Name: Noninvasive controle van de grootte van de laesie in een heteroloog muismodel van endometriose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Leer een niet-invasieve methode voor het in real-time beoordelen van therapeutische geneesmiddelen op endometriose-letsels met behulp van fluorescerende beeldvorming in een muismodel. Deze techniek maakt dynamische monitoring van letselgrootte mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door het Spaanse ministerie van economie en het concurrentievermogen door de Miguel Servet programma [CP13/00077] samen door het EFRO (Europees Fonds voor regionale ontwikkeling) en toegekend aan Dr. R. Gómez alsmede door Carlos III Institute of Health toegekende subsidies Dr. R Gómez [PI14/00547 en PI17/02329] en Prof A. Cano [PI12/02582].

Het gebruik van menselijk weefsel specimens is goedgekeurd door de institutionele Review Board en de ethische commissie van het Hospital Universitario La Fe. Alle patiënten verstrekte schriftelijke geïnformeerde toestemming. De studie waarbij dieren werd goedgekeurd door de Commissie van de institutionele dier zorg bij het Centro de Investigacion Principe Felipe de Valencia, en alle procedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van zoogdieren van de nationale instituten van de gezondheid.
1. baarmoederslijmvlies weefsel collectie en voorbehandeling
<ol><li>Het verkrijgen van een biopsie van de goede kwaliteit van menselijke baarmoederslijmvlies aspirate met behulp van een canule verbonden aan een zuig-apparaat. Giet de biopsie in een kolf met 10 mL steriele zoutoplossing en wassen met zacht handmatige agitatie. Opmerking: Procedures voor het verkrijgen van goede kwaliteit biopsieën geweest eerder beschreven17.</li>
	<li>Wassen van de biopsie van eventuele resterende bloed of slijm. Herhaal dit proces door het gieten van het weefsel te kolven met verse saline zoveel tanden zoals vereist tot weefsel wordt waargenomen schoon.</li>
	<li>Overdracht biopsie fragmenten met een gezonde uitstraling in een oplossing met 10 mL voltooien Dulbecco van bewerkt Eagle's medium (DMEM) medium met 10% foetale boviene Serum (FBS) en 1% antibioticum-antimycotic oplossing.</li>
	<li>Giet de inhoud in een 10 cm petrischaal en overgaan tot de hak van het weefsel in 5-10 mm3 stuks met een paar scalpels.</li>
</ol>2. adenovirale transfectie van baarmoederslijmvlies fragmenten
Opmerking: Alle materialen die worden gebruikt in het proces zullen moeten worden ingevoerd in de kap van tevoren. Haal alles wat niet gaat worden gebruikt in het proces en plaats een kolf met bleekmiddel. Alle materialen die in aanraking met de adenovirale vector komt moet worden ontsmet met het bleekmiddel voordat het in de container biohazard teruggooi.
<ol><li>Zodra de biopsie heeft zijn gehakt, nemen een nieuwe petrischaal. Pipetteer meerdere 30 – 50 µL DMEM druppels verspreid gedurende de hele schotel. Laat genoeg ruimte tussen druppels zodat ze niet in contact komen.</li>
	<li>Geholpen met een naald die is aangesloten op de spuit, plaatst u een enkel stuk van fragment binnen elk van de middelgrote druppels. Opmerking: Elke daling moet bevatten een enkel stuk van baarmoederslijmvlies.</li>
	<li>Bereiden de werkoplossing Ad-mCherry door verder verdunnen 1:20 voor de mCherry adenovirale stockoplossing [1 x 1010 pfu/mL]) in DMEM medium zonder antibiotica (DMEM + 10% gefilterd FBS).</li>
	<li>Afzien van 100-200 μl van de Ad-mCherry oplossing per putje op een 96-wells-plaat, vullen zoveel wells als fragmenten beschikbaar in de petrischaal druppels (stap 2.2 zijn). Daarnaast Vul minstens 3 putten met adenovirus gratis DMEM medium als een negatieve controle.</li>
	<li>Elk van de fragmenten in de petrischaal (stap 2.2) aan elk van de putjes met ad-mCherry oplossing in de 96-wells-plaat geholpen met een naald die is aangesloten op de spuit, overdragen.</li>
	<li>Plaats de 96 goed-plaat met het baarmoederslijmvlies fragmenten met Ad-mCherry oplossing in een incubator bij 37 ° C met 5% CO2 voor 16 h.</li>
	<li>Wassen uit de resterende adenovirussen in het medium door de overdracht van weefsels in een nieuwe 96-wells-plaat gevuld met volledige DMEM medium (met antibiotica-antimycotica, gratis adenovirus) en incubeer gedurende de 37 ° C met 5% CO2 voor 24-48 h. Opmerking: Vergeet niet om alle goed platen en tips die kwam in contact met Ad-virus voordat de teruggooi in de biohazard container met bleekmiddel te bestrijken.</li>
	<li>Neem uit de plaat uit de incubator en plaats het onder een fluorescentie Microscoop op 568 nm (rode kanaal) om te testen voor optimale labeling.</li>
	<li>Kies de meest briljante fragmenten en plaats hen in een nieuwe 96-wells-plaat met verse volledige DMEM medium (met antibiotica-antimycotica, gratis adenovirus).</li>
	<li>Afdichting van de plaat goed met een kunststof paraffine-film en het vervoer aan in de dierlijke specifieke-pathogenen vrije gebied van implantatie van baarmoederslijmvlies fragmenten in ontvangende dieren.</li>
</ol>3. generatie van de muismodel van endometriose
Opmerking: Gebruik 6 – 8 week-oude athymic naakt (of soortgelijke immuungecompromitteerde stammen) vrouwelijke muizen gehuisvest in specifieke pathogen-gratis voorwaarden, als ontvanger van de dieren. Om te voorkomen dat de hormonale cyclus-afhankelijke variaties en tegelijkertijd de groei van de laesie van de brandstof met estradiol, zijn dieren ovariectomized en geplaatste met 60 dagen vrijlating capsules met 18 mg van 17 βeta-Estradiol (17β-E2). Oöforectomie en pellet plaatsing moet ten minste één week vóór het enten van baarmoederslijmvlies fragmenten in de ontvangende dieren worden uitgevoerd.
<ol><li>
Oöforectomie Opmerking: Bereiden chirurgische gesteriliseerd materiaal in een capuchon. Anesthesie-apparatuur en een zone na chirurgisch herstel, dat klaar is in dezelfde kamer voorbereiden.<ol>
<li>Een subcutane injectie van Morfine afgeleide bij een dosis van 5 mg/kg per muis uitvoeren. Laat de muizen rusten voor 30 min na injectie dus als pijnstillers effecten van geneesmiddel kunnen worden geopenbaard.</li>
		<li>Steek de inademing verdoving apparatuur en laat zuurstof en Isofluraan (2% mg/kg) stroom gedurende een paar minuten in een verzegelde anesthesie-kamer.</li>
		<li>Het dier in de kamer van de verdoving Isofluraan introduceren. 3-5 min wachten en controleren dat de dieren zijn volledig verdoofd door op één van de poten. Het dier overbrengen in het gebied van chirurgie en anesthesie te handhaven door het plaatsen van een masker met continue stroom van Isofluraan gas die betrekking hebben op de ademhaling luchtwegen.</li>
		<li>Voer na het ontsmetten van het gebied met chlorohexidine, een dwarse 0.5 cm ribben incisie ongeveer op de hoogte van de heup met een scherpe schaar.</li>
		<li>De huid van de spier toegang krijgen tot de buikholte, identificeren van de witte vet pad rond het ovarium en intrekken van de eierstok met een dissectie Tang scheiden.</li>
		<li>Leg een knoopje rond het oviduct met absorbeerbare hechtdraad en draai zodat passende hemostase alvorens de eierstok middendoor.</li>
		<li>Sluit de gespierde laag met 6-0 absorbeerbare hechtdraad, en sluit vervolgens de huid met 6-0 niet-absorbeerbare hechtdraad. Reinig het gebied weer met antiseptische oplossing.</li>
		<li>Herhaal de procedure voor het verwijderen van de contra-laterale eierstok.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Estradiol pellet implantaat Opmerking: Zorg dat het dier wordt verdoofd tijdens de operatie oöforectomie te plaatsen van pellets op dat moment.<ol>
<li>Onmiddellijk na de voltooiing van de procedure oöforectomie, reinig de huid met een antiseptische oplossing rond de nek en maak een incisie dwarse subcutane klein (0,5 cm) met een scherpe schaar in de nek.</li>
		<li>Gebruik de schaar te ontleden de huid van de spier, maken een zak groot genoeg om te laten plaatsen van de pellets.</li>
		<li>Invoegen van de pellet met 18 mg 17β-E2 en suture van de huid met een 6-0 niet-absorbeerbare hechtdraad. Reinig het gebied weer met antiseptische oplossing.</li>
		<li>Plaats het dier in de zone van herstel en beheren van een optimale dosis van langdurige analgesie te vergemakkelijken van de herstelperiode.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Baarmoederslijmvlies implantaatchirurgie Opmerking: Toestaan ten minste een periode van zeven dagen quarantaine teneinde volledig herstel van dieren na oöforectomie voordat baarmoederslijmvlies fragment implantatie chirurgie. Voor optimale synchronisatie met etikettering van weefsel, verzamelen de biopsie 2 tot 3 dagen vóór de implantatie chirurgie teneinde langetermijnkweek van explantaten.<ol>
<li>Krijgen de chirurgische kamer in de zone van specifieke pathogenen vrije tevoren klaar. De kap met alle vereiste chirurgisch materiaal, de apparatuur van de anesthesie en de zone na chirurgisch herstel ook bereiden.</li>
		<li>De dieren naar de kamer brengen, uitvoeren van een subcutane injectie van een morfine-afgeleide bij een dosis van 5 (mg/kg) in elke muis. Laat de muizen rusten voor 30 min na het inspuiten zodat analgetica effecten van geneesmiddel kunnen worden geopenbaard.</li>
		<li>Steek de inademing verdoving apparatuur en laat zuurstof en Isofluraan (2% mg/kg) stroom gedurende een paar minuten in een verzegelde anesthesie-kamer.</li>
		<li>Voordat u begint chirurgie, door de plaat met fluorescently fragmenten (uit stap 2.10) aangeduid in de kap, verzegelde het en giet de fragmenten in een petrischaal voor gemakkelijker behandeling te verplaatsen.</li>
		<li>Het dier in de kamer van de verdoving Isofluraan introduceren. 3-5 min wachten en controleren dat de dieren zijn volledig verdoofd door op één van de poten. Het dier overbrengen in het gebied van chirurgie en anesthesie te handhaven door het plaatsen van een masker met continue stroom van Isofluraan gas die betrekking hebben op de ademhaling luchtwegen.</li>
		<li>Plaats het narcose dier onder ogen zien. Desinfecteer het ventrale gebied. Het uitvoeren van een incisie longitudinale 1,5 cm in buik met een scherpe schaar en scheiden van de huid van de spier. Voer vervolgens een incisie longitudinale 1.5 cm in de spier voor toegang tot de peritoneale holte.</li>
		<li>Houd de linker rand van de gespierde wand van de buik met mini pincet en vouw het proberen om de binnenzijde van het buikvlies aan de buitenkant bloot te stellen.</li>
		<li>Neem een endometrium implantaat met mini pincet, weken kort in een n-butyl-ester Cyanoacrylaat lijm en plaats het aan het buikvlies waar het zal krijgen gehecht. Laat het drogen voor een paar seconden. Herhaal stap 3.3.6 en 3.3.7 te plaatsen van een implantaat aan de contralaterale zijde van het buikvlies.</li>
		<li>Sluit de gespierde laag met een hechtdraad absorbeerbare 6-0, en sluit vervolgens de huid met een niet-absorbeerbare 6-0 hechtdraad. Reinig het gebied weer met antiseptische oplossing.</li>
		<li>Plaats het dier in de herstel-zone en een optimale dosis van langdurige analgesie beheren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. in Vivo fluorescerende beeldbewerking met een In Vivo Imaging systeem
<ol><li>Zet op de in vivo imaging systeem apparaat, het programma initialiseren en laat de CCD-camera om af te koelen gedurende een paar minuten.</li>
	<li>Bereiden de inhalatieapparatuur anesthesie. Open de Isofluraan stroming 2% voor een paar min te vullen de verdoving kamer. De zone na verdoving herstel voor te bereiden.</li>
	<li>Zodra het programma is gestart en de CCD-camera zijn afgekoeld, klikt u op de Wizard Imaging tool: een tutorial begint met een reeks van opeenvolgende windows weergegeven, elk een overeenkomt met een parameter van belang met een aantal opties beschikbaar om te worden gekozen door te klikken in het bijbehorende vak. Vooruit via de tutorial door de gewenste selectievakjes in elk venster en klik op OK om naar de volgende reeks parameters met de volgende reeks te verplaatsen .<ol>
<li>Schakel het Epiluminescence vak voor de fluorescentie-parameter, selecteert u het mCherry vak voor de parameter filter paren. Schakel de selectievakjes in foto modus en Focus bevestigen en schakel de automatische in voor de parameter blootstelling.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zodra het instrument is opgezet, verplaatsen één dier binnen de anesthesie kamer. Wanneer volledig verdoofd, overdracht van het dier binnen de in vivo imaging systeem kooi en plaats deze kant omhoog met zijn hoofd binnen een zaadvormende aangesloten op de machine van de verdoving. Sluit het deksel en klik ophaal voor controle.</li>
	<li>Verwerven van de beelden verschijnen (een totaal van vijf beelden, één image voor elk paar filters geselecteerd) en gegevens opslaan door te klikken op de knop Opslaan als . Verplaats de muis naar het gebied van herstel na narcose. Herhaal dit proces met de resterende dieren.</li>
	<li>Herhaal controle twee of drie keer per week naar de follow-up van het signaal op de juiste wijze in de tijdsverloop.</li>
	<li>Ga verder met het dier aan het einde van het tijdsverloop offeren door CO2 verstikking.</li>
</ol>5. kwantificering van In Vivo Fluorescence beelden
<ol><li>
Scheiding van werkelijke fluorescentie via image-randverwijdering:
	<ol>
<li>Open de combinatie In Vivo Imaging analyse softwareprogramma.</li>
		<li>Kies het "Sequenceinfo"-bestand om te beginnen met de analyse. Twee vensters worden weergegeven: "Reeks view" en "Tool palet". Kies Hulpprogramma palet en zodra het menu wordt weergegeven de volgende opties selecteren.</li>
		<li>Selecteer correcties en klik op het vak Adaptieve FL achtergrond aftrekken om de ongewenste fluorescerende signalen van de verlichte afbeeldingsgegevens. Kies de drempel van het grootste belang en klikt u op instellen.</li>
		<li>Klik op spectrale Unmixing, selecteer de golflengtes van belang, de methode die is gekozen voor unmixing (bibliotheek, begeleide, automatische of handmatige) en klik vervolgens op Start Unmix.</li>
		<li>Selecteer de afbeelding van de Unmixed overeenkomt met mCherry signaal en tweevoudig tikken. Een nieuw venster verschijnt met de uiteindelijke afbeelding van het signaal van belang.</li>
		<li>Herhaal stap 5.1.3.</li>
		<li>Optioneel: Als een representatieve afbeelding (JPEG) van het unmix resultaat nodig is, kies de gewenste instellingen in Tool palet | Aanpassen van het beeld (kleur tafel, weggooien, contrast, enz.), en klik vervolgens op Afbeeldingen exporteren in het venster unmix om de huidige weergave van de afbeelding exporteren als een afbeelding.</li>
		<li>Sla het ongemengde bestand: bestand | Opslaan als | Kies map en Ok.</li>
		<li>Herhaal dit proces met de rest van de dagen van de controle en met alle dieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ROIs instellen en signaal kwantificering
	<ol>
<li>Klik op Bladeren en selecteer het gescheiden bestand (zie stap 5.1.8) van belang om te worden geanalyseerd. Een nieuw venster zal verschijnen.</li>
		<li>Klik op Toevoegen aan lijst te omvatten alle ongemengde bestanden van elk dier op verschillende tijdstippen en klik op Laden als een groep. Alle afbeeldingen moeten verschijnen als één reeks.</li>
		<li>Ga naar Hulpmiddel palet venster: klikt u op uit het vak ikndividual schaal voor alle afbeeldingen op dezelfde schaal.</li>
		<li>Tweevoudig tikken in één beeld van de reeks en een ROI op de zone van belang met behulp van de volgende reeks te maken. Ga naar ROI Tools en selecteer Countour en Auto 1 optie, klik op de vorm van de cirkel weergegeven, plaatst u deze op het centrum het fluorescent signaal en klik vervolgens op maken op het weergegeven venster. Opmerking: Dit automatisch hoogtepunten van pixels met een intensiteit van de fluorescentie boven achtergrondwaarden (d.w.z., laesie) en genereert een shape waarvan gebied de geschetste pixels omvat.</li>
		<li>De ROI-vorm kopiëren en plakken op een achtergrond zone waar er geen signaal is.</li>
		<li>Klik op maatregel ROIs | Selecteer alle waarden voor de intensiteit van de fluorescentie wilt weergeven. Ga verder met gegevenswaarden met de muis, klik op de rechterknop, drukt u op de kopie en plakken op een werkblad.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. gegevens (fluorescent signaal) normalisatie
<ol><li>Selecteer het punt van de eerste tijd op welke signaal is de intensiteit maximaal. Overgaan tot het signaal op elk tijdstip normaliseren met behulp van de formule: Signaal intensiteit op elk tijdstip / maximale signaal intensiteit waargenomen in de tijdsverloop) x 100.</li>
</ol>

<ol><li>Nap, A. W., Groothuis, P. G., Demir, A. Y., Evers, J. L., Dunselman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+endometriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+%26+Research%3A+Clinical+Obstetrics+%26+Gynaecology%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of endometriosis.</a> Best Practice & Research: Clinical Obstetrics & Gynaecology. 18, 233-244 (2004).</li>
<li>Holoch, K. J., Lessey, B. A. <a target="_blank" href="https://journals.lww.com/clinicalobgyn/Abstract/2010/06000/Endometriosis_and_Infertility.19.aspx">Endometriosis and infertility.</a> Clinical Obstetrics and Gynecology. 53, 429-438 (2010).</li>
<li>Eskenazi, B., Warner, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+endometriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Obstetrics+and+Gynecology+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of endometriosis.</a> Obstetrics and Gynecology Clinics of North America. 24 (2), 235-258 (1997).</li>
<li>Giudice, L. C., Kao, L. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15541453">Endometriosis.</a> Lancet. 364 (9447), 1789-1799 (2004).</li>
<li>Donnez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+of+medical+and+surgical+treatment+of+endometriosis-associated+infertility+and+pelvic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+and+Obstetric+Investigation%22%5BJournal%5D)">The efficacy of medical and surgical treatment of endometriosis-associated infertility and pelvic pain.</a> Gynecologic and Obstetric Investigation. 54, 2-7 (2002).</li>
<li>D'Hooghe, T. M., Bambra, C. S., Cornillie, F. J., Isahakia, M., Koninckx, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+laparoscopic+appearance+of+spontaneous+endometriosis+in+the+baboon+%28Papio+anubis%2C+Papio+cynocephalus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Prevalence and laparoscopic appearance of spontaneous endometriosis in the baboon (Papio anubis, Papio cynocephalus).</a> Biology of Reproduction. 45 (3), 411-416 (1991).</li>
<li>Dick, E. J., Hubbard, G. B., Martin, L. J., Leland, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Record+review+of+baboons+with+histologically+confirmed+endometriosis+in+a+large+established+colony%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Primatology%22%5BJournal%5D)">Record review of baboons with histologically confirmed endometriosis in a large established colony.</a> Journal of Medical Primatology. 32 (1), 39-47 (2003).</li>
<li>Donnez, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+endometriotic+nodules+in+an+experimental+baboon+modelmimicking+human+deep+nodular+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+%26+Sterility%22%5BJournal%5D)">Induction of endometriotic nodules in an experimental baboon modelmimicking human deep nodular lesions.</a> Fertility & Sterility. 99 (3), 783-789 (2013).</li>
<li>Grummer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+in+endometriosis+research%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">Animal models in endometriosis research.</a> Human Reproduction Update. 12 (5), 641-649 (2006).</li>
<li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+aspects+of+endometriosis+in+a+mouse+model+through+analysis+of+implantation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Gynecology+and+Obstetrics%22%5BJournal%5D)">Dynamic aspects of endometriosis in a mouse model through analysis of implantation and progression.</a> Archives of Gynecology and Obstetrics. 263 (3), 102-107 (2000).</li>
<li>Grummer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peritoneal+endometriosis%3A+validation+of+an+in-vivo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Peritoneal endometriosis: validation of an in-vivo model.</a> Human Reproduction. 16 (8), 1736-1743 (2001).</li>
<li>Becker, C. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0002944010622249">A novel non-invasive model of endometriosis for monitoring the efficacy of antiangiogenic therapy.</a> The American Journal of Pathology. 168 (6), 2074-2084 (2006).</li>
<li>Laschke, M. W., Giebels, C., Nickels, R. M., Scheuer, C., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+progenitor+cells+contribute+to+the+vascularization+of+endometriotic+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Endothelial progenitor cells contribute to the vascularization of endometriotic lesions.</a> The American Journal of Pathology. 178 (1), 442-450 (2011).</li>
<li>Nap, A. W., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15001592">Antiangiogenesis therapy for endometriosis.</a> The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 89 (3), 1089-1095 (2004).</li>
<li>Wang, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prodrug+of+green+tea+epigallocatechin-3-gallate+%28Pro-EGCG%29+as+a+potent+anti-angiogenesis+agent+for+endometriosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Prodrug of green tea epigallocatechin-3-gallate (Pro-EGCG) as a potent anti-angiogenesis agent for endometriosis in mice.</a> Angiogenesis. 16 (1), 59-69 (2013).</li>
<li>Delgado-Rosas, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+ergot+and+non-ergot-derived+dopamine+agonists+in+an+experimental+mouse+model+of+endometriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">The effects of ergot and non-ergot-derived dopamine agonists in an experimental mouse model of endometriosis.</a> Reproduction. 142 (5), 745-755 (2011).</li>
<li>Al-Jefout, M., Andreadis, N., Tokushige, N., Markham, R., Fraser, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pilot+study+to+evaluate+the+relative+efficacy+of+endometrial+biopsy+and+full+curettage+in+making+a+diagnosis+of+endometriosis+by+the+detection+of+endometrial+nerve+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Obstetrics+%26+Gynecology%22%5BJournal%5D)">A pilot study to evaluate the relative efficacy of endometrial biopsy and full curettage in making a diagnosis of endometriosis by the detection of endometrial nerve fibers.</a> American Journal of Obstetrics & Gynecology. 197 (6), 578(2007).</li>
<li>Fortin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+human+endometriotic+tissue+maintenance+and+regression+in+a+noninvasive+mouse+model+of+endometriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of human endometriotic tissue maintenance and regression in a noninvasive mouse model of endometriosis.</a> Molecular Therapy. 9 (4), 540-547 (2004).</li>
<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+nude+mouse+models+for+green+fluorescence+human+endometriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Obstetrics+and+Gynaecology+Research%22%5BJournal%5D)">Improved nude mouse models for green fluorescence human endometriosis.</a> Journal of Obstetrics and Gynaecology Research. 36 (6), 1214-1221 (2010).</li>
<li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+red+fluorescent+nude+mouse+model+of+human+endometriosis%3A+advantages+of+a+non-invasive+imaging+method%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Obstetric+Gynecologic+and+Reproductive+Biology%22%5BJournal%5D)">A red fluorescent nude mouse model of human endometriosis: advantages of a non-invasive imaging method.</a> European Journal of Obstetric Gynecologic and Reproductive Biology. 176, 25-30 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het protocol hierin gedetailleerde beschrijving van de implementatie van een dierlijk model van endometriose waarin de architectuur van het implanteren van laesies het platform is bewaard terwijl tegelijkertijd waardoor real-time beoordeling van de fluorescentie uitgestoten door mCherry Label baarmoederslijmvlies weefsel. In dit protocol beschrijven we het gebruik van een specifieke in vivo imaging systeem en verwante software te beoordelen niet-gebeurt fluorescentie uitgestoten door de gelabelde laesie. Elke gebruiker m...

Endometriose is een chronische gynecologic disorder, geïnitieerd door de inplanting van het functionele baarmoederslijmvlies buiten de baarmoederholte. Ectopische laesies groeien en veroorzaken van inflammatoire processen die leiden tot chronische bekken pijn en onvruchtbaarheid1. Geschat wordt dat omhoog tot 10 – 15% van de vrouwen in de reproductieve leeftijd worden beïnvloed door endometriosis2, en het is aanwezig in ongeveer 40-50% van onvruchtbare vrouwen3. Huidige farmacologische behandelingen voor endometriose zijn niet in staat om volledig uit te roeien laesies en niet vrij van bijwerkingen4,5. Het onderzoek voor meer efficiënte therapieën vereist van de verfijning van de bestaande diermodellen van endometriose op zodanige wijze dat menselijke laesies op de juiste wijze kunnen worden geïmiteerd, en de effecten van verbindingen op de grootte van de laesie o.a. nauw kunnen worden beoordeeld.
Primate modellen zijn gebruikt om na te bootsen endometriose door het inplanteren van ectopische laesies histologisch identiek en op vergelijkbare sites zoals mensen6,7,8; echter, ethische bezwaren en de hoge economische kosten in verband met experimenten met primaten limiet hun gebruik9. Bijgevolg blijft het gebruik van kleine dieren, vooral knaagdieren, voor de uitvoering van in vivo modellen van endometriose worden begunstigd omdat het zorgt studies met grotere aantallen personen10,11. Endometriose kan in deze dieren worden opgewekt door het transplanteren van stukken van knaagdier baarmoeder horens ("homologe modellen")12,13 of menselijk baarmoederslijmvlies/endometriotic weefsel naar ectopische sites (heterologe modellen)14 . In tegenstelling tot mensen, knaagdieren doen hun baarmoederslijmvlies weefsel niet vergoten en daardoor endometriose kan niet worden ontwikkeld spontaan in deze soorten. Homologe muis modellen van endometriose hebben bekritiseerd vanwege het feit dat ectopische muis uteriene weefsel ingeplant weerspiegelen derhalve niet de kenmerken van menselijke endometriotic laesies15.
Passende fysiologie van endometriose kan worden geïmiteerd in de heterologe modellen van endometriose waar verse menselijke baarmoederslijmvlies fragmenten immunodeficiëntie dieren zijn ingeplant. Conventionele heterologe modellen, worden de therapeutische effecten van verbindingen van belang vaak beoordeeld op het eindpunt van de beoordeling van de grootte van de laesie met het gebruik van de remklauwen16. Een duidelijke beperking is dat, als zodanig, eindpunt diermodellen niet toestaan studeren implantatie dynamics of endometriotic laesie ontwikkeling na verloop van tijd. Een extra beperking is dat het gebruik van de remklauwen niet nauwkeurige metingen van de grootte van de laesie toelaat. Inderdaad, de standaardfout geboden door remklauwen is in hetzelfde bereik (dat wil zeggen, millimeters) als de omvang van de letsels geïmplanteerd in muizen, dus de beperking van de capaciteit van deze hulpprogramma's te detecteren van werkelijke variaties in grootte.
Om deze beperkingen te overwinnen, hierin beschrijven we de generatie van een heteroloog muismodel van endometriose waarin geïmplanteerde menselijk weefsel is ontworpen om uit te drukken een verslaggever m-Cherry fluorescent proteïne. Detectie van het fluorescerende signaal met een passende afbeelding-systeem maakt het mogelijk niet-invasieve monitoring van de status van de laesie met gelijktijdige kwantificering van het formaat in real-time. Ons model biedt dus duidelijke voordelen in vergelijking met conventionele eindpunt modellen, aangezien het de mogelijkheid van bewaking in real-time niet-invasieve en de mogelijkheid voor het uitvoeren van meer objectieve en nauwkeurige schatting van de variaties in de grootte van de laesie brengt.

<table><tbody><tr><td>Endosampler&trade;</td><td>Medgyn</td><td>22720</td><td>Cannula voor het bemonsteren van het endometrium van de baarmoeder</td></tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>VWR</td><td>HYCLSH30285.FS</td><td>Medium</td></tr><tr><td>Ad-mCherry</td><td>Vector Biolabs</td><td>1767</td><td>Adenoviraal vector dat mCherry tot expressie brengt</td></tr><tr><td>PBS, 1x oplossing, steriele, pH 7.4</td><td>VWR</td><td>E504-500ML</td><td>Buffer voor wasbeurten</td></tr><tr><td>Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/60 dagen</td><td>Innovative Research of America</td><td>SE-121</td><td>Hormoonpellets voor knaagdieren</td></tr><tr><td>Vetbond&trade; weefselkleefstof</td><td>3M</td><td>780-680</td><td>Weefselkleefstof</td></tr><tr><td>Petrischalen in polystyreen kristal</td><td>Levantina</td><td>367-P101VR20</td><td>Petrischalen</td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>Sigma</td><td>P4333-100ML</td><td>Antibiotica</td></tr><tr><td>Spuiten, medisch 10 mL 0,5 ml</td><td>VWR</td><td>CODA626616</td><td>Spuiten</td></tr><tr><td>Nitrilhandschoenen, poedervrij</td><td>VWR</td><td>112-2754</td><td>Handschoenen</td></tr><tr><td>Zachte Zwitserse naakte muizen</td><td>Charles River</td><td>SNUSSFE05S</td><td>Muizen voor dierproeven</td></tr><tr><td>Ivis Spectrum In vivo Imaging systeem</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>In vivo monitoringapparatuur</td></tr><tr><td>Living Image&reg; (Ivis software)</td><td>Perkin Elmer</td><td>---</td><td>In vivo monitoring software</td></tr><tr><td>Fetaal runder serum</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td>Verrijkt serum</td></tr><tr><td>96-well cellencultuur behandelde platen</td><td>Life technologies</td><td>167008</td><td>Cultuurplaten</td></tr><tr><td>Urinecellen</td><td>Summedical</td><td>4004-248-001</td><td>Cellen voor wasbeurten</td></tr><tr><td>Steriele chirurgische bladen</td><td>(Aesculap Division) Sanycare</td><td>1609022-0008</td><td>Chirurgische bladen</td></tr><tr><td>Isovet 1.000 mg/g</td><td>B-BRAUN</td><td>---</td><td>Isofluraan (anesthetisch middel)</td></tr><tr><td>Buprex&reg; 0,3 mg</td><td>Schering Plough S.A.</td><td>---</td><td>Buprenorfine (pijnstillende oplossing)</td></tr><tr><td>Injecteerbare morfineoplossing 10 mg/mL</td><td>B BRAUN</td><td>---</td><td>Morfine (pijnstillende oplossing)</td></tr><tr><td>Monofyl&reg; Absorbeerbare hechtdraden</td><td>COVIDIEN</td><td>---</td><td>Hechtdraden</td></tr><tr><td>Desinclor chloorhexidine</td><td>Promedic SA</td><td>---</td><td>Antiseptische oplossing</td></tr><tr><td>Microscopie DMi8</td><td>Leica Mycrosystems</td><td>---</td><td>fluorescentiemicroscoop</td></tr><tr><td>Hera Cell 150 Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026282</td><td>Incubator</td></tr></tbody></table>

noninvasive controle van de grootte van de laesie in een heteroloog muismodel van endometriose

Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis

Hier beschrijven we een protocol voor de uitvoering van een heteroloog muismodel waarin progressie van endometriose kan worden beoordeeld in real time via noninvasive monitoring van fluorescentie uitgestoten door geïmplanteerde ectopische menselijke baarmoederslijmvlies weefsel. Voor dit doel worden Biopten van menselijke endometrium donor vrouwen lopende oöcyt donatie verkregen. Menselijke baarmoederslijmvlies fragmenten worden gekweekt in aanwezigheid van adenovirussen ontworpen om uitdrukkelijke cDNA voor de verslaggever fluorescent proteïne mCherry. Label op visualization, weefsels met een optimale tarief van fluorescentie na infectie worden vervolgens gekozen voor de implantatie in ontvangende muizen. Een week voorafgaand aan de implantatie-operatie, ontvangende muizen zijn oophorectomized en estradiol pellets subcutaan worden geplaatst om de overleving en de groei van de laesies. Op de dag van de operatie zijn muizen narcose en peritoneale holte benaderd via een kleine (1,5 cm) incisie door de linea-alba. Fluorescently geëtiketteerde implantaten zijn tweezed, kort gedrenkt in lijm en gekoppeld aan de peritoneale laag. Insnijdingen zijn ingehecht en dieren verlaten om te herstellen voor een paar dagen. Fluorescentie uitgestoten door endometriotic implantaten is meestal niet-gebeurt elke 3 dagen voor 4 weken met een in vivo imaging systeem gecontroleerd. Variaties in de grootte van endometriotic implantaten kunnen worden geraamd in real-time door de kwantificering van de mCherry signaal en de normalisatie tegen het oorspronkelijke tijd-punt maximale fluorescentie intensiteit tonen.
Traditionele preklinische knaagdieren van modellen van endometriose staan geen niet-invasieve monitoring van de laesie in real-time maar eerder toe evaluatie van de effecten van drugs vehiculumcontrolegroep op het eindpunt. Dit protocol maakt het mogelijk om bij te houden van de laesies in real-time en meer nuttig kunnen de therapeutische mogelijkheden van drugs in preklinische modellen van endometriose. De belangrijkste beperking van de aldus opgewekte model is dat niet-invasieve toezicht niet mogelijk gedurende lange perioden van tijd als gevolg van de episomal uitdrukking van Ad-virus is.

Hier beschrijven we het proces voor het maken van een heteroloog model van endometriose waarin de architectuur van letsels wordt bewaard door het implanteren van fluorescently geëtiketteerde stukken van menselijke endometrium in immuungecompromitteerde muizen, waardoor niet-invasieve controle van de laesie progressie. Etikettering van baarmoederslijmvlies fragmenten wordt bereikt door besmetting met adenovirus ontworpen om uitdrukkelijke mCherry, een eiwit uitstoten fluorescentie in het n...

Hier presenteren we een protocol voor live-imaging van fluorescently geëtiketteerde menselijke baarmoederslijmvlies fragmenten geënt in muizen. De methode kunt bestuderen van de gevolgen van de drugs van keuze voor endometriotic laesie grootte door middel van controle en kwantificering van de fluorescentie die wordt uitgestoten door de fluorescerende verslaggever op real-time

Noninvasive controle van de grootte van de laesie in een heteroloog muismodel van endometriose

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen bij de evaluatie van therapeutische drugseffecten in het endometrioseveld, zoals de effecten van anti-androgene verbindingen op de grootte van endometriotische laesies. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de effecten van de specifieke geneesmiddelen in dierlijke modellen van endometriose in real-time kunnen worden beoordeeld, in plaats van op het eindpunt. Het aantonen van de procedure zal Jessica Martinez, dat is een technicus uit mijn lab, evenals Viviana Bisbal en Nerea Marin, die dierenartsen van Centro de Investigacion Principe Felipe en die nauwe medewerkers met ons team.Twee tot drie dagen voor de implantaatoperatie, overdracht gespoeld, gezond endometrium weefsel biopsie fragmenten in een 10 centimeter petrischaal met compleet medium, en gebruik scalpels om het weefsel gehakt in vijf tot 10 millimeter blokjes. Met behulp van een micropipet, voeg 30 tot 50 microliter druppels DMEM over de bodem van een nieuwe 10 centimeter cultuur schotel, waardoor er genoeg ruimte tussen elke druppel, zodat ze niet in contact komen met elkaar. Wanneer alle druppels zijn geplaatst, gebruik dan een spuitnaald

noninvasive-monitoring-lesion-size-heterologous-mouse-model

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een beschrijving van de chirurgische inductie van endometriose bij muizen en ratten door auto-transplantatie van baarmoeder weefsel om de arteriële cascade van de intestinale mesenterium.

Muismodel van chirurgisch geïnduceerde Endometriose door Auto-transplantatie van baarmoeder weefsel

We beschrijven een niet-invasieve dierlijke beeldvormingsplatform die de detectie, kwantificering en monitoring van de groei en recidief van ovariumkanker mogelijk maakt. Dit intra-peritoneale xenograftmodel bootst het klinische profiel van patiënten met ovariumkanker na.

Muizenmodel voor Non-invasieve beeldvorming te detecteren en Monitor Eierstokkanker Herhaling

We beschrijven methoden voor longitudinaal bewaken van de werkzaamheid van therapieën voor de behandeling van colonische pathologieën bij muizen met behulp van een star endoscoop. Dit protocol kan gemakkelijk worden gebruikt voor de karakterisering van de therapeutische respons van een individuele tumor in levende muizen en ook voor het monitoren van mogelijke ziekterecidieven.

Niet-invasieve evaluatie van de werkzaamheid van nieuwe therapieën voor Intestinale Pathologieën gebruik van een serieel Endoscopische Imaging van levende muizen

Eierstokkankermetastase wordt gekenmerkt door talrijke diffuse intra-peritoneale laesies, waardoor nauwkeurige visuele kwantificering van de tumorbelasting een uitdaging is. Hierin beschrijven we een methode voor in situ en ex vivo kwantificering van de metastatische tumorbelasting met behulp van rood fluorescerend proteïne (RFP)-gelabelde tumorcellen en optische beeldvorming.

Kwantificering van Intra-peritoneale eierstokkanker Metastase

Veel knaagdiermodellen van endometriose worden beperkt door technische complexiteit, reproduceerbaarheid en/of behoefte aan immuungecompromitteerde dieren of speciale reportermuizen. We presenteren een vereenvoudigd systeem van laesie-inductie met behulp van elke experimentele muis met een onafhankelijk verifieerbaar, objectief scoresysteem en zonder vereiste voor ovariëctomie of overlevingsoperaties.

Een syngeneïsch murinemodel van endometriose met natuurlijk fietsende muizen

Dit protocol beschrijft een methode voor het monitoren van de progressie van morfologische veranderingen in de loop van de tijd in de baarmoeder in een induceerbaar muismodel van endometriumkanker met behulp van echografie met correlatie met grove en histologische veranderingen.

Niet-invasieve echografie van endometriumkankerprogressie bij Pax8-gerichte deletie van de tumoronderdrukkers Arid1a en Pten bij muizen

Deze studie introduceert een nieuw muismodel dat speciaal is ontworpen om endometrioom te simuleren, een klinisch significant subtype van endometriose. Door gebruik te maken van C57BL/6J-muizen wil het model de pathofysiologische mechanismen die ten grondslag liggen aan endometrioomgerelateerde onvruchtbaarheid ophelderen en een verfijnd hulpmiddel bieden om de huidige kenniskloof in de reproductieve geneeskunde te overbruggen.

Oprichting van een experimenteel muismodel van endometrioom om de gerelateerde onvruchtbaarheid te bestuderen

Orthotope diermodellen van kanker van de eierstokken te repliceren beter mens-en vaatziekten en daardoor meer inzicht in de progressie van kanker en tumor respons op therapie. Een muis model krijgt een intrabursale injectie van luciferase-expressie ovarium tumorcellen. De behandeling wordt toegediend via orale sondevoeding. Tumorgroei wordt bewaakt...

In vivo beeldvorming en therapeutische behandelingen in een orthotope Muis Model van eierstokkanker

Dit onderzoek betreft de ontwikkeling en standaardisatie van een waardevolle methodologische protocol op lange termijn (14 dagen) dodelijke toxiciteit die wordt uitgeoefend door chemische stoffen, industrieel afvalwater of in de riolering en vloeibare milieu monsters op de zoutwater schaaldieren te...

Lange-termijn Lethal toxiciteit Test met de Schaal- Artemia franciscana</em

De heterologe biosynthese van erythromycine A...

De Logic, experimentele stappen, en het potentieel van heterologe Natuurlijk Product Biosynthese Met de Complex antibioticum erytromycine A geproduceerd door middel van<em&gt; E. coli</em

Leer een niet-invasieve methode voor het in real-time beoordelen van therapeutische geneesmiddelen op endometriose-letsels met behulp van fluorescerende beeldvorming in een muismodel. Deze techniek maakt dynamische monitoring van letselgrootte mogelijk.

Noninvasive controle van de grootte van de laesie in een heteroloog muismodel van endometriose

Meer video's verkennen