Synthese en structuurbepaling van µ-Conotoxin PIIIA-isomeren met verschillende Disulfide Connectivities

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het peptide syntheseveld, zoals het synthetiseren van disulfide rijke peptiden en het bepalen van hun overeenkomstige disulfide brugpatroon. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het zorgt voor de selectieve synthese van verschillende disulfide bondend peptide isomeren en hun daaropvolgende chemische en structurele karakterisering. Over het algemeen individuen nieuw op deze methode zal worstelen, omdat elke disulfide rijk peptide gedraagt zich anders.

Synthese en analyse kan moeten gedeeltelijk worden geoptimaliseerd voor individuele peptide of eiwit. Breng de reagentia in het tekstprotocol over naar de overeenkomstige vaten en plaats ze in de juiste rackets van de vaste fase peptide synthesizer. Voeg vervolgens 100 milligram droge hars toe aan de reactiekolommen en leg ze in het racket van de synthesizer.

Start de solid-phase peptide synthese zoals beschreven in het tekstprotocol. Nadat de synthese is voltooid, lyophilized de hars 's nachts. Nu cleave het peptide van de hars en voeren diepe bescherming van de zijkettingen.

Combineer hiervoor de gedroogde hars in een buis van 12 milliliter en koel deze af tot nul graden Celsius op ijs. Voeg eerst 150 microliter van een aasetersmengsel toe en voeg vervolgens een milliliter van 95% trifluoroacetisch zuur per 100 milligram hars toe. Laat het mengsel zachtjes schudden gedurende drie uur op kamertemperatuur.

Nu, filtreer het mengsel door een glazen frit. Verzamel het filtraat in buizen, individueel gevuld met ijskoude diethylether bij een milliliter decolleté mengsel per acht tot 10 milliliter diethyther. Het peptide precipiteert als een witte vaste stof.

Na het spoelen en centrifugeren van de buizen zoals beschreven in het tekstprotocol, vries-droog de peptiden. Om de lineaire voorloper met semi preparatatieve chromatografie te zuiveren voeg ongeveer 70 milligram van de ruwe peptide aan een 15 milliliter buis. Los vervolgens het ruwe peptide op in 0,1%TFA en één-op-één Acetonitrile voor water.

Scheid het peptidemengsel met behulp van een gradiënt van nul tot 50%Eluent B gedurende 120 minuten bij een stroomsnelheid van 10 milliliter per minuut. Verzamel de breuken in afzonderlijke buizen zoals ze verschijnen en bereid geselecteerde breuken voor voor massaspectrometrie en HPLC-analyse zoals beschreven in het tekstprotocol. Vries de breuken en combineer de peer fracties.

Start de selectieve vorming van disulfide bindingen door het uitvoeren van de eerste oxidatie. Los hiervoor 15 milligram van het gevriesdroogde lineaire peptide op in 105 milliliter van een isopropanolwatermengsel. Laat het mengsel 12 tot 48 uur onder basisomstandigheden op de lucht roeren.

De stapsgewijze oxidatieprocedure is zeer kritisch. Reactie controles worden genomen in alle drie oxidatie stappen om individuele disulfide rijke vorming te garanderen. De derde oxidatie is het meest cruciaal omdat disulfide versluiering kan optreden wanneer de optimale reactietijd wordt overschreden.

Voer nu de tweede oxidatie uit. Los 15 milligram van het gevriesdroogde peptide op in 105 milliliter isopropanolwater, één molair zoutzuurmengsel. Voeg 158 microliters van een 0,1 molaire jodiumoplossing in methanol toe aan de oplossing.

Roer de reactie bij kamertemperatuur totdat de oxidatie is voltooid. Stop vervolgens de reactie door 79 microliters van één molaire ascorbinezuur in water toe te voegen. Ten slotte de derde oxidatie uit te voeren.

Los 15 milligram van het gevriesdroogde peptide op in 5,5 milliliter TFA met een aasetersmengsel. Precipitate het peptide in buizen met koude diethylether op een milliliter reactieoplossing per acht tot tien milliliter diethylether. Om peptide zuivering uit te voeren op 15 milligram van het gevriesdroogde ruwe product tot een 15 milliliter buis.

Los het ruwe product op in het volume van de HPLC-monsterlus met een mengsel van 0,1%TFA en één op één Acetonitril aan water. Na het vortexen tot volledige ontbinding, centrifugeren de oplossing van een minuut op 3400 keer G.Teken de 3,6 milliliter mengsel in een 5 milliliter spuit en injecteer het monster zonder luchtbellen in de injectie lus. Start de injectie in het HPLC-systeem.

Zuiver het peptidemengsel met behulp van een gradiënt van nul tot 50%Eluent B gedurende 120 minuten bij een stroomsnelheid van 10 milliliter per minuut. Verzamel de breuken in afzonderlijke buizen zoals ze verschijnen. Nadat de run is voltooid, bereid je geselecteerde breuken voor voor MS- en HPLC-analyse zoals beschreven in de tekst.

Vries alle fracties droog en bewaar ze bij min 20 graden Celsius. Om analytische HPLC uit te voeren, breng je monsters van de peptidefracties of reactieregelaars over in een HPLC-flacon en los je deze op in het mengsel van 0,1%TFA in één tot één Acetonitrile op water. Plaats de HPLC flacon in de auto-sampler van de analytische omgekeerde fase HPLC ingesteld op 250 microliters van elk monster injecteren.

Gebruik een gradiënt elution systeem van 0,1%TFA in water als Eluent A in 0,1%TFA in Acetonitrile als een Eluent B.Analyseer het peptide met behulp van een gradiënt van 10%tot 40%Eluent B over 30 minuten bij een stroomsnelheid van 1,0 milliliter per minuut. Om aminozuuranalyse uit te voeren, breng je 100 microgram van het zuivere peptide over naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuis en los je het poeder op in 200 microliter van zes molaire HCL. Na het overbrengen van de oplossing naar een glazen ampul, sluit u de ampul door de hals te verwarmen met een bunsen brandervlam.

Plaats vervolgens een glazen buis die de ampul 24 uur in een verwarmingsblok houdt bij 110 graden Celsius voor hydrolyse. Open na 24 uur de ampula en breng de oplossing over in een twee milliliter microcentrifugebuis. Centrifugeren de oplossing gedurende zes uur bij zestig graden Celsius en 210 keer G in een rotatievacuümconcentraor.

Los vervolgens het gehydrolyseerde product op in 192 microliter van de bemonsterde verdunningsbuffer en breng de oplossing over in een microcentrifugaalfilter. Na het centrifugeren van het monster gedurende een minuut op 2300 keer G, breng 100 microliter van het filtraat in een aminozuur analyse monster buis. Plaats de buis in de aminozuur analyzer en start de analyse.

Tijdens dit vorige reductieprotocol is het van cruciaal belang om verschillende reactiecontroles te nemen om twee of vier keer kappa mido gemethyleerde soorten te verkrijgen die onmisbaar zijn voor latere disulfideanalyse via massaspectrometrie. Los eerst 600 microgram van het zuivere peptide op in 1,2 milliliter 0,05 molaire citraatbuffer met TCEP. Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur met meerdere 100 microliter reactie controle monsters, variërend van nul tot 30 minuten.

Meng de monsters in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis met 300 microliter alkyl buffer om de reactie te stoppen en koolstofylmethyllyllatie van de vrije thiolgroepen uit te voeren. Stop de reactie na vijf minuten door 100 microliter van 10% TFA en water toe te voegen en bewaar de monsters op droogijs. Voer nu HPLC uit op de monsters zoals beschreven in het tekstprotocol.

Breng een kleine hoeveelheid van elke verzamelde fractie over naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuis voor MS/MS-analyse van de geoxideerde vormen. Los het resterende peptide op in 0,1%TFA in water en voeg een geschikt volume toe over een TCEP-oplossing van 100 millimolar om een uiteindelijke TCEP-concentratie van 10 millimolar te krijgen. Op dit punt kan selectieve cysteïne alkylation worden gecontroleerd via peptide sequencing.

Met de twee peptiden in het midden is een bepaling van het disulfidebrugpatroon mogelijk. NMR-analyse van de verschillende isomeren wordt uitgevoerd om de individuele peptidestructuren te onthullen. De 20 structuren met de laagste energieën en de disulfide connectiviteit van de verschillende isomeren worden getoond.

Met name is een combinatie van omgekeerde HPLC MS/MS fragmentatie en NMR-analyse vereist voor een eenduidige identificatie van de disulfideconnectiviteit. De vergelijking van de wortel gemiddelde vierkante afwijkingswaarde verduidelijkte dat een stijf peptide meestal tot een beter opgeloste structuur NMR leidt. Deze video moet u een voorbeeld geven hoe u selectief peptiden synthetiseren met een gewenst disulfide-bindingspatroon.

Het toont ook de mogelijkheid om de juiste disulfide connectiviteit te controleren via tender massaspectrometrie en om een driedimensionale structuur te verkrijgen via NMR spectroscopie. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van peptidesynthese om het belang van disulfidebindingspatronen voor de driedimensionale structuur en bijgevolg de activiteit van dergelijke peptide isomeren te onderzoeken. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals activiteit ASAS worden uitgevoerd om inzicht te krijgen in structuuractiviteitsrelaties van verschillende peptideisomeren op het specifieke biologische doel.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in de synthese en analyse van conotoxinen, kan het ook worden toegepast op andere disulfide brug peptiden en eiwitten zoals de fenzens, disulfide-rijke dierlijke toxines en andere meervoudige cysteïne bevattende moleculen.