Name: Visualiseren van Drosophila been Motor Neuron axonen via de volwassen cuticula (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Leer een protocol voor het visualiseren van axonale targeting in volwassen Drosophila poten met fluorescentie-eiwitten. Deze methode omvat fixatie, monteren en beeldvorming voor driedimensionale reconstructie van axonen en hun terminale vertakkingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We bedanken Robert Renard voor het opstellen van vliegen voedsel medium. Dit werk werd ondersteund door een NIH-subsidie NS070644 voor R.S.M. en financiering uit ALS vereniging (#256), FRM (#AJE20170537445) en ATIP-Avenir programma aan J.E.

1. been dissectie en fixatie
<ol><li>Neem een multi goed glasplaat en vul de juiste aantal putjes met 70% ethanol. Toevoegen van 15 – 20 CO2-narcose vliegen (van hetzij geslacht en elke leeftijd) aan elk goed en met behulp van een penseel, zachtjes schar de vliegen in de ethanol oplossing tot vliegen zijn volledig ondergedompeld. Opmerking: Deze stap is het verwijderen van de hydrophobicity van de cuticle bestaat. Niet wassen voor meer dan 1 min, want dit auto-fluorescentie van de cuticle bestaat verhoogt.</li>
	<li>Spoel de vliegen 3 keer met 0,3% nonionic oppervlakteactieve stof schoonmaakmiddel in 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Houd de vliegen in deze oplossing voor minstens 10 min. Opmerking: Zijn benen beter vast wanneer met inbegrip van wasmiddel, die waarschijnlijk zal toenemen van penetratie van de fixeerspray binnen het been.</li>
	<li>Plaats een multi goed plaat op het ijs samen met een buis van 4% paraformaldehyde (PFA). Opmerking: De voorbereiding van vers 4% PFA van een 16% PFA ethanol gratis stamoplossing is van cruciaal belang.</li>
	<li>Gebruik pincet te verwijderen van het hoofd en buik van de vliegen zonder beschadiging van het thoracale segment of de benen. Opmerking: Het verwijderen van de buik gemakkelijker te houden van de vlieg en het ontleden van de benen.</li>
	<li>Ontleden van de benen uit het thoracale segment met een tang en plaats de benen in de putjes met 4% PFA. Duw zachtjes maar stevig op de kruising van de coxa-thorax met het puntje van fijne pincet totdat het been los hiervoor.</li>
	<li>Corrigeer de benen in 4% PFA overnacht bij 4 ° C (ongeveer 20 h totaal).</li>
	<li>Wassen van de benen met 0,3% nonionic oppervlakteactieve stof schoonmaakmiddel in 1 x PBS, 5 x voor 20 minuten elk.</li>
	<li>Vervang de buffer wassen met montage medium. Houd het been montage medium voor ten minste een dag voorafgaand aan de montage te maken voor haar volledige penetratie in het been. Opmerking: Als het medium van de montage zeer viskeuze is, Verdun de montage middellange tot 80% met 1 x PBS omdat de plotselinge verandering in de viscositeit de cuticle samenvouwen en de algehele structuur van het been schade kan veroorzaken. Afhankelijk van het stuurprogramma Gal4 , kunnen vliegen worden bewaard voor 1 tot 3 weken bij 4 ° C in de montage media tot montage.</li>
</ol>2. leg montage
<ol><li>Plaats ongeveer 20 µL 70% glycerol aan de linkerkant van een microscoopglaasje en dek met een vierkante 22 x 22 mm2 dekglaasje aan (figuur 2A, B). Pipetteer ongeveer 10 µL van montage medium langs een lijn parallel aan en op een kleine afstand van de rechterrand van deze dekglaasje aan. Voeg een andere 30 µL van montage medium verder aan de rechterkant van de dia (figuur 2C). Opmerking: Bij de toepassing van een dekglaasje aan over de benen (zie hieronder) het montage medium zal zachtjes verspreid onder het dekglaasje aan en rond de benen zonder hen.</li>
	<li>Met behulp van fijne pincet heffen van het been van de oplossing en zet het zachtjes op de drager van de montage in de buurt van de linker dekglaasje aan. Doe hetzelfde voor elk been en lijnen van boven naar beneden (figuur 2D).<ol>
<li>Heffen en breng de benen in een druppel medium gehouden tussen beide uiteinden van de verlostang. Oriënteren van de benen op twee manieren: externe kant omhoog of omlaag.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zodra alle de benen (max. 6 – 8 benen kunnen worden gemonteerd) op de juiste manier worden uitgelijnd, zet een tweede dekglaasje aan over de benen zodat deze dekglaasje aan iets op het eerder geplaatste dekglaasje aan (figuur 2E berust) te maken voor de ruimte tussen het dekglaasje aan en het weefsel en voorkomen dat de benen van krijgen beschadigd (Figuur 2 g). Opmerking: Gebruik als alternatief sticker putten of orthodontische wax om ruimte tussen het dekglaasje aan en de dia te maken.</li>
	<li>Gebruik een nagellak teneinde de positie van de coverslips op elke hoek (figuur 2F). Opmerking: Het weefsel is nu klaar om het imago.</li>
</ol>3. beeldvorming
<ol><li>Instellen van een track met behulp van de 488 nm laser en twee detectoren tegelijkertijd zowel het GFP fluorescentie en de cuticula auto-fluorescentie te verkrijgen. Met behulp van de controle van het bereik of de schuifregelaar weergave in de spectrale venster van het lichtpad venster van de software, instellen het detectiebereik van één detector (detector 1) tussen 498 – 535 nm en die van de andere (detector 2) tussen 566-652 nm Opmerking: Doorgaans de detector 1 moet een detector GaAsP en de detector 2 een fotomultiplicator. Het kanaal van 498-535 optimaal detecteert GFP signaal maar ook detecteert automatisch fluorescentie van de epidermis. Het kanaal van 566-652 detecteert echter alleen de auto fluorescentie van de cuticle (figuur 3A).</li>
	<li>Gebruikt u een 20 X of 25 X olie onderdompeling doelstelling, resolutie van 1024 x 1024 pixels, 12-bit diepte en Z afstand instellen zoals 1 µm. Set pixel Nadruktijd tijd als ongeveer 1.58 µs en gemiddelde 2 frames/afbeelding. Doelstellingen met hoge numerieke diafragma hanteren.</li>
	<li>Stel alle andere instellingen, afhankelijk van de confocal microscoop en imaging software wordt gebruikt.<ol>
<li>Zorg ervoor om het verkrijgen van een helderder signaal van de epidermis van de detector 566-652 in plaats van de detector van 498 – 535. Om dit te doen, gebruik de dezelfde kracht van de laser van de 488-laser voor beide detectoren. Eerst de winst van de detector 1 te verkrijgen van een helder genoeg GFP-signaal (figuur 3B, D) met behulp van de markers van verzadiging, aanpassen. Pas vervolgens de winst van de detector 2 om ervoor te zorgen dat bepaalde gebieden met hoge cuticula signaal (randen van benen, gewrichten) een verzadigde signaal in deze detector (Figuur 3 c, E produceren).</li>
		<li>Als het been is uitgebreid en te groot is om het image worden gemaakt in een enkel frame, optie tegel of positie van de Microscoop denkbaar software.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reconstrueren de laatste beelden hetzij met behulp van de gepatenteerde Microscoop denkbaar software of het gebruik van ImageJ/FIJI freeware (zie hieronder).</li>
</ol>4. post Processing Imaging
<ol><li>Open de confocal stack in ImageJ/FIJI.<ol>
<li>Gebruik de Bioformats-plugin (Plugins | Bio-formaten | Bio-formats-importeur) in FIJI te openen van afbeeldingen die niet in. TIF-formaat van merkgebonden imaging software pakketten9.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De kanalen splitsen door het selecteren van de afbeelding | Kleur | Kanalen splitsen. Opmerking: Als de beelden vanuit verschillende posities werden gemaakt en moeten worden gerecombineerde, gebruiken de paarsgewijze stiksels plugin in FIJI van (Plugins > Stitching > paarsgewijs Stitching)10,11.</li>
	<li>Als u wilt aftrekken van het signaal van de epidermis van het GFP-signaal, open de afbeelding rekenmachine (proces | Afbeelding Calculator): Selecteer de stack in detector 1 als afbeelding 1 (GFP + schubbenlaag) (figuur 4A), selecteer aftrekkenop het operatie-venster en selecteer de stack in detector 2 als afbeelding 2 (schubbenlaag) (figuur 4B). Dientengevolge, wordt alleen het endogene GFP signaal (GFP) (figuur 4C) verkregen.<ol>
<li>Samenvoegen terug deze stapel (GFP) met de 'cuticula-only' stack verkregen detector 2 (figuur 4B afbeelding | Kleur | Kanalen verenigen) om een RGB-beeld bestaat uit het weefsel-specifieke GFP signaal evenals de cuticula signaal, dat helpt identificeren van de axon arbors binnen het been segmenten (Figuur 4 d).</li>
		<li>Contrast en helderheid van elke image (beeld | Aanpassen | Brightness/Contrast) en genereer vervolgens een één RGB-afbeelding (afbeelding | Type | RGB-kleur). Opmerking: Voor het genereren van een maximale projectie van de Z-stack (afbeelding | Stapels | Z Project...), maximale intensiteit projectie gebruiken voor het GFP-signaal en de gemiddelde intensiteit van de epidermis, die vervolgens kan worden aangepast voor helderheid voorafgaand aan het samenvoegen van de twee kanalen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>U kunt ook een macro gebruiken voor automatische aftrekken, en de verwerking van beelden in ImageJ/FIJI. Kopieer de tekst in aanvullende bestand 1 in de macro editor (Plugins | Nieuw | Macro), de macro opslaan in de map Plugins en ImageJ/FIJI eenmaal om de macro te kunnen starten.<ol>
<li>Als u de macro, open de confocal stack, en open het venster Helderheid/Contrast (Image| Aanpassen | Brightness/Contrast). Daarna de macro uitvoert (Plugin | Macro | Stormloop) en volg de instructies.</li>
		<li>Wanneer u wordt gevraagd om op te geven van de werking (afbeeldingsvenster rekenmachine), kies Afbeelding 1 stapel 1 (GFP), afbeelding 2 stapel 2 (schubbenlaag) en aftrekken. Opmerking: De macro genereert een maximale projectie-beeld van het verwerkte GFP-signaal (MAX_Result van stack1), een gemiddelde projectie van de cuticle (AVG_stack2), het resultaat van het aftrekken van de stack van de epidermis van het GFP-stack (resultaat van stack1), en de onverwerkte Cuticula stack (stack2).</li>
		<li>Wanneer u wordt gevraagd om aan te passen contrast, gebruik de besturingselementen in het venster/helderheid aanpassen van de helderheid/contrast van de afbeelding van de maximale projectie van GFP, en de gemiddelde projectie van de cuticle bestaat, voor het genereren van een RGB-samengevoegde afbeelding van beide signalen waaruit blijkt het GFP in groen en de epidermis in grijs. Samengevoegd resultaat van stack1, en stack2, ook het genereren van een gecombineerde GFP en cuticula stack die kan worden gebruikt in de volgende fase.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Om te visualiseren de benen in drie dimensies, door gespecialiseerde 3D software te gebruiken met de nieuw gegenereerde stacks (figuur 4E).<ol>
<li>Open de RGB-stack met 3D software (Zie Tabel van materialen). In het pop-up venster, selecteer alle kanalen in de modus conversie sectie en de grootte opgeven van een voxel (deel van een pixel). Opmerking: Alle nodige informatie is opgenomen in de afbeeldingsbestanden vanuit welke merkgebonden Microscoop software wordt gebruikt.</li>
		<li>Op kanaal 2 module (GFP signaal), klik met de rechtermuisknop en selecteer Display | volren. Klik vervolgens met de linkermuisknop op de volren module. In de sectie eigenschappen (linksonder in het scherm) klikt u op links op bewerken en selecteer volrengreen.col. Op kanaal 1 module (schubbenlaag signaal) met de rechtermuisknop op en selecteer Display | volren. Klik vervolgens met de linkermuisknop op de volren module. In de sectie Properties Klik met de linkermuisknop op Geavanceerd en selecteer ddr (een transparante radiografie-achtige scherm), vervolgens aanpassen de gammawaarde om te zien de cuticula achtergrond (figuur 4E).</li>
		<li>Voor het genereren van een 3D-rotatie, klik met de rechtermuisknop op de stapel van de projectmodule. Selecteer vervolgens animeren | draaien. Klik met de linkermuisknop op de draaien module.</li>
		<li>In de Eigenschappen sectie Klik op bbox center gebruiken. Op de draaien module met de rechtermuisknop op en selecteer berekenen | film maker. Klik op de film maker -module op de linker mouse button. Klik in de sectie Eigenschappen met de linkermuisknop links op Geavanceerd (rechtsboven van de sectie-eigenschappen).</li>
		<li>Vul in het veld bestandsnaam de naam van de rotatie van de film. Schrijf 1 (max kwaliteit) op het gebied van kwaliteit . Frame bij 200 verlaten indien een 8.3 s rotatie is gewenst (dit nummer kan worden verlaagd of verhoogd om te wijzigen van de snelheid van de rotatie). Drukt u vervolgens op toepassen (groene knop, linksonder in de sectie eigenschappen (Zie Video 1)).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+A+%22Biology+of+Drosophila%22">Biology of Drosophila</a>. Demerec, M. , John Wiley & Sons. New York, NY. 420-531 (1950).</li>
<li>Soler, C., Ladddada, L., Jagla, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+development+of+muscles+and+tendons+of+the+Drosophila+leg%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Coordinated development of muscles and tendons of the Drosophila leg.</a> Development. 131 (24), 6041-6051 (2004).</li>
<li>Baek, M., Mann, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+and+Birth+Date+Specify+Motor+Neuron+Targeting+and+Dendritic+Architecture+in+adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Lineage and Birth Date Specify Motor Neuron Targeting and Dendritic Architecture in adult Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 29 (21), 6904-6916 (2009).</li>
<li>Brierley, D. J., Rathore, K., VijayRaghavan, K., Williams, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+origins+and+architecture+of+Drosophila+leg+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Developmental origins and architecture of Drosophila leg motoneurons.</a> Journal of Comparative Neurology. 520 (8), 1629-1649 (2012).</li>
<li>Enriquez, J., Mann, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+Individual+Adult+Motor+Neuron+Morphologies+by+Combinatorial+Transcription+Factor+Codes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Specification of Individual Adult Motor Neuron Morphologies by Combinatorial Transcription Factor Codes.</a> Neuron. 86 (4), 955-970 (2015).</li>
<li>Mahr, A., Aberle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+pattern+of+the+Drosophila+vesicular+glutamate+transporter%3A+a+marker+protein+for+motoneurons+and+glutamatergic+centers+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expression+Patterns%22%5BJournal%5D)">The expression pattern of the Drosophila vesicular glutamate transporter: a marker protein for motoneurons and glutamatergic centers in the brain.</a> Gene Expression Patterns. 6 (3), 299-309 (2006).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+for+Drosophila+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends in Neuroscience. 24 (5), 251-254 (2001).</li>
<li>Enriquez, J., Rio, L. Q., Blazeski, R., Bellemin, S., Godement, P., Mason, C. A., Mann, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differing+Strategies+Despite+Shared+Lineages+of+Motor+Neurons+and+Glia+to+Achieve+Robust+Development+of+an+Adult+Neuropil+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Differing Strategies Despite Shared Lineages of Motor Neurons and Glia to Achieve Robust Development of an Adult Neuropil in Drosophila.</a> Neuron. 97 (3), 538-554 (2018).</li>
<li>ImageJ. Bio-Formats. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://imagej.net/Bio-Formats">http://imagej.net/Bio-Formats</a> (2018).</li>
<li>ImageJ. Image Stitching. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://imagej.net/Image_Stitching">http://imagej.net/Image_Stitching</a> (2018).</li>
<li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Globally+optimal+stitching+of+tiled+3D+microscopic+image+acquisitions%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions.</a> Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).</li>
<li>Brierley, D. J., Blanc, E., Reddy, O. V., Vijayraghavan, K., Williams, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+targeting+in+the+leg+neuropil+of+Drosophila%3A+the+role+of+midline+signalling+molecules+in+generating+a+myotopic+map%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Dendritic targeting in the leg neuropil of Drosophila: the role of midline signalling molecules in generating a myotopic map.</a> PLoS Biology. 7 (9), e1000199(2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De schubbenlaag van volwassen Drosophila en andere geleedpotigen, waarin vele donkere pigmenten, is een groot obstakel voor het bekijken van de structuren in hun lichaam. Het is bovendien sterk auto TL, die wordt verergerd door fixatie. Deze twee functies zijn zeer problematisch voor waarnemingen van fluorescente kleurstoffen of moleculen in het lichaam van dieren met een exoskelet.
De procedure die we hebben beschreven en die we regelmatig gebruiken in het lab levert schoon en gedetailleerde ...

Zoals de gewervelde ledematen, is de Drosophila volwassen poot onderverdeeld in segmenten. Elk vliegen been bevat 14 spieren, die bestaat uit meerdere spiervezels1,2. De organen van de cel van de volwassen been MNs bevinden zich in de T1 (prothoracic), (mesothoracic) T2 en T3 (metathoracic) ganglia aan elke kant van het ventrale zenuw snoer (VNC), een structurele analoog aan het gewervelde ruggenmerg (Figuur 1). Er zijn ongeveer 50 MNs in elke ganglia, welk doel spieren in vier segmenten van de ipsilaterale poot (coxa, trochanter, femur en tibia) (Figuur 1)3. Nog belangrijker is, heeft elke individuele volwassen been MN een unieke morfologische identiteit die is zeer stereotiep tussen dieren3,4. Alle deze unieke MNs zijn afgeleid van de 11 cellen van de stam, genaamd neuroblasten (NBs) been MNs produceren tijdens de larvale stadia3,4. Aan het einde van de larvale stadia van alle onderscheiden de onrijpe postmitotic MNs tijdens de metamorfose hun specifieke dendritische arbors en axonale terminal doelen die bepalen van hun unieke morfologie3,4te verwerven. Eerder testten we de hypothese dat een combinatorische code van transcriptiefactoren (TFs) Hiermee geeft u de unieke morfologie van elk Drosophila volwassen been MN5. Als een model, we gebruikten lineage B, één van de 11 NB lineages die zeven van de MNs produceert en aangetoond dat een combinatorische code van TFs uitgedrukt in postmitotic volwassen been MNs dicteert hun individuele morphologies. Door reprograming van de code van de TF van MNs is ons gelukt om over te schakelen van MN morphologies op een voorspelbare wijze. We noemen deze TFs: MTF's (morfologische TFs)5.
Een van de meest uitdagende onderdelen van de morfologische analyses van volwassen MNs is het visualiseren van de axonen door middel van een dikke en auto-belichting fluorescerende schubbenlaag met hoge resolutie. We meestal label axonen met een membraan-gelabeld GFP die wordt uitgedrukt in MNs met een binaire expressie systemen, zoals DVglut-Gal4/UAS-mCD8::GFP of DVglut-QF / QUAS mCD8::GFP, waar DVglut is een sterke driver uitgedrukt in motoneurons6. Door deze hulpmiddelen te combineren met andere klonen technieken zoals mozaïek analyse met een repressible marker (MARCM)7, cis-MARCM8of MARCMbow5, kunnen we de expressie GFP subpopulaties van MNs maken de fenotypische analyse beperken van axonen gemakkelijker. We hebben een protocol gegenereerd zodat been MN axonale morfologie intact voor beeldvorming en de daaropvolgende 3D reconstructie door het aanpakken van specifieke problemen inherent is aan de volwassen Drosophila been zoals (1) fixatie van de interne structuren van de volwassen poot zonder axon morfologie, endogene fluorescerende expressie, en been spieren, (2) montage van de poot voor het behoud van de algehele structuur onder een dekglaasje aan en in de juiste richting voor beeldvorming, en (3) beeldverwerking te verkrijgen van de epidermis achtergrond evenals axonale fluorescent signaal. Terwijl dit protocol heeft voor het opsporen van fluorescerende expressie in MN axonen zijn gedetailleerd, kan het worden toegepast om te visualiseren van andere onderdelen van been neuromusculature bij geleedpotigen.

```html
<table><tbody><tr><td>Ethanol absolute</td><td>Fisher</td><td>E/6550DF/17</td><td>Absolute analytische reagentiakwaliteit</td></tr><tr><td>Niet-ionogene oppervlakteactieve stof detergent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Triton X-100, voor moleculaire biologie</td></tr><tr><td>Fijne pincetten</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6521</td><td>Juwelierspinnen, Dumont Nr. 5</td></tr><tr><td>Glas multi-well plaat</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71563-01</td><td>9 holtes Pyrex, 100 mm x 85 mm</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Thermofisher</td><td>28908</td><td>Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-vrij</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP 229-1</td><td>Glycerol (Moleculair Biologie)</td></tr><tr><td>Spacers</td><td>Sun Jin Lab Co</td><td>IS006</td><td>iSpacer, vier putjes, ongeveer 12 &mu;L werkvolume per putje, 7 mm diameter, 0,18 mm diep</td></tr><tr><td>Vierkante 22 mm x 22 mm dekglasjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>FIS#12-541-B</td><td>Nr.1.5-0.16 tot 0.19 mm dik</td></tr><tr><td>Montagemedium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>Vectashield Antifade Montagemedium</td></tr><tr><td>Confocale microscoop</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>LSM780; objectief gebruikt LD LCI Plan-Apochromat 25X/0.8 Imm Korr DIC M27 (olie/ silicon/glycerol/water onderdompeling) (420852-9871-000)</td></tr><tr><td>Beeldvormingssoftware</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>ZEN 2011</td></tr><tr><td>3D-Beeldsoftware</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>Amira 6.4</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td><td>ImageJ/FIJI</td></tr></tbody></table>
```

visualiseren van drosophila been motor neuron axonen via de volwassen cuticula

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Het merendeel van de werkzaamheden op de neuronale specificatie is in genetisch en fysiologisch hanteerbare modellen zoals Cuitgevoerd. elegans Drosophila larven en vis, die alle golvend bewegingen (zoals kruipen of zwemmen) deelnemen als hun primaire wijze van voortbewegen. Echter een meer verfijnd begrip van de individuele motor neuron (MN) specificatie — ten minste op het gebied van de voorlichting van ziekte therapieën — vraagt om een even hanteerbare systeem dat beter de motoriek van complexe aanhangsel gebaseerde regelingen van modellen gewervelde dieren. Het volwassen Drosophila bewegingsstelsel belast met wandelen voldoet aan al deze criteria met gemak, aangezien in dit model is het mogelijk om te bestuderen van de specificatie van een klein aantal gemakkelijk DN been MNs (ongeveer 50 MNs per poot) beide met behulp van een enorme matrix van krachtige genetische hulpmiddelen, en in de fysiologische context van een aanhangsel gebaseerde locomotion-regeling. Hier beschrijven we een protocol om te visualiseren het been spier innervatie arm in een volwassen vlieg.

Zoals blijkt uit Figuur 4, kunnen deze procedure uitstekende beeldvorming van GFP-geëtiketteerden axonen in volwassen Drosophila benen, samen met hun terminal arbors. Nog belangrijker is wordt een schone GFP-signaal verkregen zonder elke besmetting van de fluorescentie die wordt uitgestraald door de cuticle been. Het signaal van de cuticle kan dan worden gecombineerd met het GFP-signaal om te identificeren de positie van axonen in de benen (<strong c...

Hier beschrijven we een protocol om te visualiseren de axonale richt met een TL proteïne in volwassen benen van Drosophila door fixatie, montage, imaging en na imaging stappen.

Visualiseren van Drosophila been Motor Neuron axonen via de volwassen cuticula

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila ...

Deze methode kan gemakkelijk worden aangepast voor het observeren van signalen van andere fluorescerende eiwitten of kan worden gebruikt om axonen beeld in andere volwassene Het belangrijkste voordeel van deze techniek te vergemakkelijken een uitstekende driedimensionale reconstructie en visualisatie van de axonen en hun terminale prieeltjes. Begin met het vullen van het juiste aantal putten in een glazen multi-well plaat met 70% ethanol. Gebruik een borstel om 15 tot 20 koolstofdioxide-verdoofde vliegen van elke leeftijd of geslacht toe te voegen aan elke put en zachtjes deppen van de vliegen in de ethanol totdat ze volledig zijn ondergedompeld.Na niet meer dan een minuut, spoel de vliegen drie keer met 0,3% niet-ionische oppervlakteactieve wasmiddel oplossing in fosfaat-gebufferde zoutoplossing gedurende ten minste 10 minuten per wasbeurt. Gebruik na de laatste wasbeurt tangen om het hoofd en de buik van elke vlieg te verwijderen zonder het thoracale segment of de benen te beschadigen en gebruik het puntje van een paar fijne tangen om voorzichtig maar stevig druk uit te oefenen op de coxa-thoraxverbinding om één been los te maken van het thoracale segment. Plaats de poten in een

visualize-drosophila-leg-motor-neuron-axons-through-the-adult-cuticle

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

We structurele kenmerken van de Glia-neuromusculaire synapsen beschreven in een roman Inside-out het prepareren van weefsels van levende larven gebruik van fluorescerende kleurstoffen met confocale microscopie. We leven zenuwuiteinden gelabeld met fluorescente primaire antilichamen tegen HRP, en ook gevisualiseerd het perisynaptic ruimte met fluorescerende dextranen.

Het visualiseren van de Live- Drosophila Gliale-neuromusculaire Junction met fluorescente kleurstoffen

Drosophila melanogaster larven zorgen voor een ideaal modelsysteem om de mechanismen van het axonaal transport te onderzoeken binnen de larvale segmentale zenuwen. Met behulp van deze procedure, kan 3 e instar larven dragen verschillende mutaties worden vergeleken met wild-type larven.

Visualisatie van larvale Segmentale zenuwen in 3 Rd Instar Drosophila Larvale Voorbereidingen

Dit protocol gaat in op de live-dissectie van...

In vivo visualisatie van synaptische blaasjes Binnen Drosophila larven Segmentale Axonen

De dendritische arborization sensorische neuronen van...

Morfologische Analyse van de Drosophila Larvale Perifere sensorische neuron dendrieten en axonen het gebruik van genetische Mozaïeken

In situ patch clamp opnamen worden gebruikt voor elektrofysiologische karakterisatie van neuronen in intacte circuits. In de Drosophila genetische model patch clamping is moeilijk omdat de CNS is klein en omgeven door een robuuste mantel. Dit artikel beschrijft de procedure om de schede en schoon neuronen voor latere patch clamp opnamen te verwijderen.

Bereiding van<em&gt; Drosophila</em&gt; Centraal Neuronen voor<em&gt; In situ</em&gt; Patch clamping

Deze video beschrijft een methode om het drosophila volwassen been te ontleden, te repareren en te monteren, terwijl het neuromusculatuur intact blijft voor beeldvormingsanalyse.

Verwerking van insectenpoten voor fluorescentiemicroscopie: een methode om neuromusculaire structuren voor beeldvorming te behouden

Source: Guan, W., et. al. Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle. J. Vis. Exp. (2018) This video demonstrates imaging of Drosophila legs with green fluorescent protein-expressing motor neurons using confocal microscopy. A laser and two detectors capture GFP and cuticle autofluorescence. Images are processed by splitting channels, subtracting autofluorescence, and merging into a colored composite image to visualize axons within the leg segment.

Imaging of Fluorescently-Labeled Motor Neurons in an Adult Drosophila Leg

Source: Jeong, S. Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the visualization of axonal projections in Drosophila embryos. Immunolabeling of motor neurons, precise dissection to expose neuronal structures, and differential interference contrast microscopy collectively reveal detailed neuronal architecture, emphasizing the axonal projection patterns.

Visualization of Axonal Projection Patterns of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Dit werk bevat een standaard immunohistochemie methode om motorische neuron projecties van late-16 Drosophila melanogaster embryo's te visualiseren . De gefiltreerde bereiding van vaste embryo's die gekleurd zijn met FasII antilichaam, biedt een krachtig instrument om de genen die nodig zijn voor motor axon pathfinding en target recognition tijdens neurale ontwikkeling te karakteriseren.

Visualisatie van het Axonal Projectiepatroon van Embryonische Motor Neuronen in<em&gt; Drosophila</em

We beschrijven een methode voor het retrograde traceren van de Drosophila embryonale motorneuronen met behulp van lipofiele fluorescerende kleurstoffen.

Retrograde tracing van Drosophila embryonale motor neuronen met behulp van lipofiele fluorescerende kleurstoffen

We beschrijven een dissectietechniek die de architectuur van de neuromusculaire overgang behoudt en een gedetailleerde immunocytochemische studie van motorneuronen in het volwassen Drosophila-been mogelijk maakt.

Dissectie en immunohistochemie van het Drosophila adult been om veranderingen op de neuromusculaire overgang voor een geïdentificeerd motorneuron te detecteren

Leer een protocol voor het visualiseren van axonale targeting in volwassen Drosophila poten met fluorescentie-eiwitten. Deze methode omvat fixatie, monteren en beeldvorming voor driedimensionale reconstructie van axonen en hun terminale vertakkingen.

Visualiseren van Drosophila been Motor Neuron axonen via de volwassen cuticula

Meer video's verkennen