Name: Analyse van kanker cel invasie en anti-metastatische Drug Screening met behulp van Hydrogel Micro-kamer Array (HMCA)-op basis van platen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Leer een hydrogel micro-kamer array methode voor analyse van kankercel-invasie in 3D tumor sferoïden. Dit systeem maakt continue monitoring en high-throughput screening van anti-metastatische geneesmiddelen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door het legaat van Moshe Shimon en Judith Weisbrodt.

1. HMCA plaat preegdruk
Opmerking: Het volledige proces voor het ontwerp en de fabricage van Polydimethylsiloxaan (PDMS) stempel en imaging plaat HMCA gebruikt in dit protocol wordt gedetailleerd beschreven in onze eerdere artikelen15,16. Het PDMS stempel (negatieve vorm) wordt gebruikt om het reliëf van de HMCA (positieve vorm), die uit ongeveer 450 MCs per putje (figuur 1A bestaat). Zoals aangetoond in figuur 1B, elk van de MCs heeft een vorm van een afgeknotte piramide vierkant-vormige ondersteboven (hoogte: 190 µm, kleine basisareaal: 90 µm x 90 µm en groot basisareaal: 370 µm x 370 µm). De HMCA plaat wordt gebruikt voor de voorbereiding en het kweken van 3D tumor spheroïden en daarna voor invasie assay. U kunt ook kan een commerciële stempel worden gebruikt voor de productie van de HMCA.
<ol><li>Bereid een oplossing van 6% lage smeltende agarose (LMA). Het LMA poeder en steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (0,6 g LMA per 10 mL PBS) invoegen in een glazen fles met een magneetroerder. Plaats de fles op een verwarmingsplaat en roer de oplossing terwijl verwarming tot 80 ° C voor een paar uur totdat een uniforme oplossing is bereikt. Bewaar deze oplossing bij 70 ° C tot gebruik.</li>
	<li>Verwarm het PDMS stempel tot 70 ° C in de oven. Houd het warm tot gebruik. Als alternatief gebruik van een commerciële stempel en volg de instructies.</li>
	<li>Plaats de commerciële 6-well glazen-bodem platen op een droge Bad pre-water verwarmd tot 75 ° C. Wacht enkele minuten totdat de plaat volledig warm.</li>
	<li>Giet een druppel (400 µL) voorverwarmde LMA op de glazen bodem van elk van de putjes in de plaat. Zachtjes de voorverwarmde PDMS stempel op de daling van de agarose plaatst. Incubeer bij kamertemperatuur (RT) gedurende 5 tot 10 min voor vooraf gelerend en vooraf koeling. Incubeer bij 4 ° C gedurende 20 minuten tot volledige agarose gelering. Vervolgens voorzichtig afschilferen naar het PDMS, verlaten het agarose gel patroon met MCs. Opmerking: Deze stap gebeurt gelijktijdig in alle de putjes.</li>
	<li>Plaats de reliëf plaat in een licht systeem voorzien van ultraviolet (UV)-lamp uitharden en incubeer gedurende 3 minuten. Opmerking: Nu de HMCA plaat is UV gesteriliseerd.</li>
	<li>Vul de macro-putten met steriel PBS om ervoor te zorgen dat ze vochtig blijven, dan de afdekplaat, wikkel het met parafilm en het bewaren bij 4 ° C tot gebruik.</li>
	<li>Vóór gebruik, leeg PBS reststromen uit de HMCA plaat. Plaats het in de biologische kap.</li>
</ol>2. veilig laden cellen en sferoïde vorming
<ol><li>Verzamelen van de cellen als volgt: alle medium verwijderen uit een 10 cm cultuur plaat cel enkelgelaagde, was tweemaal met 10 mL PBS te vervreemden van serum storingswaarden, voeg 5 mL trypsine (vooraf opgewarmd tot 37 ° C) en incubeer gedurende 3 minuten in de incubator bij 37 ° C. Vervolgens, schud de plaat zachtjes aan enkelgelaagde detachement zorgen en voeg 10 mL van volledige medium (vooraf opgewarmd tot 37 ° C) en Pipetteer op en neer totdat homogene celsuspensie is bereikt. Centrifugeren en wassen van de celsuspensie met 15 mL verse voedingsbodem dan opschorten bij adequate concentraties in vers volledig medium.</li>
	<li>Zachtjes laden de celsuspensie (50 µL, 150 – 360 x 103 cellen/mL in medium, ~ 16-40 cellen per MC) op de top van de HMCA en de cellen te regelen door de zwaartekracht voor 15 min te laat.</li>
	<li>Zachtjes 6 – 8 aliquots van 500 µL verse medium (totaal 3-4 mL) aan de rand van de macro-well kunststof bodem buiten de ring en hydrogel array toevoegen.</li>
	<li>Incubeer HeLa cellen gedurende 72 uur en MCF7 cellen gedurende 48 uur bij 37 ° C en 5% CO2, in een bevochtigde sfeer voor de vorming van spheroïden.</li>
</ol>3. levensvatbaarheid detectie door Propidium jodide (PI) kleuring
<ol><li>Bereiden van een stamoplossing van PI (500 µg voor PI per 1 mL PBS). Houd het bij 4 ° C voor ongeveer 6 maanden. Vers bereid een verdunning van 1:2,000 (0,25 µg/mL), door de toevoeging van 6 µL van materieel tot 12 mL van volledige medium zonder fenol rood, voor de 6-well HMCA plaat (2 mL per putje).</li>
	<li>De HMCA plaat met 48-72 uur spheroïden, vanuit de incubator voor de biologische kap overzetten. Alle medium uit de HMCA verwijderen door het tip-einde leunend op de rand van de macro-well Kunststof onderzijde naast de hydrogel array, verlaten de matrix tank gevuld met medium.</li>
	<li>Zachtjes Voeg toe 2 mL PI verdunning van stap 3.1 aan elk putje, door het einde van de tip leunend op de rand van de macro-well kunststof bodem. Incubeer de plaat van de HMCA gedurende 1 uur bij 37 ° C en 5% CO2, in een bevochtigde sfeer. Ga verder met stap 7. Opmerking: Andere kleurstoffen kunnen worden gebruikt hier ook, bijvoorbeeld, Hoechst voor nucleus kleuring, tetramethylrhodamine methylester (TMRM) voor Mitochondriale membraanpotentiaal kleuring, fluoresceïne DIACETAAT (FDA) voor de levende cellen detectie, Annexine V voor apoptosis detectie en anderen.</li>
</ol>4. collageen mengsel voorbereiding
<ol><li>Bereiden steriel dubbel gedestilleerd water (DDW) door autoclaaf en een voorraad van 100 mL 1 M NaOH filter-gesteriliseerde oplossing. Het handhaven van de materialen op de RT en de tips voor collageen mengsel bereiding bevroren bij-20 ° C, tot gebruik bestemd.</li>
	<li>10 – 20 min vóór gebruik, plaats alle intergrades met inbegrip van: steriele DDW, 1 M NaOH steriele oplossing, steriele 10 x PBS, typ ik collageen van de staart van de rat (opgeslagen bij 4 ° C gedurende 3-maanden) en een steriele buis in de ijsemmer tot volledig afgekoeld. Plaats de ijsemmer binnen de biologische kap.</li>
	<li>1.800 µL van het mengsel van collageen met een eindconcentratie van 3 mg/mL, voorbereiden op 6-well HMCA invasie assay plaat (300 µL per putje) als volgt. Voeg de intergrades in de afgekoelde buis in de volgende volgorde: 515 µL van DDW, 24.8 µL van 1 M NaOH en 180 µL van 10 x PBS. Meng goed door vortex en terug in het ijs. Ten slotte, 1080 µL van collageen toevoegen aan het mengsel, vortex weer en zet terug in ijs.</li>
</ol>5. HA en collageen mengsel voorbereiding
<ol><li>Los 10 mg HA in 2 mL steriele DDW. Incubeer het mengsel op RT voor een paar minuten en vortex zachtjes tot het poeder volledig is opgelost. Bewaar de stockoplossing bij 4 ° C voor maximaal twee jaar.</li>
	<li>Rechts vóór gebruik, plaatst u de stockoplossing HA in de ijsemmer binnen de biologische kap.</li>
	<li>Bereiden een 3 mg/mL collageen mengsel zoals beschreven in stap 4. Voeg 36 µg (7.2 µL) van HA in 1800 μL van klaar voor gebruik van collageen mengsel, voor een eindconcentratie van 20 µg/mL. Dan, vortex nogmaals kort en zet terug in ijs.</li>
</ol>6. ECM mengsel toevoeging
<ol><li>De HMCA plaat, met 48-72 h spheroïden, overdracht van de incubator in de biologische kap en plaats deze op het ijs. Incubeer gedurende 10 minuten tot de plaat is afgekoeld. Verwarm op een oplossing van 1% LMA tot 37 ° C in een waterbad.</li>
	<li>Verwijder alle medium uit rond de HMCA, door het tip-einde leunend op de rand van de macro-well Kunststof onderzijde naast de hydrogel-matrix. Zorgvuldig, verwijder vervolgens alle medium uit de matrix tank met een fijne tip/gel tip, door het einde van de tip leunend op de rand van de matrix, langzaam en zachtjes zuigen alle medium uit te laden. Opmerking: Na het verwijderen van alle medium uit rond de hydrogel matrix, de matrix-tank is nog steeds gevuld met medium. Dit medium moet zeer voorzichtig worden verwijderd om te voorkomen vernietiging van de hydrogel MC en dislocatie van spheroïden.</li>
	<li>Neem 150 µL van het mengsel van collageen of HA en collageen mengsel (ECM mengsel) met de vooraf bevroren fijne tip en voeg in de matrix tank door de tip te hechten aan de rand van de matrix. Laat het mengsel langzaam Voorkom sferoïde dislocatie. Herhaal deze stap met een andere hoeveelheid 150 µL, voor een totale 300 µL per putje. Volg dezelfde procedure als voor elk putje totdat alle putjes worden opgevuld. Plaats de plaat dan in de incubator voor 1 h voor de volledige gelering voor de ECM.</li>
	<li>Nadat de volledige gelering voor ECM is bereikt, Pipetteer 400 µL voorverwarmde 1% LMA bovenop de ECM-gel. De afdekplaat met zijn deksel, Incubeer de plaat duikt met RT gedurende 5-7 minuten, waarna gedurende 2 minuten bij 4 ° C, voor agarose gelering. Ten slotte, zachtjes Voeg toe 2 mL van volledige medium door het einde van de tip leunend op de rand van de macro-well kunststof bodem. Noot: De agarose laag voorkomt dat de onthechting van de collageen-gel matrix van de HMCA.</li>
</ol>7. invasie Assay verwerving en analyse
<ol><li>Belasting de HMCA plaat op een gemotoriseerde omgekeerde Microscoop fase voorzien van een incubator, vooraf aangepast tot 37 ° C, 5% CO2 en bevochtigde sfeer.</li>
	<li>Vooraf bepalen de posities voor Beeldacquisitie in elk goed zodat de hele matrix gebied bestrijken, en gebruiken van 10 X of 4 X doelstellingen (deze stap is vereist voor de afbeelding acquisitie software hier gebruikt, zie de Materialen tabel hieronder voor details). Anderzijds alle afbeelding acquisitie software gebruiken om de automatische scan van de gehele vereiste ruimte, door te kiezen voor de "Stich" optie.</li>
	<li>Verwerven beelden helder veld (BF) elke 2-4 h voor een totale periode van 24-72 uur te volgen van de invasie van cellen van het lichaam sferoïde in de omliggende ECM.</li>
	<li>Verwerven fluorescerende beelden voor PI detectie met behulp van een speciale tl kubus (excitatie filter 530 – 550 nm, dichroïde spiegel 565 nm lange pass en emissie filter 600 – 660 nm).</li>
	<li>Time-lapse BF/TL beelden uit de afbeelding acquisitie software exporteren en opslaan in tagged image file-indeling (TIFF) naar een speciale map via het tabblad 'Database' in de werkbalk en vervolgens op de knop "Export bestanden opnemen" . Opmerking: We hebben ontwikkeld code voor een speciale in-house analyse in MATLAB software waarin een ontworpen grafische gebruikersinterface (GUI) in welke invasie analyse kan worden uitgevoerd, sneller en gemakkelijker. In deze code analyse gebeurt de segmentatie van de spheroïden en de invasie gebied semi-automatisch met behulp van Sobel filter gevolgd door de morfologische operatoren erosie en dilatatie. Na automatische segmentatie van de gebieden, handmatige correcties aangebracht waar nodig voor betere nauwkeurigheid. Na de voltooiing van de segmentatie, waren een aantal parameters automatisch berekend door de software en geëxporteerd naar een excel bestand voor verdere manipulatie. De lijst van parameters zijn: doorsnede van het fundamentele sferoïde tijde = 0, invasie gebied van cellen verbonden met sferoïde lichaam = belangrijkste invasie gebied, gebied van cellen gescheiden van belangrijkste invasie, aantal cellen gescheiden van belangrijkste invasie, gemiddelde afstand van invasie van het fundamentele sferoïde massamiddelpunt aan de omtrek van de belangrijkste invasie gebied en scheidt cellen en collectieve invasie afstand parameter = d (d = √ ((X2 - X1)2 + (Y2 - Y-1)2) uit de X en Y sferoïde massamiddelpunt coördineert, voorheen (X1, Y-1) en na (X2, Y2) collectieve invasie proces). U kunt ook kan beeldanalyse worden gedaan met een andere gespecialiseerde software.</li>
	<li>Open de GUI en druk op de "Load BF" knop. Nadat de afbeelding geopend is, de segmentatie parameters aanpassen (minimale grootte: > 1 en straal sluiten: > 1) om een precieze segmentatie van sferoïde en de invasie, druk vervolgens op "Regio van belang (ROI) segmentatie" knop voor uitvoering en Er verschijnt een rand rond elke sferoïde. Als de automatische segmentatie onjuist is, drukt u op de knop "Verwijderen" of "Toevoegen" en de gevraagde correcties handmatig aanbrengen. Herhaal dezelfde stappen voor latere beelden.</li>
	<li>Druk op de knop "Tracking" naar het nummer van de spheroïden en de software zal toewijzen voor elke sferoïde in elk van de tijd lapse beelden hetzelfde getal. Druk vervolgens op de knop "Measurement" , die een spreadsheet met alle parameters genereren zal. Dit werkblad opslaan als een excel-bestand voor verder gebruik in resultaten verwerking en statistieken in excel software.</li>
</ol>

<ol><li>Guan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+metastases%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+pharmaceutica+Sinica.+B%22%5BJournal%5D)">Cancer metastases: challenges and opportunities.</a> Acta pharmaceutica Sinica. B. 5 (5), 402-418 (2015).</li>
<li>Sapudom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phenotype+of+cancer+cell+invasion+controlled+by+fibril+diameter+and+pore+size+of+3D+collagen+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The phenotype of cancer cell invasion controlled by fibril diameter and pore size of 3D collagen networks.</a> Biomaterials. 52, 367-375 (2015).</li>
<li>Portillo-Lara, R., Annabi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microengineered+cancer-on-a-chip+platforms+to+study+the+metastatic+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Microengineered cancer-on-a-chip platforms to study the metastatic microenvironment.</a> Lab on a chip. 16 (21), 4063-4081 (2016).</li>
<li>Gkountela, S., Aceto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-like+features+of+cancer+cells+on+their+way+to+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Direct%22%5BJournal%5D)">Stem-like features of cancer cells on their way to metastasis.</a> Biology Direct. 11 (1), 33(2016).</li>
<li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FReviews+in+Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).</li>
<li>Guzman, A., Sánchez Alemany, V., Nguyen, Y., Zhang, C. R., Kaufman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+3D+in+vitro+metastasis+model+elucidates+differential+invasive+strategies+during+and+after+breaching+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A novel 3D in vitro metastasis model elucidates differential invasive strategies during and after breaching basement membrane.</a> Biomaterials. 115, 19-29 (2017).</li>
<li>Lee, E., Song, H. -H. G., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+on-a-chip+platforms+for+studying+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+chemical+engineering%22%5BJournal%5D)">Biomimetic on-a-chip platforms for studying cancer metastasis.</a> Current opinion in chemical engineering. 11, 20-27 (2016).</li>
<li>Mittler, F., Obeïd, P., Rulina, A. V., Haguet, V., Gidrol, X., Balakirev, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Content+Monitoring+of+Drug+Effects+in+a+3D+Spheroid+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model.</a> Frontiers in Oncology. 7, 293(2017).</li>
<li>Evensen, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+High-Throughput+Three-Dimensional+Invasion+Assay+for+Anti-Cancer+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Development of a High-Throughput Three-Dimensional Invasion Assay for Anti-Cancer Drug Discovery.</a> PLoS ONE. 8 (12), e82811(2013).</li>
<li>Aw Yong, K. M., Li, Z., Merajver, S. D., Fu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+tumor+invasion+front+using+long-term+fluidic+tumoroid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Tracking the tumor invasion front using long-term fluidic tumoroid culture.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10784(2017).</li>
<li>Mi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+co-culture+system+for+cancer+migratory+analysis+and+anti-metastatic+drugs+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Microfluidic co-culture system for cancer migratory analysis and anti-metastatic drugs screening.</a> Scientific Reports. 6 (1), 35544(2016).</li>
<li>Chung, S., Sudo, R., Mack, P. J., Wan, C. -R., Vickerman, V., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+into+scaffolds+under+co-culture+conditions+in+a+microfluidic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Cell migration into scaffolds under co-culture conditions in a microfluidic platform.</a> Lab on a chip. 9 (2), 269-275 (2009).</li>
<li>Krakhmal, N. V., Zavyalova, M. V., Denisov, E. V., Vtorushin, S. V., Perelmuter, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Invasion%3A+Patterns+and+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+naturae%22%5BJournal%5D)">Cancer Invasion: Patterns and Mechanisms.</a> Acta naturae. 7 (2), 17-28 (2015).</li>
<li>Lintz, M., Muñoz, A., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mechanics+of+Single+Cell+and+Collective+Migration+of+Tumor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">The Mechanics of Single Cell and Collective Migration of Tumor Cells.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 139 (2), 21005(2017).</li>
<li>Afrimzon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+microstructure+live-cell+array+for+multiplexed+analyses+of+cancer+stem+cells%2C+tumor+heterogeneity+and+differential+drug+response+at+single-element+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Hydrogel microstructure live-cell array for multiplexed analyses of cancer stem cells, tumor heterogeneity and differential drug response at single-element resolution.</a> Lab on a Chip. 16 (6), 1047-1062 (2016).</li>
<li>Shafran, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+is+cytoprotective+to+breast+cancer+spheroids+vulnerable+to+estrogen-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide is cytoprotective to breast cancer spheroids vulnerable to estrogen-induced apoptosis.</a> Oncotarget. 8 (65), 108890-108911 (2017).</li>
<li>Sato, H., Idiris, A., Miwa, T., Kumagai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabric+Vessels+for+Embryoid+Body+Formation+and+Rapid+Differentiation+of+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Microfabric Vessels for Embryoid Body Formation and Rapid Differentiation of Pluripotent Stem Cells.</a> Scientific Reports. 6 (1), 31063(2016).</li>
<li>Lee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gravity-oriented+microfluidic+device+for+uniform+and+massive+cell+spheroid+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Gravity-oriented microfluidic device for uniform and massive cell spheroid formation.</a> Biomicrofluidics. 6 (1), 14114(2012).</li>
<li>Zaretsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+dynamics+of+primary+T+cell+activation+and+differentiation+using+long+term+live+cell+imaging+in+microwell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Monitoring the dynamics of primary T cell activation and differentiation using long term live cell imaging in microwell arrays.</a> Lab on a Chip. 12 (23), 5007(2012).</li>
<li>Khan, N., Syed, D. N., Ahmad, N., Mukhtar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fisetin%3A+a+dietary+antioxidant+for+health+promotion%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+redox+signaling%22%5BJournal%5D)">Fisetin: a dietary antioxidant for health promotion.</a> Antioxidants & redox signaling. 19 (2), 151-162 (2013).</li>
<li>Lee, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Networked+concave+microwell+arrays+for+constructing+3D+cell+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Networked concave microwell arrays for constructing 3D cell spheroids.</a> Biofabrication. 10 (1), 15001(2017).</li>
<li>Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+%283D%29+tumor+spheroid+invasion+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52686(2015).</li>
<li>Toh, Y. -C., Raja, A., Yu, H., van Noort, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+Microfluidic+Model+to+Recapitulate+Cancer+Cell+Migration+and+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering%22%5BJournal%5D)">A 3D Microfluidic Model to Recapitulate Cancer Cell Migration and Invasion.</a> Bioengineering. 5 (2), 29(2018).</li>
<li>Sugimoto, M., Kitagawa, Y., Yamada, M., Yajima, Y., Utoh, R., Seki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropassage-embedding+composite+hydrogel+fibers+enable+quantitative+evaluation+of+cancer+cell+invasion+under+3D+coculture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Micropassage-embedding composite hydrogel fibers enable quantitative evaluation of cancer cell invasion under 3D coculture conditions.</a> Lab on a Chip. 18 (9), 1378-1387 (2018).</li>
<li>Yamamoto, S., Hotta, M. M., Okochi, M., Honda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Vascular+Formed+Endothelial+Cell+Network+on+the+Invasive+Capacity+of+Melanoma+Using+the+In+Vitro+3D+Co-Culture+Patterning+Model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Effect of Vascular Formed Endothelial Cell Network on the Invasive Capacity of Melanoma Using the In Vitro 3D Co-Culture Patterning Model.</a> PLoS ONE. 9 (7), e103502(2014).</li>
<li>Lee, S. -H., Moon, J. J., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+micropatterning+of+bioactive+hydrogels+via+two-photon+laser+scanning+photolithography+for+guided+3D+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional micropatterning of bioactive hydrogels via two-photon laser scanning photolithography for guided 3D cell migration.</a> Biomaterials. 29 (20), 2962-2968 (2008).</li>
<li>Gschwind, A., Zwick, E., Prenzel, N., Leserer, M., Ullrich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+communication+networks%3A+epidermal+growth+factor+receptor+transactivation+as+the+paradigm+for+interreceptor+signal+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Cell communication networks: epidermal growth factor receptor transactivation as the paradigm for interreceptor signal transmission.</a> Oncogene. 20 (13), 1594-1600 (2001).</li>
<li>Jiang, K., Dong, C., Xu, Y., Wang, L. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2016/ra/c6ra05691a">Microfluidic-based biomimetic models for life science research.</a> RSC Advances. 6 (32), 26863-26873 (2016).</li>
<li>Mason, B. N., Starchenko, A., Williams, R. M., Bonassar, L. J., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+three-dimensional+collagen+matrix+stiffness+independently+of+collagen+concentration+modulates+endothelial+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Tuning three-dimensional collagen matrix stiffness independently of collagen concentration modulates endothelial cell behavior.</a> Acta biomaterialia. 9 (1), 4635-4644 (2013).</li>
<li>Raub, C. B., Putnam, A. J., Tromberg, B. J., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+bulk+mechanical+properties+of+cellularized+collagen+gels+using+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Predicting bulk mechanical properties of cellularized collagen gels using multiphoton microscopy.</a> Acta Biomaterialia. 6 (12), 4657-4665 (2010).</li>
<li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li>
<li>Rao, S. S., DeJesus, J., Short, A. R., Otero, J. J., Sarkar, A., Winter, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+Behaviors+in+Three-Dimensional+Collagen-Hyaluronan+Composite+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma Behaviors in Three-Dimensional Collagen-Hyaluronan Composite Hydrogels.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (19), 9276-9284 (2013).</li>
<li>Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan+concentration+within+a+3D+collagen+matrix+modulates+matrix+viscoelasticity%2C+but+not+fibroblast+response%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan concentration within a 3D collagen matrix modulates matrix viscoelasticity, but not fibroblast response.</a> Matrix Biology. 28 (6), 336-346 (2009).</li>
<li>Chanmee, T., Ontong, P., Itano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan%3A+A+modulator+of+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan: A modulator of the tumor microenvironment.</a> Cancer Letters. 375 (1), 20-30 (2016).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+Three-Dimensional+Microenvironment+with+Hyaluronan+of+Different+Molecular+Weights+Alters+Breast+Cancer+Cell+Invasion+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Modulating Three-Dimensional Microenvironment with Hyaluronan of Different Molecular Weights Alters Breast Cancer Cell Invasion Behavior.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (11), 9327-9338 (2017).</li>
<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+of+low+molecular+weight+hyaluronan+in+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">A novel role of low molecular weight hyaluronan in breast cancer metastasis.</a> The FASEB Journal. 29 (4), 1290-1298 (2015).</li>
<li>Fisher, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+resistance%2C+high+molecular+weight+hyaluronic+acid%2C+and+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+communication+and+signaling%22%5BJournal%5D)">Cancer resistance, high molecular weight hyaluronic acid, and longevity.</a> Journal of cell communication and signaling. 9 (1), 91-92 (2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Het is goed gedocumenteerd zijn levende organismen, gekenmerkt door hun complexe 3D meercellige organisatie duidelijk onderscheiden van de meest gebruikte 2D enkelgelaagde gekweekte cellen, nadruk op de cruciale noodzaak om cellulaire modellen die beter na te de functies bootsen en processen van levend materiaal voor drug screening. Meercellige spheroïden, organotypic culturen, organoids en organen-on-a-chip hebben onlangs geïntroduceerde8 voor het gebruik in gestandaardiseerde drugontdekking. Gro...

Kanker overlijden wordt toegeschreven voornamelijk aan de verspreiding van uitgezaaide cellen naar verre locaties. Vele inspanningen in de behandeling van kanker geconcentreerd op targeting of preventie van de vorming van metastatische kolonies en progressie van systemische gemetastaseerde ziekte1. Kanker cel migratie is een cruciale stap in het proces van tumor metastase, het onderzoek van de kanker invasie cascade is dus erg belangrijk en een voorwaarde voor het vinden van de anti-metastatische therapeutics.
Het gebruik van dierlijke modellen als instrumenten voor het bestuderen van gemetastaseerde ziekte is erg duur en niet altijd representatief voor de tumor bij de mens gevonden. Bovendien, de extracellulaire communicatie topologie, de mechanica en de samenstelling sterk van invloed op kanker cel gedrag2. Aangezien in vivo modellen is inherent gebrek aan de mogelijkheid om te scheiden en beheren van dergelijke specifieke parameters die aan kanker invasie en metastase bijdragen, is er behoefte aan een beheersbare biomimetische in vitro modellen.
Om het metastaseren tot verre organen, moeten de kankercellen trekkende en invasieve fenotypische eigenschappen die kunnen worden gericht voor therapie vertonen. Aangezien de meeste in vitro kanker modellen niet de feitelijke kenmerken van solide tumoren3nabootsen doen, is het echter zeer uitdagend om te detecteren fysiologisch relevante fenotypen. Bovendien, dicteert de fenotypische heterogeniteit die bestaat binnen de tumor, de noodzaak voor het analyseren van de tumor migratie op één element resolutie om te ontdekken fenotype gerichte therapieën, bijvoorbeeld door zich te richten de cel metastase-Inleiding bevolking binnen heterogene tumoren4.
De studie van de beweeglijkheid van de cel en collectieve migratie is voornamelijk uitgevoerd in enkelgelaagde culturen van epitheliale cellen op homogene vlakke oppervlakken. Deze conventionele cellulaire modellen voor kanker cel migratie zijn gebaseerd op de analyse van de bevolking van afzonderlijke cellen invasie door de membranen en ECM componenten5, maar in dergelijke systemen, de intrinsieke verschillen tussen afzonderlijke cellen kunnen niet studeerde. Genereren 3D spheroïden, hetzij via steigers of steiger-gratis micro-structuren is beschouwd als een superieure betekent om te studeren van de tumor cel groei en kanker invasie6,7,8. Echter meest 3D systemen zijn niet geschikt voor hoge doorvoer formaten, en inter sferoïde interactie meestal niet worden bereikt aangezien geïsoleerde individuele spheroïden worden gegenereerd in elk micro-well9. Recente studies met betrekking tot de migratie van kanker zijn gebaseerd op microfluidic apparaten3,10,11,12, echter deze verfijnde microfluidic tools zijn moeilijk te produceren en kan niet voor hoge throughput screening (HTS) van anti-invasieve drugs worden gebruikt.
Twee belangrijkste fenotypen, collectieve en individuele cel migratie, die een rol spelen bij de tumorcellen het overwinnen van de ECM-barrière en invasie van naburige weefsel, hebben aangetoond dat13,14, elke weergave van verschillende morfologische kenmerken, genetische, biochemische en moleculaire mechanismen. Daarnaast zijn twee vormen van migratie tumorcellen, fibroblast-achtige en Wortelpotigen, waargenomen in elke fenotype. Aangezien beide invasie fenotypes en migratie modi, voornamelijk door morfologische eigenschappen worden gedefinieerd, er is behoefte aan een mobiele modellen die inschakelen imaging gebaseerde detectie en behandeling van alle vormen van de invasie van de tumor en het migreren van cellen.
Het algemene doel van de huidige methode is bedoeld als een eenvoudige en reproduceerbare biomimetische 3D in vitro cel-gebaseerde systeem voor de analyse van de capaciteit van de invasie in grote populaties van de tumor spheroïden. Hier introduceren we de HMCA gebaseerde 6-well imaging plaat voor het onderzoek van de invasie van de tumor en anti-metastatische therapie. De technologie maakt de vorming van grote aantallen van uniforme 3D tumor spheroïden (450 per putje) in een hydrogel micro-kamers (MC) structuur. Verschillende onderdelen van de ECM zijn toegevoegd aan de matrix sferoïde om de invasie van de cellen in de omgeving. Invasie proces wordt voortdurend gecontroleerd door korte - en lange termijn waarneming van dezelfde individuele spheroïden/invasie cellen en vergemakkelijkt Morfologische karakterisering, fluorescerende vlekken en het ophalen van specifieke spheroïden op elk gewenst moment. Aangezien talrijke spheroïden ruimte en medium delen, is interactie via oplosbare moleculen tussen individuele spheroïden en hun invloed op elkaar mogelijk. Semi-automatische beeldanalyse wordt uitgevoerd met behulp van in-house MATLAB-code waarmee de snellere en meer efficiënte verzameling van grote hoeveelheden gegevens. Het platform vergemakkelijkt nauwkeurige, gelijktijdige meting van talrijke invasie van spheroïden/cellen in een tijd-efficiënte manier, waardoor middellange throughput screening van anti-invasie drugs.

<table><tbody><tr><td>6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass</td><td>Cellvis</td><td>P06-14-1.5-N</td><td>Commerciële glazen bodemplaten die worden gebruikt voor HMCA-embossering</td></tr><tr><td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520100</td><td>Een oplossing van 6% agarose wordt voor gebruik opgewarmd tot 80 &deg;C, een oplossing van 1% agarose wordt opgewarmd tot 37 &deg;C</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA solution B</td><td>Biological Industries</td><td>03-052-1A</td><td>Voor gebruik opgewarmd tot 37 &deg;C</td></tr><tr><td>DMEM medium, hoge glucose</td><td>Biological Industries</td><td>01-055-1A</td><td>Voor gebruik opgewarmd tot 37 &deg;C</td></tr><tr><td>Special Newborn Calf Serum (NBCS)</td><td>Biological Industries</td><td>04-122-1A</td><td>Warmte-geïnactiveerd</td></tr><tr><td>DPBS (10x), geen calcium, geen magnesium</td><td>Biological Industries</td><td>02-023-5A</td><td>Gehouden op ijs voor gebruik</td></tr><tr><td>NaOH, watervrij</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td><td>Gebruikt voor de bereiding van 1 M NaOH-oplossing</td></tr><tr><td>Cultrex Type I collageen uit rattenstaart, 5 mg/mL</td><td>Trevigen</td><td>3440-100-01</td><td>Gehouden op ijs voor gebruik</td></tr><tr><td>Hyaluronzuur natriumzout</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5542-10MG</td><td>Gehouden op ijs voor gebruik</td></tr><tr><td>Fisetin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F505-100MG</td><td>Toegevoegd aan het kweekmedium, invasieremmer</td></tr><tr><td>DETA/NO</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>alx-430-014-m005</td><td>Toegevoegd aan het kweekmedium, stikstofmonoxide donor</td></tr><tr><td>PI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>Gebruikt bij zeer lage concentratie zonder de noodzaak van wassen</td></tr><tr><td>Dymax 5000-EC UV flood lamp complete systeem met lichtschild &amp; Dymax 400 Watt EC voeding</td><td>Dymax Corporation</td><td>PN 39823</td><td>Gebruikt voor HMCA-plaatsterilisatie door UV</td></tr><tr><td>Omgekeerde IX81 microscoop</td><td>Olympus</td><td></td><td>Gebruikt voor automatische beeldverwerving</td></tr><tr><td>Incubator voor microscoop</td><td>Life Imaging Services</td><td></td><td>Onmisbaar voor time-lapse experimenten met beeldverwerving, vooraf ingesteld op 37 &deg;C, 5% CO2 en het handhaven van een bevochtigde atmosfeer</td></tr><tr><td>Sub-micron gemotoriseerde stage type SCAN-IM</td><td>Marzhauser Wetzlar GmbH</td><td></td><td>Gebruikt om beeldverwervingsgebieden vooraf te bepalen, voor automatische beeldverwerving</td></tr><tr><td>14-bit, ORCA II C4742-98 gekoelde camera</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td>Zeer gevoelig, gebruikt voor beeldvorming</td></tr><tr><td>Fluorescente filterkubus voor PI-detectie</td><td>Chroma Technology Corporation</td><td></td><td>Filterkubus specificaties: excitatiefilter 530-550 nm, dichroïsche spiegel 565 nm long pass en emissiefilter 600-660 nm</td></tr><tr><td>De Olympus Cell^P-besturingssoftware</td><td>Olympus</td><td></td><td>Software die wordt gebruikt om microscoop, gemotoriseerde stage, camera en beeldverwerving te bedienen</td></tr><tr><td>Matlab R2014B analysesoftware</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Gebruikt voor het ontwikkelen van een in-house grafische gebruikersinterface voor beeldanalyse</td></tr><tr><td>Excel-software</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Gebruikt voor gegevensbeheer, berekening, het maken van grafieken en statistieken</td></tr></tbody></table>

analyse van kanker cel invasie en anti-metastatische drug screening met behulp van hydrogel micro-kamer array (hmca)-op basis van platen

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates

Uitzaaiing van kanker is bekend dat het veroorzaken van 90% van kanker letaliteit. Metastase is een meertraps proces dat met de penetratie/invasie van tumorcellen in naburige weefsel start. Invasie is dus een cruciale stap in de metastase, waardoor de invasie proces onderzoek en de ontwikkeling van anti-metastatische drugs, veelbetekenend. Om aan deze vraag, er is een noodzaak om 3D in vitro modellen die imiteren van de architectuur van solide tumoren te ontwikkelen en hun communicatie nauwst aan in vivo staat aan de ene kant, maar op hetzelfde moment worden gereproduceerd, robuust en geschikt voor hoge opbrengst en hoog inhoud metingen. Op dit moment de meeste invasie testen leunen op geavanceerde microfluidic-technologieën die geschikt zijn voor onderzoek, maar niet voor hoog volume drug screening. Andere plaat-gebaseerde apparaten met geïsoleerde individuele spheroïden in elk putje testen zijn materiaal consumeren en lage steekproefgrootte per voorwaarde. Het doel van het huidige protocol is bedoeld als een eenvoudige en reproduceerbare biomimetische 3D cel-gebaseerde systeem voor de analyse van de capaciteit van de invasie in grote populaties van de tumor spheroïden. We ontwikkelden een 3D-model voor invasie assay gebaseerd op HMCA imaging plaat voor het onderzoek van de invasie van de tumor en anti-metastatische drugontdekking. Dit apparaat maakt de productie van talrijke uniforme spheroïden per putje (hoge steekproefgrootte per voorwaarde) omgeven door ECM-onderdelen, terwijl tegelijkertijd en continu observeren en meten van de spheroïden met één element voor medium resolutie throughput screening van anti-metastatische drugs. Dit platform wordt hier gepresenteerd door de productie van HeLa en MCF7 spheroïden voor het voorbeeldig voor eencellige en collectieve invasie. We vergelijken de invloed van de ECM component hyaluronzuur (HA) op de invasieve capaciteit van collageen rondom HeLa spheroïden. Tot slot, we kennismaken met Fisetin (invasie remmer) HeLa spheroïden en stikstofmonoxide (NO) (invasie activator) naar MCF7 spheroïden. De resultaten worden geanalyseerd door interne software waarmee semi-automatische, eenvoudige en snelle analyse die Multi-parameter onderzoek vergemakkelijkt.

De unieke HMCA imaging plaat wordt gebruikt voor de bepaling van de invasie van de 3D tumor spheroïden. De gehele assay, begint met de vorming van sferoïde en eindigt met het proces van de invasie en de extra manipulaties, wordt uitgevoerd binnen de dezelfde plaat. Voor de vorming van sferoïde, HeLa cellen zijn geladen in het bekken van de matrix en vestigen in de hydrogel MCs door de zwaartekracht. De hydrogel MCs, die hebben niet-aanhanger/lage bijlage kenmerken, faciliteren van de inte...

Een HMCA gebaseerde imaging plaat wordt gepresenteerd voor invasie assay prestaties. Deze plaat vergemakkelijkt de vorming van driedimensionale (3D) tumor spheroïden en het meten van kanker cel invasie in de extracellulaire matrix (ECM). De invasie assay kwantificering wordt bereikt door semi-automatische analyse.

Analyse van kanker cel invasie en anti-metastatische Drug Screening met behulp van Hydrogel Micro-kamer Array (HMCA)-op basis van platen

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor ...

Het doel van dit eenvoudige reproduceerbare biomimetische 3D-celgebaseerde systeem is om invasiecapaciteitsanalyse te vergemakkelijken bij grote populatie tumorsferoïde voor anti-gemetastaseerde geneesmiddelenscreening. Het belangrijkste voordeel van onze hydrogel micro-kamer array is dat het mogelijk maakt de productie van een groot aantal uniforme sferoïden die hetzelfde brandpuntsvlak per goed bevolken. De sferoïde positie blijft behouden als gevolg van de hydrogel micro-kamer array structuur, zelfs na extracellulaire matrix toevoeging, het vergemakkelijken van de nauwkeurige continue monitoring van de sferoïden en het invasieproces.Verder kan de morfologische karakterisering en fluorescerende kleuring van talrijke sferoïden en binnenvallende cellen ter plaatse worden uitgevoerd en op een tijdefficiënte manier met één element worden geanalyseerd. Het aantonen van de hydrogel micro-kamer array zes-goed beeldplaat productie procedure zal Maria Sobolev uit ons laboratorium. Ter voorbereiding van de hydrogel micro-kamer array platen, eerst voorverwarmen zes polydimethylsiloxaan, of PDMS, stempels tot 70 graden Celsius, en plaats een zes-goed, glazen bodem plaat op een droog bad voorverwarmd tot 75 graden Celsius gedurende enkele minuten.Wanneer de plaat warm is, giet een 400-microliter druppel van voorverwarmde laag-smeltende agarose op de bodem van elke put van de zes-put plaat, en voorzichtig plaats een stempel over elke druppel. Laat de setup vijf tot tien minuten afkoelen bij kamertemperatuur, gevolgd door 20 minuten bij vier graden Celsius voor volledige agarose gelatie. Wanneer de agarose is gestold, voorzichtig afpellen van de PDMS van elke put, waardoor de agarose gels patroon met micro-kamers.Nadat u de UV-lamp de hoogste intensiteit heeft laten bereiken, plaatst u de reliëfplaat gedurende drie minuten in het lichtverhardingssysteem en vult u de UV-gesteriliseerde macro-putten met steriele PBS. Bedek vervolgens de plaat en wikkel deze met Parafilm voor de opslag van vier graden Celsius tot gebruik. Om de cellen te laden, verwijder de PBS uit elke put, en voorzichtig laden 50 microliter van de cellen van belang op de top van elke hydrogel array.Na het toestaan van de cellen te vestigen door de zwaartekracht voor 15 minuten, zorgvuldig toe te voegen zes tot acht aliquots van 500 microliter van vers medium aan de rand van de macro-goed plastic bodem buiten de ring en hydrogel array. Incubeer de cellen voor de juiste periode bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide met vochtigheid voor de vorming van sferoïden. Breng de sferoïden vervolgens gedurende 10 minuten over in een bioveiligheidskap op ijs.Wanneer de plaat is afgekoeld, leun een pipet tip op de rand van de macro-well plastic bodem naast de hydrogel array, en verwijder al het medium uit de hele array. Verwijder vervolgens het medium uit de arraytank, leun een gel-loading pipet tip aan de rand van de array tank zeer zorgvuldig, oppassen niet te verstoren de micro-kamers en sferoïden. Gebruik vervolgens een voorgevroren, fijne pipettip om twee aliquots van 150 microliter van het collageenmengsel van belang aan de rand van de array één voor één toe te voegen, waardoor het mengsel langzaam wordt vrijgegeven om sferoïde dislocatie te voorkomen.Nadat de tweede ronde collageen aan elke put is toegevoegd, geven ze de sferoïden een uur terug naar de couveuse voor volledige gelatie van de extracellulaire matrix. Wanneer de matrix is gestold, voeg 400 microliter voorverwarmde 1%laag smeltende agarose op de top van de gel, en incubeer de plaat, bedekt bij kamertemperatuur, gedurende vijf tot zeven minuten, voordat koeling gedurende twee minuten op vier graden Celsius voor agarose gelatie. Dan, leunend de pipet op de rand van de macro-goed plastic bodem, voorzichtig voeg twee milliliter van volledige medium aan elke put.Om een invasietest uit te voeren, laadt u de microkamerarrayplaat van hydrogel op een gemotoriseerde omgekeerde microscoopfase die is uitgerust met een 37-graden Celsius en 5% koolstofdioxide-incubator met een bevochtigde atmosfeer, en gebruik een doelstelling van vier of 10x om de posities voor de beeldverwerving in elke put vooraf te bepalen, zodat het hele arraygebied zal worden beoordeeld. Verwerf vervolgens om de twee tot vieren om de twee tot vieren om een totaal van 24 tot 72 uur om de celinvasie van het sferoïde lichaam in de omringende extracellulaire matrix te volgen. Exporteer aan het einde van de afbeeldingsverwerving de time-lapse-afbeeldingen van de software voor het verkrijgen van afbeeldingen voor het opslaan in een gelabelde afbeeldingsbestandsindeling naar een speciale map.Open vervolgens de grafische gebruikersinterface en klik op Helder veld laden. Pas de segmentatieparameters van de afbeelding aan om een nauwkeurige segmentatie van de sferoïden en hun invasiegebieden te bereiken en klik op Segmentatie van regio's om een rand rond elke sferoïde te maken. Als de automatische segmentatie onjuist is, drukt u op Delete of Toevoegen en voert u handmatig de juiste correcties aan.Klik op Bijhouden om de sferoïden in elk van de time-lapse-afbeeldingen te nummeren. Klik vervolgens op Meten om een spreadsheet met alle parameters te genereren en sla de spreadsheet op in een geschikte indeling voor gegevensverwerking en statistische analyse. Om de invloed van hyaluronzuur op het spontane HeLa sferoïde invasieproces te onderzoeken, werden in dit experiment twee dagen gerijpte sferoïden bedekt met collageen en hyaluronzuurmengseloplossing en vergeleken met tweedaagse gerijpte sferoïden die alleen met collageenoplossing waren bedekt.Na 50 uur incubatie, de sferoïden ingebed in collageen en hyaluronzuur aangetoond een lagere cel dispersie in de omringende extracellulaire matrix in vergelijking met de sferoïden ingebed in collageen alleen. Inderdaad, analyse van de invasie gebied kinetiek na verloop van tijd voor 99 sferoïden op single-spheroid resolutie geeft duidelijk aan dat de toevoeging van hyaluronzuur aan het collageen remt cel dispersie uit de sferoïde, wat resulteert in kleinere invasie gebieden. Behandeling van de HeLa sferoïde cultuur met een bioactieve flavonoïde met cyto- en migrastatische eigenschappen gedurende 24 uur resulteert in een geremde celdispersie rond de sferoïden in vergelijking met niet-behandelde HeLa-sferoïden.Inderdaad, analyse van de invasie gebieden van 488 sferoïden aan het einde van het experiment bleek een aanzienlijke remming na de behandeling met zo weinig als 10 micromolar van het geneesmiddel. Door het lage bevestigingskenmerk van de hydrogel vergemakkelijkt deze microkamergebaseerde technologie de vorming van sferoïde, zelfs in gevallen van zeer weinig cellen. Dit is vooral voordeel in waardevolle beperkte kanker stam-achtige of patiënt-afgeleide primaire cel monsters.De hydrogel micro-kamer imaging plaat maakt het mogelijk analyse van de exacte ruimtelijke locatie van de sferoïden tijdens langdurige experimenten voor de evaluatie van het invasieproces op het niveau van één element en biedt een hoge mate van statistische robuustheid en nauwkeurigheid. Toekomstige toepassingen van deze methodologie omvatten side-by-side multi-cellculuring van tumor en stromale cellen in verschillende regio's binnen de macro-put en het ophalen van individuele sferoïden voor downstream moleculaire analyse.

analysis-cancer-cell-invasion-anti-metastatic-drug-screening-using

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Een real-time elektrische Impedantie Gebaseerd Techniek om invasie van endotheelcellen monolaag meten door Cancer Cells

This video describes an invasion assay using a three-chambered array based on electrical impedance. This technique measures the invasive potential of cancer cells under the influence of soluble factors secreted by the resident stromal cells in tumor microenvironments.

Three-Chambered Array-Based Impedance Assay: A Real-Time Analysis Technique to Assess Invasive Potential of Cancer Cells by Measuring Electrical Impedance

Deze methode evalueert de invasie van kankercellen uit sferoïden in een omringende 3D-matrix.  Sferoïden worden gegenereerd via de hanging drop-kweekmethode en vervolgens ingebed in een matrix bestaande uit basement membraanmaterialen en type I collageen.  Invasie uit de sferoïden wordt vervolgens gemonitord.

Een Cancer Cell Sferoïde Assay om Invasion beoordelen in een 3D-instelling

Deze studie meldt twee verschillende methoden voor de analyse van de invasie van de cel en migratie: de bepaling van Boyden kamer en de in vitro video Microscoop gebaseerde wondgenezing bepaling. De protocollen voor deze twee experimenten worden beschreven, en hun voor- en nadelen worden vergeleken.

Evaluatie van de invasie van de cel en het migratieproces: een vergelijking van de Video Microscoop gebaseerde kras wond Assay en de bepaling van Boyden kamer

De in vitro Cell Invasion assay wordt gebruikt om het potentieel van kanker metastasen te meten door het cellulaire potentieel voor invasie en migratie te kwantificeren met behulp van celkweek inserts met eiwit matrix. Cellen worden uitgedaagd om te migreren door de eiwit matrix en een poreus membraan, naar een chemoaantretant, en vervolgens gekwantificeerd door lichte microscopie.

Het gebruik van muizen-borstkanker tumor cellen in een in vitro invasie assay als een maat voor oncogene Celgedrag

In het tijdperk van immunotherapie en eencellige genomische profilering vereist kankerbiologie nieuwe in vitro en computationele hulpmiddelen voor het onderzoeken van de tumor-immuuninterface in een juiste spatiotemporale context. We beschrijven protocollen om tumor-immuun microfluïdische co-culturen te exploiteren in 2D- en 3D-instellingen, compatibel met dynamische, multiparametrische monitoring van cellulaire functies.

Microfluïdische co-cultuurmodellen voor het ontleden van de immuunrespons in in vitro tumormicro-omgevingen

Dit is een effectieve methode om te screenen op suppressors of drivers van kankermetastase. Cellen, getransduceerd met een expressiebibliotheek, worden geïnjecteerd in het kippen chorioallantoïsche membraan vasculatuur om gemetastaseerde kolonies te vormen. Kolonies met verminderde of verhoogde invasiviteit worden verwijderd, uitgebreid, opnieuw geïnjecteerd om hun fenotype te bevestigen en ten slotte geanalyseerd met behulp van sequencing met hoge doorvoer.

Ontdekking van gemetastaseerde regulatoren met behulp van een snel en kwantitatief intravital chick chorioallantoic membraanmodel

We beschrijven een aanpak om invasieve celsubpopulaties in realtime te detecteren en vast te leggen. Het experimentele ontwerp maakt gebruik van Real-Time Cellular Analysis door veranderingen in de elektrische impedantie van cellen te monitoren. Invasieve kanker, immuun-, endotheel- of stromale cellen in complexe weefsels kunnen worden vastgelegd en de impact van coculturen kan worden beoordeeld.

Real-time detectie en vastlegging van invasieve celsubpopulaties uit coculturen

Het huidige protocol beschrijft een experimenteel platform om de effecten van mechanische en biochemische signalen op chemotherapeutische reacties van patiënt-afgeleide glioblastoomcellen in 3D matrix-mimetische culturen te beoordelen met behulp van een op maat gemaakt UV-verlichtingsapparaat dat high-throughput photocrosslinking van hydrogels met instelbare mechanische kenmerken mogelijk maakt.

Hydrogel-arrays maken een verhoogde doorvoer mogelijk voor screeningseffecten van matrixcomponenten en therapeutica in 3D-tumormodellen

De CAM-Delam-test om de gemetastaseerde capaciteit van kankercellen te evalueren is relatief snel, eenvoudig en goedkoop. De methode kan worden gebruikt voor het ontrafelen van de moleculaire mechanismen die de vorming van metastase reguleren en voor het screenen van geneesmiddelen. Een geoptimaliseerde test voor het analyseren van menselijke tumormonsters zou een klinische methode kunnen zijn voor gepersonaliseerde kankerbehandeling.

CAM-Delam-test om gemetastaseerde eigenschappen te scoren door delaminatie en invasiecapaciteit van kankercellen te kwantificeren

Invasie is een belangrijk biologisch fenomeen bij de ontwikkeling en progressie van kanker. Dit proces wordt beïnvloed door niet-neoplastische cellen en componenten van de micro-omgeving van de tumor. Het doel van deze studie is het beschrijven van een alternatieve methode voor het analyseren van tumorcelinvasie in vitro met behulp van driedimensionale (3D) culturen.

Alternatieve strategie om in vitro celinvasie van 3D-culturen te analyseren

Leer een hydrogel micro-kamer array methode voor analyse van kankercel-invasie in 3D tumor sferoïden. Dit systeem maakt continue monitoring en high-throughput screening van anti-metastatische geneesmiddelen mogelijk.

Analyse van kanker cel invasie en anti-metastatische Drug Screening met behulp van Hydrogel Micro-kamer Array (HMCA)-op basis van platen (Video) | JoVE Journal

Analyse van kanker cel invasie en anti-metastatische Drug Screening met behulp van Hydrogel Micro-kamer Array (HMCA)-op basis van platen

Meer video's verkennen