Name: De MUB40 Peptide voor gebruik bij de opsporing van ontsteking neutrofiele-gemedieerde gebeurtenissen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Leer hoe u neutrofielen detecteert met het MUB40-peptide in levende en gefixeerde weefsels. Deze methode maakt specifieke labeling en visualisatie van granulaire secretie mogelijk voor onderzoek naar ontstekingsziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de Fondation Laurette Fugain (LF-2015-15) (B.S.M.) en ANR JCJC verleent (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.).

Alle methoden die hier worden beschreven zijn herzien en goedgekeurd door de Franse organisaties CoRC (Comité de Recherche Clinique), CPP (Comité de Protection des Personnes) en CNIL (Commissie Nationale Informatique et Liberté).
1. vlekken neutrofielen in histopathologie weefsel met Fluorescently geëtiketteerd MUB40
<ol><li>Voor het verkrijgen van het weefsel voor histopathologisch onderzoek, vast weefsel/biopsie secties in een geschikt volume van 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 30 minuten tot 4 uur afhankelijk van de dikte van het monster. Leg de monsters in een koelkast 4 ° C tijdens fixatie. Opmerking: Alternatieve fixatie methoden/tijdsinstellingen kan worden vervangen op basis van de unieke behoeften van de gebruiker.<ol>
<li>De PFA verwijderen, toevoegen van 16% sacharoseoplossing met genoeg volume ter helemaal dekking van het monster en leg het monster bij 4 ° C gedurende 4 h tot overnachting.</li>
		<li>16% sacharoseoplossing verwijderen en toevoegen van 30% sacharoseoplossing op een groot genoeg volume ter helemaal dekking van het monster, en plaats deze bij 4 ° C gedurende 4 h tot overnachting.</li>
		<li>Verwijder de 30% sacharoseoplossing en vlek uit overtollige oplossing van het weefsel met een papieren handdoek. Plaats de weefselsectie in optimale scherpe temperatuur (OCT) media en module-freeze in 2-methylbutane gekoeld in een bad van droogijs-ethanol (-72 ° C). Zodra bevroren solide (na ~ 2 min), Verwijder blokken van de 2-methylbutane en leg ze op droog ijs totdat alle blokken afgewerkt en klaar voor langdurige opslag zijn. Winkel de bevroren blokken bij-80 ° C voor langdurige opslag.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De nacht voordat weefsel blokken zijn om te worden gesneden, verwijder ze uit de diepvries-80 ° C en plaats ze bij-20 ° C's nachts tot equilibreer.<ol>
<li>Met behulp van een cryostaat, OCT-embedded weefsel in 10 - tot 30 μm-dikke plakjes gesneden en adsorberen aan kwalitatief hoogwaardige glazen dia's. Opmerking: Afhankelijk van de experimentele vereisten kunnen dikker of dunner segmenten worden gebruikt.</li>
		<li>Met een wax pen of andere hydrofobe methode, tekent u een vak rond het weefsel segment op het glasplaatje en laten drogen.</li>
		<li>Bereiden de kleurstofoplossing door het uitvoeren van een verdunning 1:1,000 MUB40-Cy5 (of andere tl MUB-versie40, 1 mg/mL stockoplossing) in 0,1% saponine-PBS oplossing. De optimale eindconcentratie voor MUB40 moet 1 μg/mL. Opmerking: Lagere eindconcentraties mogen worden gebruikt (0.1-0,01 μg/mL) maar kan leiden tot lagere signaal intensiteit. Let op: Saponine poeder kan irritatie van ademhaling. Zorg ervoor dat wegen saponine in een kast of beschermde gebied. Alternatieve permeabilization methoden kunnen worden gebruikt zoals Triton. Extra markeertekens toevoegen bij fabrikant-recommended concentraties (bv., 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), phalloidin, fluorescerende antilichamen).</li>
		<li>Voorzichtig Dompel het glasplaatje in een oplossing van 0,1% saponine-PBS driemaal.</li>
		<li>Zorgvuldig blot weg overtollige vocht rond de weefselsectie en genoeg kleurstofoplossing om het volledig bedekt de weefselsectie toevoegen. Plaats de dia in een kamer vochtigheid te voorkomen van verdamping en het Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Houd het beschermd tegen licht.</li>
		<li>Voorzichtig Dompel de dia in 0,1% saponine-PBS oplossing 3 x. Vervolgens voorzichtig Dompel de dia in PBS oplossing 3 x. Ten slotte, voorzichtig Dompel de dia in gedestilleerd H2O 3 x. Zorgvuldig droog overtollige vloeistof uit de dia.</li>
		<li>Voeg een kleine hoeveelheid (~ 20 μL) van montage medium (20 mM Tris pH 8.0, 0,5% N-propyl gallaat, 90% glycerol) naast het weefsel segment en voorzichtig vast een glas dekglaasje aan bovenop het glasplaatje. Zacht en gelijkmatig druk op het dekglaasje aan op de weefselsectie en, met behulp van een papieren handdoek, verwijder voorzichtig alle montage-media die gesteenten langs de randen van het dekglaasje aan.</li>
		<li>Plaats de gekoppelde dia in een donkere kast gedurende 24 uur om de media van de montage te stollen. Als alternatief, plaatst u de gekoppelde dia bij 37 ° C gedurende 1 uur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het imago van de plakjes weefsel op een fluorescente microscoop volgens de gewenste overname-methode.</li>
</ol>2. visualisatie van neutrofiele activering met Retro-Inverso-MUB40-Cy5 Peptide
<ol><li>Het verkrijgen van menselijke neutrofiele granulocyten met behulp van de onderstaande voorschriften. Voorbereiding van de volgende oplossingen en plaats ze in een zuurstofvrije kabinet overnachting. Blootstelling aan zuurstof zullen beginnen te activeren van neutrofielen en verdere induceren16,17van de dood van de cel. Opmerking: Neutrofiele granulocyten kunnen ook gezuiverd worden "op de Bank" voor MUB40-labeling experimenten; echter, Let erop dat zuurstof blootstelling beginnen zal te beïnvloeden neutrofiele activering.<ol>
<li>Bereid de volgende oplossing: Oplossing 1 [natriumchloride (NaCl) 0.9%]: Meng 4.5 g NaCl 500 mL H2O. Filter de oplossing. Oplossing 2 (dextran 6%): 6 g dextran in NaCl 0,9% oplossing toevoegen aan 100 mL. Oplossing 3 (wassen buffer): Los ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) in PBS pH 7,2 tot een uiteindelijke concentratie van het EDTA van 2 mM. Onmiddellijk vóór gebruik, ontbinden bovien serumalbumine (BSA) in PBS/EDTA-oplossing zodanig zijn dat de uiteindelijke concentratie van de BSA 10% w/v.</li>
		<li>Centrifugeren van bloed collectie buizen bij 650 x g gedurende 20 min zonder pauzes.</li>
		<li>Zonder te onderbreken gescheiden bloed, door het bloed collectie buizen te overbrengen in een zuurstofvrije kabinet en verzamelen plasma breuken (boven) in een conische tube van 50 mL.</li>
		<li>Verwijder de plasma-bevattende buis uit de zuurstofvrije kabinet en centrifugeer bij 2900 x g gedurende 20 min met pauzes aan de bloedplaatjes pellet.</li>
		<li>Zonder de Ingehuld bloedplaatjes verstoren, transfer zachtjes de plasma buis terug in de zuurstofvrije kabinet en Pipetteer de bloedplaatjes arme plasma in een tube van de verse 50 mL (hierna genoemd "plasma").</li>
	</ol>
</li>
	<li>Scheiding van de rode bloedcellen van leukocyten<ol>
<li>Met behulp van de buizen met de rode bloedcellen (RBC) uit stap 2.1.3., combineren de RBC in een conische 50 mL-buis (5 bloed collectie buis inhoud per tube 50 mL).</li>
		<li>Voeg NaCl 0,9% totdat het totale volume 44 mL bereikt. Voeg 6 mL dextran 6% (laatste).</li>
		<li>Meng het mengsel bloed/dextran zachtjes door het omkeren van de buis 10 - 20 keer. Laat het sediment buis voor minstens 30 min.</li>
		<li>Terwijl de sedimentatie plaatsvindt, bereiden een Percoll verloop door toevoeging van 4.2 mL van Percoll oplossing aan 5,8 mL plasma in een conische tube van 15 mL en meng goed door het omkeren van de buis.</li>
		<li>Het bovenste deel van de dextran verzamelen terwijl het proberen om te voorkomen dat pipetting rode bloedcellen.</li>
		<li>Draai de schroefdop, verwijderen de dextran buis uit de zuurstofvrije zaal en centrifugeer de buis bij 300 x g gedurende 10 minuten met pauzes.</li>
		<li>Zorgvuldig plaats de buis terug in de zuurstofvrije kamer zonder verstoring van de Ingehuld cellen, en verwijder de vloeistof via pipetteren.</li>
		<li>Zachtjes resuspendeer de cel pellet in 1 mL plasma en voeg heel langzaam naar de top van de Percoll oplossing. Wees voorzichtig niet voor het opwekken van de vermenging van de lagen wanneer pipetteren de cellen op de top.</li>
		<li>Verwijder voorzichtig de Percoll oplossing buis uit de zuurstofvrije kamer (het vermijden van mengen) en centrifugeer bij 800 x g gedurende 20 min zonder pauzes. Perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) zal blijven op het oppervlak van de oplossing Percoll en neutrofielen zal pellet met de RBC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwijdering van verontreiniging van RBC<ol>
<li>Bereiden van 14 mL bufferoplossing te wassen door toevoeging van 700 μL PBS + 10% BSA tot 14 mL buffer te wassen.</li>
		<li>Plaats de buis van de oplossing Percoll terug in de zuurstofvrije kamer. Verwijder de Percoll en de PBMCs via pipetteren en resuspendeer de Ingehuld cellen in 1 mL bufferoplossing te wassen. De pellet opnieuw geschorst worden zal een rode kleur als gevolg van contaminerende RBC hebben.</li>
		<li>200 μL van anti-CD235a (glycophorin) magnetische kralen aan het opnieuw gesuspendeerde cellen toevoegen, voorzichtig mengen en incubeer gedurende een minimum van 15 min. Deze stap laadt de besmettende RBC met magnetische kralen zodat ze kunnen worden verwijderd.</li>
		<li>Wash de scheiding kolom met 2 mL wassen buffer 3 x.</li>
		<li>Houd een conische tube van 15 mL onder de kolom scheiding en Pipetteer langzaam de neutrofiele/RBC mengsel naar de top van de kolom. De cellen in de conische tube van 15 mL verzamelen als ze doorstromen. De doorstroming moet bewolkt en verliezen de rode kleur als gevolg van de RBC resterende gebonden aan de kolom.</li>
		<li>Voeg toe 2 mL buffer naar de top van de kolom te wassen en verzamelen in de dezelfde conische tube van 15 mL. Tegen het einde van the wash van 2 mL moet de doorstroming duidelijk zijn, wat betekent dat alle de neutrofielen zijn verzameld.</li>
		<li>Meng voorzichtig de buis om te zorgen voor gelijkmatige verdeling van neutrofielen en verzamelen van 10 μL voor het tellen van de cel. Opmerking het eindvolume voor cel tellen van doeleinden. Het totale aantal cellen met een standaard cel tellen methode opsommen</li>
		<li>Verwijder de neutrofiele buis uit de zuurstofvrije kamer en centrifugeer de neutrofielen bij 300 x g gedurende 20 min met pauzes.</li>
		<li>Gesedimenteerd neutrofielen terug in de zuurstofvrije kamer plaatsen en verwijderen van de buffer wassen via pipetteren. Resuspendeer de pellet neutrofiele in plasma met een maximale celdichtheid van 107 PMN/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Opsomming van gezuiverde neutrofielen en visualisatie met MUB40<ol>
<li>Voeg 1 μl van RI-MUB40-Cy5 (1 mg/mL) tot 1 mL van Rosewell Park Memorial Instituut (RPMI) 1640 medium zonder fenol rood. Meng door pipetteren goed.</li>
		<li>Voor de toepassing van dit protocol, is het resultaat beschreven als een krachtige neutrofiele activeren reagens, N-formylmethionyl-leucyl-fenylalanine (FMLP), is toegevoegd. Voeg 1 μm van FMLP aan de RPMI/RI-MUB40-Cy5 buis en mengeling via pipetteren op en neer. Opmerking: Elke experimentele procedure zullen afwijken van dit punt naar voren, afhankelijk van de vragen.</li>
		<li>Breng de 1 mL RPMI/RI-MUB40-Cy5/FMLP mengsel een glazen bodem microscopie schotel. Toevoegen aan dit gerecht, een volume van gezuiverde cellen overeenkomt met 106 totaal neutrofiele granulocyten. Meng door zachtjes pipetteren.</li>
		<li>Zet de schotel in een omgekeerde fluorescente microscoop en beeldacquisitie beginnen. Bijvoorbeeld, is het aanbevolen om het verwerven van basislijn beelden voordat het prestatiemeteritembestand van een reagens neutrofiele-activeren zoals FMLP of bacteriën. In dit voorbeeld start de overname van RPMI/RI-MUB40-Cy5/neutrofielen, en op een later timepoint, Pipetteer het reagens neutrofiele-activeren in de glazen schotel en beeldacquisitie blijven. Opmerking: Wijzigingen in deze stappen kunnen worden gemaakt op basis van wetenschappelijke behoeften.</li>
		<li>Proces verkregen beelden/one-time-lapse films zoals heeft betrekking op de specifieke Microscoop gebruikt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+and+immunity%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li>
<li>Nicolás-Ávila, J. Á, Adrover, J. M., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+Homeostasis%2C+Immunity%2C+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in Homeostasis, Immunity, and Cancer.</a> Immunity. 46 (1), 15-28 (2017).</li>
<li>Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+cancer%3A+neutral+no+more%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in cancer: neutral no more.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).</li>
<li>Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+function+in+inflammation+and+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases.</a> Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).</li>
<li>Glennon-Alty, L., Hackett, A. P., Chapman, E. A., Wright, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+and+redox+stress+in+the+pathogenesis+of+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neutrophils and redox stress in the pathogenesis of autoimmune disease.</a> Free Radical Biology & Medicine. , (2018).</li>
<li>Borregaard, N., Cowland, J. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9160655">Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte.</a> Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).</li>
<li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%2C+from+marrow+to+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Neutrophils, from marrow to microbes.</a> Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).</li>
<li>Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Ly6C%2FLy6G-based+strategy+to+analyze+the+mouse+splenic+myeloid+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment.</a> Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).</li>
<li>Shi, C., Hohl, T. M., Leiner, I., Equinda, M. J., Fan, X., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ly6G%2B+neutrophils+are+dispensable+for+defense+against+systemic+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Ly6G+ neutrophils are dispensable for defense against systemic Listeria monocytogenes infection.</a> Journal of Immunology. 187 (10), 5293-5298 (2011).</li>
<li>Albanesi, M., Mancardi, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+mediate+antibody-induced+antitumor+effects+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Neutrophils mediate antibody-induced antitumor effects in mice.</a> Blood. 122 (18), 3160-3164 (2013).</li>
<li>Anderson, M. C., Chaze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MUB40+Binds+to+Lactoferrin+and+Stands+as+a+Specific+Neutrophil+Marker%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+biology%22%5BJournal%5D)">MUB40 Binds to Lactoferrin and Stands as a Specific Neutrophil Marker.</a> Cell Chemical biology. 25 (4), 483-493 (2018).</li>
<li>Coïc, Y. -M., Baleux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+specific+colonic+mucus+marker+using+a+human+commensal+bacterium+cell+surface+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Design of a specific colonic mucus marker using a human commensal bacterium cell surface domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15916-15922 (2012).</li>
<li>Roos, S., Jonsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-molecular-mass+cell-surface+protein+from+Lactobacillus+reuteri+1063+adheres+to+mucus+components%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">A high-molecular-mass cell-surface protein from Lactobacillus reuteri 1063 adheres to mucus components.</a> Microbiology. 148, Pt 2 433-442 (2002).</li>
<li>Boekhorst, J., Helmer, Q., Kleerebezem, M., Siezen, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+proteins+with+a+mucus-binding+domain+found+exclusively+in+lactic+acid+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of proteins with a mucus-binding domain found exclusively in lactic acid bacteria.</a> Microbiology. 152, Pt 1 273-280 (2006).</li>
<li>Mancardi, D. A., Jönsson, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+Edge%3A+The+murine+high-affinity+IgG+receptor+Fc%CE%B3RIV+is+sufficient+for+autoantibody-induced+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cutting Edge: The murine high-affinity IgG receptor FcγRIV is sufficient for autoantibody-induced arthritis.</a> Journal of Immunology. 186 (4), 1899-1903 (2011).</li>
<li>Walmsley, S. R., Print, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-induced+neutrophil+survival+is+mediated+by+HIF-1alpha-dependent+NF-kappaB+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-induced neutrophil survival is mediated by HIF-1alpha-dependent NF-kappaB activity.</a> Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 105-115 (2005).</li>
<li>Monceaux, V., Chiche-Lapierre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoxia+and+glucose+supplementation+preserve+neutrophil+viability+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Anoxia and glucose supplementation preserve neutrophil viability and function.</a> Blood. 128 (7), 993-1002 (2016).</li>
</ol>

B.S.M. wordt vermeld als een uitvinder op MUB40 octrooien:
MUB40: Europees Patent EP11290403.2, 09/09/2011.
RI-MUB40: Europees octrooi EP no. 17306746.3, 11/12/17.

Hier zijn twee tests beschreven waarin de MUB40 peptide wordt gebruikt om te studeren neutrofiele ontsteking en activering. Laten we zien hoe MUB40 kan onthullen neutrofielen presenteren in histopathologie secties of hun activeringsstatus met behulp van live gezuiverde neutrofielen weergeven. De kritische stappen voor het gebruik van MUB40 als een kleuring reagens zijn hetzelfde als met elke andere tl detectiemethode. Zorg moet men zich ervan vergewissen van de compatibiliteit van fluores...

Neutrofielen zijn een van de belangrijkste takken van het aangeboren immuunsysteem en routinematig worden gerekruteerd voor de sites van ontsteking rond het lichaam. De studie van neutrofielen heeft geschaad grotendeels door hun korte levensduur in vitro (minder dan 8 h) en beperkte detectieprogramma's onder basale omstandigheden of na activering. Hier presenteren we een uitgebreid geteste protocol voor de brede en specifieke detectie van zoogdieren neutrofielen in vaste/permeabel monsters. We bieden ook een gedetailleerd protocol voor live neutrofiele granulocyten met MUB40kleuring. Met behulp van de live neutrofiele kleuring protocol, kunnen het tijdstip en de locatie van neutrofiele activering worden gelokaliseerd. Dit protocol is ideaal voor onderzoekers die willen studeren neutrofiele activering of submodule release. Buiten hun antimicrobiële functies, worden neutrofielen nu gewaardeerd als immunomodulerende cellen betrokken bij een breed scala van ziekten en immuunrespons (aangeboren en adaptief)1,2. Neutrofielen zijn aanwezig in de meest opruiende weefsels, op hoge aantallen in geïnfecteerde weefsels, inflammatoire tumoren3, tijdens IBS en ziekte van Crohn flare-ups4, en op gebied van niet-infectieuze ontstekingen zoals de synovia van reumatoïde artritis ( RA) patiënten5. Neutrofielen bevatten vier klassen van pre-gevormde korrels genaamd azurophil (α), specifieke (β1), tertiaire (β2) korrels en secretoire blaasjes (γ)6. Na de migratie naar een inflammatoire site, aangeworven neutrofielen worden geactiveerd en opeenvolgend afscheiden submodule inhoud (samengesteld uit hechting, antimicrobiële verbindingen en immunomodulerende moleculen), die bevordert verder werving en draagt bij aan infectie resolutie (maar ook voor host weefselschade)7. Terwijl neutrofielen worden beschouwd als een kritiek aspect van aangeboren immuniteit, tot op heden er zijn paar detectie reagentia beschikbaar voor deze bestuderen, en nog minder dat kan worden gebruikt voor het beoordelen van de activeringsstatus van levende neutrofiele granulocyten.
Huidige methoden voor het opsporen van neutrofielen afhankelijk van monoklonale antilichamen tegen celoppervlak blootgestelde antigenen, zoals Ly - 6 G2 of eiwitten specifiek opgeslagen in neutrofiele korrels onder basale omstandigheden (bijvoorbeeld myeloperoxidase gegenereerd Lactoferrine). Voordelen van monoclonal antilichamen zijn hun sterke bindende, gevoeligheid en veelzijdigheid onder verschillende omstandigheden van de test. Er zijn echter ook verschillende nadelen aan het gebruik van monoklonale antilichamen en anti-Ly - 6G in het bijzonder. Deze nadelen zijn de specificiteit, zoals Ly - 6G is aanwezig op een meerderheid van myeloïde cellen in het beenmerg en op alle granulocyten met inbegrip van de eosinofielen; zo, neutrofielen van eosinofielen ontcijferen met deze markering vereist meer complexen benaderingen8. Een andere frequente afweging met monoklonale antilichamen is hun vaak beperkte host gastheerspecificiteit, waardoor vergelijking studies met meer dan één diersoort omvat moeilijk. Een derde nadeel van antilichaam detectiemethoden, vooral bij het gebruik van levende cellen of in vivo, is hun potentieel voor het verstoren van de functie cel of leiden tot cel activatie. Bijvoorbeeld, is de administratie van anti-Ly - 6G te muizen vaak toegepast op neutrofiele uitputting en voorbijgaande neutropenie9. Bovendien is gebleken dat antilichaam injectie neutrofiele antitumorale functie10kan stimuleren. Tot slot, de opsporing van antilichamen van neutrofielen niet onthullen de activeringsstatus van de cel.
We hebben een 40-amino acid peptide genaamd MUB40, die kan worden gebruikt in een aantal testen om label neutrofielen in vitro of in vivo voorwaarden evenals de activeringsstatus van levende neutrofielen11assay aangemerkt. MUB40 is afgeleid van de MUB7012, een domein van de Lactobacillus reuteri oppervlakte slijm-bindend-proteïne oorspronkelijk beschreven voor haar vermogen om te binden slijm13,14. MUB40 interageert met geglycosyleerde lactoferrine die aanwezig is bij hoge concentraties in neutrofiele-specifieke en tertiaire korrels. MUB40 kunt worden blootgesteld aan deze submodules standaard permeabilization stapsgewijs aanwezig in histopathologie of fluorescentie-activated cell sorting (FACS) protocollen voor robuuste kleuring van vaste neutrofiele granulocyten. Wanneer live neutrofielen in een geïnactiveerd staat worden gehouden, de MUB40 peptide is uitgesloten van de inhoud van de submodule en cellen doen geen positieve vlekken met de markering. Na activatie, kan MUB40 binden aan blootgestelde lactoferrine en leiden tot robuuste kleuring met de peptide. Dus, MUB-40 mag worden gebruikt om de activeringsstatus van gezuiverde neutrofiele granulocyten, waardoor het een aantrekkelijke marker om de besmettelijke proces te volgen. Het vermogen om te binden aan het leven van geactiveerde neutrofiele granulocyten kan ook MUB40 worden gebruikt als een instrument om te controleren op gebieden van neutrofiele ontsteking in levende dierlijke modellen (bijvoorbeeld een muis artritis model15). De protocollen in dit manuscript detail hoe fluorescently label MUB40 kunnen worden gebruikt om te onthullen van de neutrofielen in histologie weefsels en hoe de activering van levende gezuiverde neutrofielen in vitroassay.

<table><tbody><tr><td>MUB40-Cy5</td><td>Benoit Marteyn</td><td>benoit.marteyn@pasteur.fr</td><td>Fluorescent MUB40 peptide (beschikbaar met andere geconjugeerde fluoroforen)</td></tr><tr><td>RI-MUB40-Cy5</td><td>Benoit Marteyn</td><td>benoit.marteyn@pasteur.fr</td><td>Retro-inverso fluorescerend MUB40 peptide. Gesynthetiseerd met D-aminozuren en resistent tegen proteasen (beschikbaar met andere geconjugeerde fluoroforen)</td></tr><tr><td>Parformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16005</td><td>Fixeermiddel voor histologie</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td>Oplossing gebruikt om overtollig PFA te verwijderen</td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)</td><td>Sakura Finetek USA</td><td>4583</td><td>Gebruikt om weefsel te bevriezen voor cryostat secties</td></tr><tr><td>2-Methylbutaan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M32631</td><td>Gebruikt om weefsel te bevriezen voor cryostat secties</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00974</td><td>Gebruikt voor droogijsbad om weefsel te bevriezen</td></tr><tr><td>Leica Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM1520</td><td>Gebruikt om weefsels te snijden</td></tr><tr><td>Glasmijkroscoopglaasjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-518-101</td><td></td></tr><tr><td>Dekglasjes</td><td>Thor Labs</td><td>CG15CH</td><td>Precisiedeksel</td></tr><tr><td>Dako pen&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821</td><td>Gebruikt om vloeistofverlies te voorkomen tijdens weefselkleuring</td></tr><tr><td>Saponine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td>Gebruikt om cellen te permeabiliseren voor IF-kleuring</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10236276001</td><td>Kleurt DNA&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td>Bindt aan actine</td></tr><tr><td>Prolong Gold antifade Mountant</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td>Verlengt IF-signaal en weerstand tegen fotobleken</td></tr><tr><td>Fluorescente microscoop</td><td>Diverse</td><td>Diverse</td><td>Gebruikt om IF-plaatjes te bekijken</td></tr><tr><td>Anoxiekast</td><td>Diverse</td><td>Diverse</td><td>Gebruikt voor de zuivering van levende geïnactiveerde neutrofielen</td></tr><tr><td>Natriumchloride NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>Wasbuffercomponent</td></tr><tr><td>MACS BSA-buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td>Wasbuffercomponent</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4937</td><td>Gradient voor neutrofielen zuivering</td></tr><tr><td>CD235a glycophorine magnetische microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-501</td><td>Gebruikt om besmettende RBC's te verwijderen</td></tr><tr><td>LS-kolommen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Gebruikt bij het verwijderen van RBC's van neutrofielen</td></tr><tr><td>RPMI-1640 zonder Fenolrood</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8755</td><td>Gebruikt voor neutrofielen assays</td></tr></tbody></table>

de mub40 peptide voor gebruik bij de opsporing van ontsteking neutrofiele-gemedieerde gebeurtenissen

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

Wij bieden hier een protocol met betrekking tot het gebruik van MUB40, een gesynthetiseerde peptide met de mogelijkheid om het binden van geglycosyleerde lactoferrine opgeslagen in hoge concentraties in specifieke en tertiaire korrels van neutrofiele granulocyten. De gegevens van dit protocol hoe MUB40 geconjugeerd rechtstreeks met een fluorophore kunnen worden gebruikt om vlek neutrofielen in vaste/permeabel weefsels zo goed hoe dit kan worden gebruikt in het leven-cel imaging om assay voor neutrofiele activering en ambtshalve korreling. Neutrofiele detectiemethoden zijn beperkt tot soortspecifieke monoclonal antilichamen, die niet altijd geschikt voor bepaalde toepassingen zijn. MUB40 doet niet doordringen in het celmembraan en is dus uitgesloten van lactoferrine opgeslagen in niet-geactiveerd/niet-permeabel neutrofiele granulocyten. MUB40 heeft het extra voordeel van de erkenning van lactoferrine uit een brede gastheer, waardoor het vooral handig voor het vergelijken van resultaten in studies meerdere onderzoeksmodellen, waarbij het aantal dubbele reagentia te verminderen, en vereenvoudiging van de protocollen via-voor-stapmodus kleuring.

Resultaten van de MUB40-gebeitst weefsels van een histopathologisch onderzoek dia's onthullen meestal afzonderlijke cellen verspreid over het weefsel. MUB40 vlekken lactoferrine, die aanwezig is in neutrofiele korrels en verzuilde. Dus meestal gezien punctate kleuring of verschillende grote gescheiden gebieden van signaal afkomstig zijn uit afzonderlijke neutrofiele granulocyten (Figuur 1). Het is handig om een tweede cel markering zoals...

Hier presenteren we een protocol voor het detecteren van de aanwezigheid van neutrofielen in secties van de histologie vaste/permeabel en beoordelen van de activeringsstatus van levende gezuiverde neutrofielen. In het bijzonder de MUB40 peptide gebonden Lactoferrine in submodules neutrofiele-specifieke en tertiaire aanwezig. Blootstelling van de submodule inhoud via permeabilization of neutrofiele activering zorgt voor de markering van de neutrofielen.

De MUB40 Peptide voor gebruik bij de opsporing van ontsteking neutrofiele-gemedieerde gebeurtenissen

Here, we provide a protocol involving the use of MUB40, a synthesized peptide with the ability to bind glycosylated lactoferrin stored at high ...

MUB40 is een nieuwe neutrofiele marker, die zich bindt aan lactoferrine en maakt een specifieke detectie in de menselijke en alle zoogdier weefsel monster tot nu toe getest. Het labelen van neutrofielen met MUB40 is eenvoudig, snel en specifiek. Het wordt nu veel gebruikt in ons lab en de implicatie van deze techniek strekt zich uit tot de diagnose van ontstekingsziekten.Om te beginnen, oplossingen een, twee en drie volgens het tekstprotocol, en plaats ze in een anoxische kast 's nachts. Vervolgens centrifugeren de buizen van verzameld bloed op 650 g gedurende 20 minuten om de cellen te scheiden van de plasma-fractie. Zonder het gescheiden bloed te verstoren, breng je de buizen over naar de anoxische kast en breng je de plasmafracties over op een conische buis van 50 milliliter.Verwijder hierna de buis van plasma uit de anoxische kast en vercentrifuge het gedurende 20 minuten op 2900 g. Zorg ervoor dat de pelleted bloedplaatjes niet verstoren, breng de buis naar de anoxische kast en pipette de bloedplaatjes slecht plasma in een verse 50 milliliter buis. Met behulp van de bloedafname buizen, combineren de rode bloedcellen in een conische 50 milliliter buis.Voeg vervolgens 0,9% natriumchlorideoplossing toe tot het totale volume 44 milliliter bereikt en voeg zes milliliter van 6% dextran toe. Keer de buis 10 tot 20 keer om het bloed en het dextranmengsel voorzichtig te mengen en laat de buis minstens 30 minuten sedimenteren. Terwijl de buis sedimenten, bereiden een Percoll gradiënt door het toevoegen van 4,2 milliliter Percoll oplossing tot 5,8 milliliter plasma, en omkeren de buis te mengen.Verzamel vervolgens de neutrofiele met de bovenste fractie van de dextran, waarbij u ervoor zorgt dat ze geen rode bloedcellen pipette. Draai de schroefdop aan, haal de dextranbuis uit de anoxische kast en vercentrifuge de buis gedurende 10 minuten op 300 g. Zorg ervoor dat de gepelde cellen niet worden verstoord, plaats de buis terug in de anoxische kast.Verwijder vervolgens de vloeistof door te pipetten. Voorzichtig resuspend de pellet in een milliliter plasma. Voeg langzaam de geresuspendeerde cellen toe aan de toppen van de Percoll-oplossing.Verwijder de Percoll-oplossingsbuis voorzichtig uit de anoxische kast en vercentrifugeren 20 minuten lang met 800 g om PBMCs van neutrofielen te scheiden. Bereid vervolgens 14 milliliter wasbufferoplossing volgens het tekstprotocol. Plaats vervolgens de Percoll buis in de anoxische kast.Gebruik een pipet om de Percoll en PBMCs te verwijderen en de neutrofiele bevattende pellet opnieuw op te plaatsen in één milliliter wasbufferoplossing. Voeg vervolgens 200 microliter magnetische kralen toe aan de geresuspendeerde cellen. Meng en ontcubeer de cellen en kralen gedurende ten minste 15 minuten.Was hierna twee maal een scheidingskolom, met twee milliliter wasbuffer. Terwijl u een nieuwe, 15 milliliter conische buis onder de kolom, langzaam pipette de neutrophil rode bloedcel mengsel door de kolom. De doorstroom van de kolom moet troebel zijn en zijn rode kleur verliezen, wat de totale scheiding van neutrofielen van de resterende rode bloedcellen bevestigt.Voeg twee milliliter wasbuffer toe aan de bovenkant van de kolom en verzamel de doorstroom in dezelfde buis. Tegen het einde van deze wasbeurt moet de doorstroming duidelijk zijn. Meng voorzichtig de opvangbuis om ervoor te zorgen dat de neutrofielen gelijkmatig worden verdeeld.Vervolgens verzamelde 10 microliter van de flow-through van celtelling. Verwijder hierna de neutrofiele buis uit de anoxische kast en vercentrifuge de buis gedurende 20 minuten op 300 g. Plaats de gesedimenteerde neutrofielen terug in de anoxische kast en verwijder de wasbuffer via pipetting.Dan, resuspend de pellet in plasma. Voeg een microliter RI-MUB40-Cy5 toe aan een milliliter RPMI-1640 medium, zonder fenolrood, en meng via pipetting. Voeg vervolgens een microliter FMLP-oplossing en pipet toe om te mengen.Breng het mengsel naar een glazen bodem microscopie schotel. Voeg vervolgens een passend volume gezuiverde cellen toe aan de schotel. Tot slot, plaats het gerecht in een omgekeerde fluorescerende microscoop en start beeldverwerving.In dit protocol werd MUB40 gebruikt op levende cellen om neutrofiele afscheiding te detecteren bij simulatie met FMLP. De dynamiek van de afgifte van korrelgehalte, met inbegrip van lactoferrine, kan worden gevisualiseerd na verloop van tijd, hier in magenta. MUB40 kan bovendien worden gebruikt op vaste neutrofielen.Hier, fagocytiserende fluorescerende kralen in een getimede serie. De inhoud van Neutrophil granulaat is hier in het blauw gelabeld. De neutrofielen toonden weinig tot geen cel vlekken op vroege punten en geleidelijk, RI-MUB40 etikettering toegenomen na verloop van tijd, zowel op het plasmamembraan en kraal oppervlak.MUB40 kan ook worden gebruikt op vaste ontstekingsweefsels om neutrofielen specifiek te detecteren, zoals blijkt uit de tekstcijfers. We beschrijven hier de neutrofiele zuiveringsprocedure, routinematig toegepast in ons lab. Elke andere methode is geschikt, MUB40-Cy5 etikettering zal nog steeds werken.Neutrophil kan specifiek worden gelabeld met MUB40 na zuivering, of direct in ontstoken weefsel van patiënten of dierlijke modellen. Verschillende MUB40 derivaten zijn ontworpen om het gebruik ervan te verbreden. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van ontsteking, om neutrofiele rekrutering en activering bij ontstekingsziekten te onderzoeken.

the-mub40-peptide-for-use-detecting-neutrophil-mediated-inflammation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source:Jing Li1, Jaehyung Cho2,31MBL International Corporation, Des Plaines.2Division of Hematology, Department of Medicine, Washington University School of Medicine.3Department of Pathology and Immunology, Washington University School of Medicine.This video demonstrates a degranulation assay of azurophilic granules in mouse neutrophils, involving the stimulation of neutrophils to release myeloperoxidase-containing azurophilic granules. The subsequent enzymatic reaction is employed to quantify...

An Assay to Monitor Degranulation of Azurophilic Granules in Neutrophils following Activation

We beschrijven een niet-invasieve beeldvorming methode voor het onderscheiden van inflammatoire fasen. Systemische toediening van luminol onthult gebieden van acute ontsteking afhankelijk MPO-activiteit in neutrofielen. Daarentegen injectie lucigenine maakt visualisatie van chronische inflammatie afhankelijk Phox activiteit in macrofagen.

In vivo beeldvorming methode om acute en chronische ontsteking Onderscheid

Lipiden is bekend dat ze een belangrijke rol in cellulaire functies spelen. We beschrijven een werkwijze om de lipidesamenstelling van neutrofielen te bepalen, met de nadruk op het cholesterolgehalte, door zowel HPTLC en HPLC aan een beter begrip van de onderliggende mechanismen van neutrofielen extracellulaire val vorming krijgen.

Methoden om te studeren Lipidenveranderingen in neutrofielen en de daaropvolgende vorming van neutrofielen Extracellulaire Traps

Hier presenteren we drie methoden om neutrofiele migratie en infiltratie zowel in vivo als in vitro te beoordelen. Deze methoden kunnen worden gebruikt om veelbelovende therapieën te ontdekken die gericht zijn op neutrofiele migratie.

Detecteren van migratie en infiltratie van neutrofielen bij muizen

De hierin beschreven protocollen bieden een gids om de activiteit van neutrofiele proteasen in humaan sputum te visualiseren en te kwantificeren. De toepassingen van een dergelijke analyse variëren van de evaluatie van ontstekingsremmende behandelingen tot biomarkervalidatie, geneesmiddelenscreening en grote cohort klinische studies.

Monitoring van neutrofiele Elastase en Cathepsine G-activiteit in menselijke Sputummonsters

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de inductie en analyse van in vitro neutrofiele extracellulaire vallen (NET's). Kwantificering van DNA, cathelicidin (LL37) en enzymactiviteit leverde gegevens op die de variabiliteit in de samenstelling en morfologie van NET's geïnduceerd door microbiële en chemische stimuli onder vergelijkbare gecontroleerde omstandigheden aantonen.

Morfologische en compositorische analyse van neutrofiele extracellulaire vallen geïnduceerd door microbiële en chemische stimuli

We presenteren een protocol voor een gemodificeerde sandwich enzym-gebonden immunosorbent assay techniek om kwantitatief twee componenten van neutrofiele extracellulaire val restanten, myeloperoxidase geconjugeerd-DNA en neutrofiele elastase geconjugeerd-DNA complexen, afgeleid van geactiveerde neutrofielen.

Kwantificeren van myeloperoxidase-DNA en neutrofiele elastase-DNA-complexen van neutrofiele extracellulaire vallen met behulp van een gemodificeerde sandwich-ELISA

Dit protocol bevat een reeks neutrofiele functionele assays die kunnen worden gebruikt als screeningsmethode om functies van verschillende signaalroutes te dekken. Het protocol omvat een eerste en eenvoudige evaluatie van de levensvatbaarheid van cellen, zuiverheid, productie van reactieve zuurstofsoorten, real-time migratie, fagocytose en een voorlopige suggestie van extracellulaire neutrofiele vallen.

Een reeks screeningstechnieken voor een snel overzicht van de neutrofielenfunctie

Dit protocol beschrijft een CRISPR-Cas-gemedieerde, multianalyte synthetische urine biomarker test die point-of-care kankerdiagnostiek mogelijk maakt door middel van de ex vivo analyse van tumor-geassocieerde protease-activiteiten.

CRISPR-Cas-gemedieerde Multianalyte Synthetische Urine Biomarker Test voor Draagbare Diagnostiek

Dit gedefinieerde protocol beschrijft een real-time high-throughput microscopiebenadering om de afgifte van humane neutrofielen extracellulaire val (NET) in vitro te visualiseren en te kwantificeren. De reproduceerbare methode maakt onderzoek mogelijk naar de kenmerken en kinetiek van NETosis-afgifte na stimulatie met verschillende NETosis-inductoren en maakt beoordeling van de farmacologie van NETosis-antagonisten mogelijk.

Realtime, high-throughput microscopische kwantificering van de afgifte van extracellulaire vallen van menselijke neutrofielen en beoordeling van de farmacologie van antagonisten

Neutrofielen met lage dichtheid (LDN) nemen aanzienlijk toe bij verschillende ziekten. LDN worden meestal geïsoleerd door middel van celsortering. We presenteren een praktische methode om zuiver en levensvatbaar LDN te verkrijgen. Na dichtheidsgradiëntcentrifugatie van perifeer bloed worden cellen geïncubeerd met magnetische microbeads en vervolgens wordt LDN gescheiden door magnetische kolommen.

Snelle magnetische microbead-methode voor efficiënte zuivering van neutrofielen met lage dichtheid

Leer hoe u neutrofielen detecteert met het MUB40-peptide in levende en gefixeerde weefsels. Deze methode maakt specifieke labeling en visualisatie van granulaire secretie mogelijk voor onderzoek naar ontstekingsziekten.

De MUB₄₀ Peptide voor gebruik bij de opsporing van ontsteking neutrofiele-gemedieerde gebeurtenissen

Meer video's verkennen