofielen en hun interacties met DC tijdens een besmetting van de griep in de luchtpijp van de muis. De beschreven 2P-GODT-model zullen relevant zijn voor de studie van immuun cel dynamiek tijdens een infectie in de luchtwegen.
Verschillende modellen gebaseerd op de visualisatie van de dynamiek van de cel in de luchtwegen hebben onlangs ontwikkelde<sup class="xr...

Twee-foton intravital microscopie (2P-GODT) is een effectieve techniek voor real-time imaging van cel naar cel interacties zoals die in hun natuurlijke omgeving1plaatsvinden. Een van de belangrijkste voordelen van deze methode is dat het mogelijk de studie van cellulaire processen op een groter model diepte (500 µm tot 1 mm maakt) in vergelijking met andere traditionele beeldvormende technieken2. Op hetzelfde moment minimaliseert het gebruik van twee lage-energie fotonen gegenereerd door de twee-foton laser de foto-weefselschade meestal gekoppeld aan de afbeelding acquisitie proces2. Tijdens het laatste decennium is 2P-GODT toegepast om te bestuderen van de verschillende types van cel-cel-interacties in de verschillende disciplines-3,-4,5. Deze studies zijn met name relevant zijn voor het onderzoeken van immune cellen, die worden gekenmerkt door hun hoge dynamiek en de vorming van prominente contacten na de signalen gegenereerd door andere cellen en het milieu. 2P-GODT is ook toegepast om te bestuderen van de interacties tussen pathogene en host6. Inderdaad, het is eerder aangetoond dat sommige ziekteverwekkers veranderen als kunnen het type en de duur van de contacten tussen immune cellen, belemmeren, dientengevolge, de immuunrespons7.
De mucosa van de luchtwegen is de eerste site die de immuunrespons tegen lucht ziekteverwekkers zich gegenereerd8. Daarom, in vivo analyse van pathogene agens-gastheer interacties in dit weefsel is kritiek te begrijpen van de inleiding van de afweermechanismen van de host tijdens de infectie. 2P-GODT van de luchtwegen is echter uitdagende voornamelijk te wijten aan de artefacten geproduceerd door de ademhaling cyclus van het dier, dat het proces van Beeldacquisitie compromissen. Onlangs, verschillende chirurgische modellen zijn beschreven voor imaging lymfkliertest luchtpijp9,10,11,12 en longen13,14,15, 16. De tracheale 2P-GODT modellen vertegenwoordigen een uitstekende set-up om te visualiseren van de beginfase van de immune reactie in de bovenste luchtwegen, terwijl de Long-longblaasjes 2P-GODT modellen zijn meer geschikt voor het bestuderen van de late fase van infecties. De ontwikkelde longen modellen presenteren een beperking die zijn gekoppeld aan de aanwezigheid van lucht gevulde longblaasjes, waardoor de optische penetratie van de laser worden beperkt en maak de mucosal laag van de intrapulmonary airways ontoegankelijk voor in vivo imaging17 . De structuur van de luchtpijp, gevormd door een continue epitheel, vergemakkelijkt daarentegen Beeldacquisitie.
Hier presenteren we een protocol dat een gedetailleerde beschrijving van de stappen die nodig zijn bevat voor het uitvoeren van de besmetting van de griep, chirurgische voorbereiding van de dieren, en 2P-GODT van de luchtpijp. Daarnaast beschrijven we een specifieke experimentele opstelling voor de visualisatie van neutrofielen en dendritische cellen (DC), twee soorten van immuun cellen die een belangrijke rol als bemiddelaars van het afweermechanisme tegen influenza virus18,19 spelen . Ten slotte, beschrijven we een procedure voor het analyseren van neutrofiele-DC interacties. Deze contacten is gebleken moduleren DC activering en vervolgens bij de immuunrespons tegen ziekteverwekkers20.

<table><tbody><tr><td>Gigasept instru AF</td><td>Sch&uuml;lke &amp; Mayr GmbH</td><td></td><td>4% solution</td></tr><tr><td>CD11c-YFP mice</td><td>Jackson Laboratories</td><td>008829</td><td>muizen werden in eigen beheer gefokt</td></tr><tr><td>CK6-ECFP mice</td><td>Jackson Laboratories</td><td>004218</td><td>muizen werden in eigen beheer gefokt</td></tr><tr><td>1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline gemodificeerd zonder Calcium Chloride en Magnesium Chloride</td><td>Sigma</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>10x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline gemodificeerd zonder Calcium Chloride en Magnesium Chloride</td><td>Sigma</td><td>D1408-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Percoll PLUS</td><td>Sigma</td><td>E0414-1L</td><td>Bewaar bij 4&deg;C</td></tr><tr><td>Ketamin Labatec</td><td>Labatec Pharma</td><td>7680632310024</td><td>Bewaar bij RT, bewaar bij 4 &deg;C wanneer in oplossing van ket/xyl mengsel</td></tr><tr><td>Rompun 2% (Xylazin)</td><td>Bayer</td><td>6293841.00.00</td><td>Bewaar bij RT, bewaar bij 4 &deg;C wanneer in oplossing van ket/xyl mengsel</td></tr><tr><td>26 G 1 mL Sub-Q BD Plastipak</td><td>BD Plastipak</td><td>305501</td><td></td></tr><tr><td>30 G, 0.3 mL BD Micro-Fine Insulin Spuitjes</td><td>BD</td><td>324826</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 40 &micro;m Cell Strainer</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Spuitjes</td><td>BD Plastipak</td><td>300185</td><td></td></tr><tr><td>Microlance 3x 18 G naalden</td><td>BD</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>Introcan Safety 20 G (katheter)</td><td>Braun</td><td>4251652.01</td><td></td></tr><tr><td>6 Well Cell Culture Cluster</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium 1640 + HEPES (1x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>42401-018</td><td>Bewaar bij 4&deg;C</td></tr><tr><td>Liberase TL Research Grade</td><td>Roche</td><td>5401020001</td><td>Bewaar bij -20 &deg;C / collagenase (I en II) mengsel</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Amresco (VWR)</td><td>0649-50KU</td><td>Bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>CellTrace Violet kleurstof</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C34557</td><td>Bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>Bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>PE-10 Micro Medical Tubing</td><td>2Biological Instruments SNC</td><td>#BB31695-PE/1</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Plastic Tape</td><td>M Plast</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Viscotears</td><td>Bausch &amp; Lomb</td><td></td><td>Bewaar bij RT</td></tr><tr><td>Plasticine</td><td>Ohropax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>High Tolerance Glass Coverslip 15 mm Round</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0733</td><td></td></tr><tr><td>SomnoSuite Draagbaar Dier Anesthesie Systeem</td><td>Kent Scientific</td><td>SS-01</td><td></td></tr><tr><td>Nuvo Lite mark 5</td><td>GCE medline</td><td>14111211</td><td></td></tr><tr><td>MiniTag (gasvormige anesthesie en verwarmingsbank)</td><td>Tem Sega</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SURGICAL BOARD</td><td>University of Bern</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrimScope II Twee-foton microscoop</td><td>LaVision Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Vision Ti:Sa lasers</td><td>Coherent Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25X NA 1.05 water immersie objectief</td><td>Olympus</td><td>XLPLN25XWMP2</td><td></td></tr><tr><td>The Cube&amp;The Box incubatiekamer en temperatuurregelaar</td><td>Life imaging Services</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 9.1.0</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Imaging software</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 7</td><td>GraphPad</td><td></td><td>Statistische software</td></tr></tbody></table>

imaging-cel interactie in tracheale mucosa tijdens influenza virusinfectie met behulp van twee-foton intravital microscopie

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

De analyse van de cel of cel-ziekteverwekker interactie in vivo is een belangrijk instrument om te begrijpen de dynamiek van de immune reactie op de infectie. Twee-foton intravital microscopie (2P-GODT) kan de waarneming van cel interacties in diepe weefsel in levende dieren, terwijl het minimaliseren van de photobleaching gegenereerd tijdens Beeldacquisitie. Tot op heden zijn verschillende modellen voor 2P-GODT van lymfoïde en niet-lymfoïde organen beschreven. Beeldvorming van de ademhalingsorganen blijft echter een uitdaging als gevolg van de beweging die is gekoppeld aan de ademhaling cyclus van het dier.
Hier beschrijven we een protocol om te visualiseren in vivo immuun cel interacties in de luchtpijp van muizen geïnfecteerd met influenza-virus met behulp van 2 P-GODT. Hiervoor ontwikkelden we een aangepaste imaging platform, waaronder de chirurgische blootstelling en intubatie van de luchtpijp, gevolgd door de overname van dynamische beelden van neutrofielen en dendritische cellen (DC) in de mucosal epitheel. Bovendien, gedetailleerde we de stappen die nodig zijn voor het uitvoeren van influenza intranasale infectie en stroom cytometrische analyse van immuuncellen in de luchtpijp. Ten slotte, geanalyseerd wij neutrofiele en beweeglijkheid van de DC, evenals hun interacties in de loop van een film. Dit protocol zorgt voor de generatie van stabiel en helder 4D beelden nodig zijn voor de beoordeling van cel-cel-interacties in de luchtpijp.

In dit werk beschreven we een gedetailleerd protocol om te studeren in vivo de beweeglijkheid en de interacties tussen neutrofielen en DC tijdens de besmetting van de griep in lymfkliertest luchtpijp (figuur 3A). Voor dit doel, we geïsoleerd GVB+ neutrofiele granulocyten (92% zuiverheid; Figuur 3B) vanaf CK6-ECFP overgedragen muizen en we adoptively hen in een CD11c-YFP-muis geïnfecteerd met influenza. Na dat ...

In deze studie presenteren we een protocol voor het uitvoeren van twee-foton intravital beeldvorming en cel interactie analyse in de lymfkliertest tracheale mucosa na infectie met influenzavirus. Dit protocol is relevant voor onderzoekers bestuderen immuun cel dynamiek tijdens infecties van de luchtwegen.

Imaging-cel interactie in tracheale Mucosa tijdens Influenza virusinfectie met behulp van twee-foton Intravital microscopie

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de studie van immuunreacties op luchtdruppeltjes over de dynamiek van interacties van immuuncellen tijdens luchtweginfecties. Het grootste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om heldere en stabiele 4D-beelden van het tracheale epitheel te verkrijgen gedurende de eenvoudige operatie. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de interacties tussen neutrofielen en lytische cellen tijdens influenza-infectie, kan het ook worden toegepast op de studie van verschillende immuuncellen of luchtdruppeltjes.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen met het onderhouden van een stabiele en minimaal ontstoken operatie. Bovendien kan beeldanalyse lastig zijn vanwege de aanwezigheid van hartafwijkingen. Voor intranasale influenza-infectie, plaats een verdoofde CD11c-YFP muis van zes tot acht weken in de rugligging en bevestig diepe sedatie door gebrek aan reactie op een teenprik.Plaats de pipet dicht bij de linker neusgat, verdeel kleine druppels in de neusholte ongeveer 20 seconden uit elkaar, totdat de muis het volledige volume van 15 microliter PR8-inoculaat heeft ingeademd. Lever na twee tot vijf minuten 15 microliter virus in de rechter neusholte op dezelfde manier. Wanneer het hele inoculum is toegediend, bevestig dat de muis normaal ademt en plaats het dier in zijn kooi in laterale decubitus met monitoring tot volledige herstel.Drie dagen na infectie, verwijder beide femura en tibiae uit een transgenische CFP-uitdrukkende muis en maak de botten voorzichtig schoon met een pincet. Snijd de botepiphysis en gebruik een spuit van één milliliter uitgerust met een 26 gauge naald om het beenmerg uit elk bot te spoelen met steriel koud PBS in een 50-milliliter buisje op ijs. Wanneer al het beenmerg is geoogst, zuig het merg meerdere keren door de naaldtip en filter de gedissocieerde celsuspensie door een 40-micrometer zeef.Verzamel de cellen door centrifugatie en suspendeer het pellet in twee milliliter koud PBS. Leg vervolgens voorzichtig twee milliliter van elk van de drie Percoll-gradienten in een buisje van 15 milliliter van meest naar minst geconcentreerd. Voeg vervolgens voorzichtig twee milliliter beenmergcelluspensie toe aan de bovenste gradientlaag voor centrifugale dichtheidsgradiëntscheiding.Aan het einde van de centrifugatie, verwijder voorzichtig de band van de 64 en 72% gradient interface en was de neutrofielen in koud PBS. Hersuspendeer vervolgens het pellet in 100 microliter verse PBS op ijs voor telling, en hersuspendeer de cellen in een concentratie van vijf keer 10 tot de zesde cellen per 100 microliter PBS voor intraveneuze injectie in de geïnoculeerde CD11c-YFP-ontvangende dieren. 12 uur na adoptieve overdracht, plaats het verdoofde ontvangende dier op een aangepaste chirurgische plank boven een verwarmd oppervlak van 37 graden Celsius en verwijder het haar van de nek van de muis door scheren en een ontharingscreme.Plaats de muis boven de plastic muispositionering met de kop buiten de positionering in een hoek die intubatie van de trachea vergemakkelijkt, en zet de voorpoten, poten en de staart vast met chirurgisch plakband. Breng zalf aan op de ogen en desinfecteer de blootgestelde huid. Maak vervolgens een snede van één centimeter langs de mediale as van de nek tussen de bovenste borst en de lijn die door het onderste punt van de kaak loopt, en verplaats de huidlapjes en de speekselklieren lateraal om de trachea te visualiseren.Gebruik een pincet om voorzichtig de trachea te dissecteren, intubeer de muis met een katheter en begin onmiddellijk met kunstmatige ventilatie. Gebruik een chirurgische haak verbonden met een staaf op de chirurgische plank om de katheterhoogte en -oriëntatie te fixeren en leg de trachea bloot tot aan de kin. Omcirkel de trachea met petroleumgelei en hydrateer de trachea met een paar druppels warm PBS.Lijm vervolgens een dekglas op een metalen houder en schroef de houder aan de XYZ-vertaler om het dekglas bovenop de chirurgische voorbereiding te kunnen plaatsen. Het is erg belangrijk om de trachea goed te blootleggen en uit te rekken, en deze lichtjes te drukken met het dekglas, om het weefsel lang genoeg stabiel te houden voor de beeldvorming. Voor time-lapse beeldvorming in vivo, plaats de chirurgische plank in de 37 graden Celsius incubatiekamer van de twee-foton-microscoop en voeg een druppel water toe aan het dekglas.Nadat de opstelling is gecentreerd en op het tracheale weefsel is gericht, stel de scanfrequentie in op 800 hertz met 520 bij 520 pixels, een gezichtsveld van 440 bij 440 micrometer en een lijngemiddelde van één. Stel de titanium-saffierlasers in op de juiste golflengte en vermogenspercentage volgens de excitatie fluoroforen en stel de 3D- en time-lapse aanwinstmodus in met gelijktijdige excitatie. Definieer vervolgens een bereik van 50 micrometer langs de z-as met een stappengrootte van drie micrometer en neem elke 30 seconden afbeeldingen op gedurende 30 minuten.Volgens deze experimentele opstelling kunnen stabiele 4D-beelden worden vastgelegd in situ binnen de geïnfecteerde trachea gedurende een trackingperiode van 30 minuten. Analyse van de 4D-beelden onthult significante verschillen tussen dendritische cel en gerekruteerd neutrofiel beweging met een significant snellere snelheid gedemonstreerd door de laatste. De complexe morfologie van de dendritische cellen veroorzaakt frequente fouten in celtracking, wat op zijn beurt banen met een verminderde duur en een verhoogde variantie in het gemeten directionele gedrag produceert.Daarom werd een robuuste metriek gecreëerd voor het meten van de directioneelheid door de duur van de baan te beschouwen, waardoor een significant verschil in de directioneelheid van neutrofielen in vergelijking met dendritische cellen werd onthuld. Bovendien maakt berekening van de afstand tussen de neutrofielen en de dendritische cellen de detectie en analyse van hun contacten in de tijd mogelijk, met sommige neutrofielen in dit representatieve experiment meerdere korte contacten met dendritische cellen te vormen en sommige geen contact met dendritische cellen te vormen tijdens de beeldvormingsperiode. Bovendien vergemakkelijkt de studie van de gemiddelde trend van de a

imaging-cell-interaction-tracheal-mucosa-during-influenza-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een gelijktijdige infectie met influenza A-virus is een van de factoren betrokken bij de inductie van invasieve pneumokokkeninfecties bij...

Met behulp van Bioluminescent Imaging naar Synergie Onderzoek Between Streptococcus pneumoniae En influenza A-virus bij jonge muizen

We laten zien, hoe twee-foton microscopie gebruikt voor de observatie van de dynamiek van neutrofiele granulocyten in de longen besmet terwijl ze fagocyteren pathogenen of produceren neutrofielen extracellulaire vallen (NET).

Directe observatie van fagocytose en de NET-vorming door neutrofielen in Infected longen met behulp van twee-foton microscopie

We hebben nieuwe laboratorium instrumenten en protocollen voor intravitale imaging verkrijging van thymus. Onze techniek zou moeten helpen bij de identificatie van 'niches' in de thymus, waar T-cel ontwikkeling optreedt.

Intravitale Beeldvorming van de Muis Thymus met behulp van 2-Photon Microscopy

Source: Wang, M., et al, Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates intranasal infection of a mouse with a pathogenic influenza virus to establish a respiratory tract infection. The procedure outlines the administration of the virus into the nasal cavity. The virus enters host cells, replicates, and activates the immune system.

Intranasal Infection of a Mouse with a Pathogenic Influenza Virus

Systemische en lokale infectiemodellen met zebravissen voor humaan influenza A-virus worden gedemonstreerd. Met behulp van een systemisch infectiemodel kunnen zebravissen worden gebruikt om antivirale geneesmiddelen te screenen. Met behulp van een lokaal infectiemodel kunnen zebravissen worden gebruikt om reacties van gastheer immuuncellen te karakteriseren.

Met behulp van zebravis modellen van menselijke influenza A-virus infecties op Bleken antivirale middelen en karakteriseren Host Immune Cell Responses

De hier ingevoerde protocol kunnen karakterisering van de homing longcapaciteit van primaire menselijke lymfocyten in vivo inflammatoire voorwaarden. Pulmonaire infiltratie van adoptively overgedragen menselijke immune cellen in een muismodel van allergische ontsteking kan worden beeld en gekwantificeerd door licht vel fluorescentie microscopie van chemisch gewiste longweefsel.

Geavanceerde Imaging van longkanker Homing menselijke lymfocyten in een experimenteel In Vivo Model van allergische ontsteking op basis van licht vel microscopie

We beschrijven een methode om GFP-gelabeld γδ IELs met behulp van intravital Imaging van muizen dunne darm te visualiseren door omgekeerde spinnen schijf confocale microscopie. Deze techniek maakt het bijhouden van levende cellen in het slijmvlies voor maximaal 4 uur en kan worden gebruikt om een verscheidenheid van intestinale immuun-epitheel interacties te onderzoeken.

Intravital beeldvorming van epitheliale lymfocyten in muizen dunne darm

Intravitale fluorescentiemicroscopie kan worden gebruikt om leukocyten-endotheelinteracties en capillaire perfusie in realtime te bestuderen. Dit protocol beschrijft methoden om deze parameters in de pulmonale microcirculatie in beeld te brengen en te kwantificeren met behulp van een vacuümgestabiliseerd longbeeldvormingssysteem.

Intravitale widefield fluorescentiemicroscopie van pulmonale microcirculatie bij experimenteel acuut longletsel met behulp van een vacuümgestabiliseerd beeldvormingssysteem

Hier presenteren we een protocol om de getransplanteerde linkerlong van de muis intravitaal in beeld te brengen met behulp van twee-fotonmicroscopie. Dit is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van cellulaire dynamiek en interacties in real-time na longtransplantatie bij muizen.

Intravitale twee-fotonmicroscopie van de getransplanteerde muizenlong

Dit protocol geeft instructies voor intranasale toediening van IAV en downstream-analyse van longbeschadiging bij muizen en bijbehorende transcriptionele veranderingen in longceltypen.

Modellering van dysplastisch en functioneel longalveolair herstel na griepinfectie

Hier presenteren we een protocol voor intravitale beeldvorming van een verzwakte, door BSL-2 goedgekeurde Mycobacterium tuberculosis. Spanning in de muislong met behulp van een permanent longvenster. Deze benadering maakt longitudinale, enkelcelresolutie-analyse mogelijk van vroege interacties tussen gastheer en pathogeen, waaronder bacillaire lokalisatie, vasculaire dynamiek en opname van macrofagen binnen dezelfde longmicroomgeving.

Intravitale beeldvorming van verzwakte auxotrofe mycobacterium tuberculosis in muislong tijdens vroege intravasculaire infectie

Leer twee-foton intravital microscopie voor immuunceldynamiek in de tracheale mucosa van muizen tijdens influenza-infectie. Deze methode maakt real-time analyse van neutrofielen en dendritische cellen mogelijk.

Imaging-cel interactie in tracheale Mucosa tijdens Influenza virusinfectie met behulp van twee-foton Intravital microscopie

Meer video's verkennen