Name: Analyse van eiwitcomplexen thylakoïde membraan door blauwe inheemse gelelektroforese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Leer de analyse van thylakoïde-eiwitcomplexen in planten met blauwe native PAGE en 2D-SDS-PAGE. Deze methode onthult functionele interacties en organisatie van photosynthetische complexen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd financieel ondersteund door de Academie van Finland (projectnummers 307335 en 303757) en zonne-energie in de subsidieovereenkomst biomassa (SE2B) Marie Skłodowska-Curie (675006). Het protocol is gebaseerd op referentie3.

1. voorbereiding BN Gel1,2,3
<ol><li>De gel-wiel met 8 x 10 cm platen (rechthoekig glas en ingekeepte aluminiumoxide plaat) volgens de instructies van de fabrikant van met behulp van 0,75 mm afstandhouders instellen.</li>
	<li>Plaats een kleurovergang mixer op een roer-plaat en verbind deze met de peristaltische pomp door een slang. Een naald van de spuit hechten aan het andere uiteinde van de buis en plaats de naald tussen het glas en aluminium plaat. Magneetroerder plaats aan de "heavy" (H)-kamer.</li>
	<li>De 3,5% (v/v) en 12,5% (v/v) acrylamide (AA) oplossingen in 15 mL conische centrifuge buizen te bereiden voor de scheiding gel gradatie (Zie recepten in tabel 1). Voorkom vroegtijdige polymerisatie en houden de centrifuge buizen op ijs bij de voorbereiding van de oplossingen. Let op: Acrylamide is neurotoxische en kankerverwekkende, Draag beschermende kleding en handschoenen.</li>
	<li>Voeg 5% APS en TEMED recht vóór de oplossingen voor de kleurovergang mixer pipetteren. Pipetteer de 12,5%-oplossing voor de H-kamer.<ol>
<li>Verwijder luchtbellen uit het kanaal aansluiten van de "light" (L) en H-kamer door het openen van de klep aansluiten van de twee kamers waardoor oplossing om aan de L-kamer te gaan. Sluit de klep en Pipetteer die de sporen van oplossing terug naar H-kamer.</li>
		<li>Ten slotte, Pipetteer de 3,5%-oplossing voor de L-kamer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Overschakelen op de magneetroerder (de snelheid van het roer is niet kritisch, maar het moet goed mengen van de zware en lichte oplossingen), de kleppen open en zet de peristaltische pomp. Laat de gel oplossingen te stromen tussen het glas en aluminium plaat, het debiet moet ongeveer 0,5 mL/min. De naald moet boven de vloeistof op de hele tijd, het kan worden aangesloten op het bovenste gedeelte van de glasplaat met een tape.</li>
	<li>Wanneer de H - en L-kamers hebben leeggemaakt, vul ze met ultrazuiver water en water zachtjes het oppervlak van de gel overlay toestaan. De gel polymerisatie duurt ongeveer 1-2 uur op RT.</li>
	<li>Bereid de oplossing van 3% acrylamide (zie recept in tabel 1) voor het stapelen gel op RT. Pipet de stapelvolgorde gel op de top van de gepolymeriseerde scheiding gel (vóór gieten de stapelvolgorde gel, verwijder het water bedekken de oppervlakte van de gel) en plaats een monster gel kam tussen het glas en aluminium plaat vermijden luchtbellen.<ol>
<li>Laat 30-60 min RT. verwijderd de kam voorzichtig onder ultrazuiver water polymeriseren. Opslaan van de gel op + 4 ˚C. Pauze punt. De gel kan worden achtergelaten bij + 4 ˚C voor een paar dagen. De gel moet worden bewaard in vochtige omstandigheden om te voorkomen dat het drogen van de putten en het oppervlak van de gel.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. thylakoïde solubilisatie1,2,3
Opmerking: Alle stappen moeten worden uitgevoerd onder zeer weinig licht. Houd de monsters en buffers op ijs.
<ol><li>Geïsoleerde ze met ijskoude 25BTH20G buffer tot een definitieve chlorofylconcentratie van 1 mg/mL verdund. Voor 2D-BN-SDS-pagina analyse ongeveer 4-8 µg chlorofyl / monster is geschikt. Opmerking: Het thylakoiden gebruikt in de experimenten moeten worden geïsoleerd van verse bladeren (voor protocol van thylakoïde isolatie, Zie3)</li>
	<li>Voeg een gelijke hoeveelheid wasmiddel buffer, d.w.z. 2% β-DM (w/v) of 2% toe digitonin (m/v). Meng het wasmiddel aan het monster thylakoïde zachtjes met de pipet-tip en luchtbellen voorkomen. De uiteindelijke concentratie van het wasmiddel is 1% en dat van de ze 0.5 mg Chl/mL.<ol>
<li>Solubilize de thylakoiden gedurende 2 minuten op ijs (β-DM) of 10 minuten bij RT met continue Zacht mengen op een rocker/shaker (digitonin). Opmerking: Digitonin en β-DM zijn over het algemeen gebruikt voor de solubilisatie van een thylakoïde eiwitcomplexen. Als andere niet-ionogene wasmiddelen worden gebruikt, moeten de wasmiddel concentratie en de tijd van de solubilisatie worden eerst geoptimaliseerd. Meestal het wasmiddel concentratiebereik van 0,5% - 5% (v/v). Let op: Digitonin is toxisch, Draag beschermende kleding en handschoenen</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het insolubilized materiaal verwijderen door centrifugeren bij 18.000 x g gedurende 20 minuten, bij + 4 ˚C.</li>
	<li>Het supernatant overbrengen in een nieuwe tube 1,5 mL en voeg 1/10 (v/v) van CBB buffer aan het monster. Opmerking: Wanneer de globale samenstelling van de thylakoïde membraan eiwitcomplexen wordt onderzocht, bepalen van het rendement en de vertegenwoordigde thylakoïde domein van ontbindend breuk wordt aanbevolen. Om te bepalen van het rendement van de ontbindend materiaal, neem 5 µL van het supernatans dat aan een nieuwe buis (alvorens toe te voegen CBB) en meet de Chl inhoud en Chl een / b verhouding5.</li>
</ol>3. BN-PAGE1,2,3
<ol><li>Instellen van de gel met een verticale elektroforese systeem (bijvoorbeeld Hoefer SE 250). Vul het bovenste buffer kamer met blauwe kathode buffer (Zie tabel 1) en giet anode buffer naar de tweede kamer van de buffer.</li>
	<li>Laad thylakoïde monster (bijvoorbeeld 5 µg van chlorofyl) in de putjes.</li>
	<li>Start de elektroforese en geleidelijk verhogen de spanning: 75 V voor 30 min 100 V voor 30 min, 125 V voor 30 min, 150 V voor 1 h en 175 V tot de complexen zijn volledig gescheiden. Voer de gel op + 4˚C, hetzij met behulp van een koude kamer of aanpassing van de temperatuur van de gel met een koelsysteem. Opmerking: Omzetten in de blauwe kathode buffer een duidelijke kathode buffer wanneer de steekproef voorkant ongeveer eenderde van de gel is gemigreerd.</li>
	<li>Na de elektroforetische run, de gel met een photoscanner voor het archiveren van de afbeelding te scannen.</li>
</ol>4. 2D-SDS-PAGINA
<ol><li>Het monteren van de Elektroforese van het verticale systeem (gel formaat 16 x 20 cm). Gebruik 1 mm afstandhouders.</li>
	<li>Bereiden standaard SDS gel (12% acrylamide, 6 M ureum, zie recept in tabel 2) met een 2D-kam (één groot goed voor de strip en één standaard goed voor moleculair gewicht marker).</li>
	<li>Knip de baan van BN-gel en plaatst u deze in een tube (5 mL). Voeg 2 mL Laemmli buffer (met 5% β-mercaptoethanol) en Incubeer de strip voor 45 min met zacht schudden op RT.</li>
	<li>Plaats de lane, met behulp van bijvoorbeeld een spacer, op de top van de gel om luchtbellen te voorkomen.</li>
	<li>Pipetteer 5 µL van moleculair gewicht markering op een smal stuk van filtreerpapier en plaats het papier aan de standaard goed.</li>
	<li>Om de strip BN-gel en het marker-papier, giet 0,5% agarose (in rijklare buffer) op de top van de gel-strip en laat het stollen.</li>
	<li>Elektroforese volgens standaard protocollen uitvoeren. Nadat de elektroforetische uitgevoerd, visualiseer de proteïnen met bijvoorbeeld Sypro Ruby vlek of zilver kleuring volgens6.</li>
</ol>

<ol><li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).</li>
<li>Kügler, M., Jänsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -P. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1023/A:1005882406718">Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE).</a> Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).</li>
<li>Järvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+native+gel+systems+for+separation+of+thylakoid+protein+complexes%3A+novel+super-+and+mega-complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes.</a> Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).</li>
<li>Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+pore+gels+to+separate+mega+protein+complexes+larger+than+10+MDa+by+blue+native+electrophoresis%3A+Isolation+of+putative+respiratory+strings+or+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches.</a> Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).</li>
<li>Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0005272889803470">Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. , 384-394 (1989).</li>
<li>Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/elps.1150080203">Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 8, 93-99 (1987).</li>
<li>Aro, E. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+photosystem+II%3A+a+proteomic+approach+to+thylakoid+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes.</a> Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).</li>
<li>Suorsa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+acclimation+involves+dynamic+re-organization+of+the+pigment-protein+megacomplexes+in+non-appressed+thylakoid+domains%5BTitle%5D)+AND+%22The+plant+journal+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains.</a> The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+Structural+Proteins+during+the+Assembly+of+the+Head+of+Bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Schägger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplexes+in+the+respiratory+chains+of+yeast+and+mammalian+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria.</a> The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).</li>
<li>Rantala, S., Tikkanen, M. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/pld3.39">Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation.</a> Plant Direct. 2, 1-12 (2018).</li>
<li>Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+hierarchical+megacomplex+formation+in+Arabidopsis+thylakoid+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane.</a> Plant Journal. 92, 951-962 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De fotosynthetische energie conversie machine bestaat uit grote multisubunit eiwitcomplexen, die zijn ingebed in het membraan van thylakoïde. Dit protocol beschrijft een basismethode voor analyse van de plant thylakoïde eiwitcomplexen van Arabidopsis thaliana met BN-pagina gecombineerd met 2D-SDS-pagina. Het protocol is ook geschikt voor de analyse van eiwitcomplexen thylakoïde van tabak en spinazie ze, maar omvat wellicht kleine aanpassingen.
Voor de solubilisatie van membraan eiwitc...

Grote multisubunit eiwit complexen Fotosysteem PSI en PSII, Cyt b6f en ATPase coördineren de productie van NADPH en ATP in fotosynthetische licht reacties. In hogere planten chloroplasten, bevinden de complexen zich in de thylakoïde membraan, dat een structureel heterogene membraan structuur is, bestaande uit appressed grana en niet-appressed stroma ze. Blauwe inheemse polyacrylamide-gel-elektroforese (BN-pagina) is een veel gebruikte methode bij de analyse van grote multisubunit eiwitcomplexen in hun geboorteland en biologisch actieve vorm. De methode werd opgericht voor de dissectie van de mitochondriale membraan eiwit complexen1, maar is later aangepast voor de scheiding van eiwitcomplexen van de thylakoïde membraan netwerk3. De methode is geschikt is (i) voor de zuivering van individuele thylakoïde eiwitcomplexen voor structurele analyse, (ii) voor het bepalen van de inheemse interacties tussen eiwitcomplexen en (iii) voor de analyse van de algemene organisatie van de eiwitcomplexen op het veranderende milieu signalen.
Voorafgaand aan de scheiding, eiwitcomplexen worden geïsoleerd van het membraan met zorgvuldig gekozen nonionic detergentia die zijn over het algemeen mild en de inheemse structuur van de eiwitcomplexen behouden. Wasmiddelen bevatten hydrofobe en hydrofiele sites en de stabiele micellen vorm boven een bepaalde concentratie, een kritische micellaire concentratie (CMC) genoemd. Verhoging van het wasmiddel concentratie boven de CMC-resultaten in verstoring van de lipide-lipide-interacties en de solubilisatie van eiwitcomplexen. De keuze van wasmiddel is afhankelijk van de stabiliteit van het eiwit complex van belang en de capaciteit van de solubilisatie van het wasmiddel. Routinematig gebruikte detergentia omvatten α/β-dodecyl-maltoside en digitonin. Na de solubilisatie van eiwitcomplexen in hun geboortestaat, onoplosbaar materiaal wordt verwijderd door centrifugeren. In hogere planten, het membraan thylakoïde is zeer heterogenic in structuur en sommige wasmiddelen (b.v. digitonin) solubilize selectief slechts een specifiek deel van de membraan-3. Karakteriseren de complexe organisatie van eiwit of de interacties tussen de eiwitcomplexen, is het daarom cruciaal om altijd de solubilisatie capaciteit van het gekozen wasmiddel door het bepalen van de inhoud van de chlorofyl en de chlorofyl a/b verhouding van de bovendrijvende substantie te beoordelen het rendement en de vertegenwoordigde thylakoïde (sub) domein, respectievelijk van de ontbindend breuk. De chlorofyl a/b-verhouding in intact ze van groei-licht acclimated planten is meestal ongeveer 3, terwijl de chl een / b-waarde van thylakoïde breuken verrijkt in grana of stroma ze beneden (~ 2.5) of de waarde van het totaal (~ 4.5) overschrijdt thylakoiden, respectievelijk.
Om negatieve lading aan de eiwitcomplexen, wordt Coomassie briljant blauw (CBB) kleurstof toegevoegd aan het ontbindend monster. Als gevolg van de verschuiving van de lading, eiwitcomplexen migreren naar de anode en worden gescheiden op een helling van acrylamide (AA) volgens hun moleculaire massa en de vorm. Doeltreffend en met hoge resolutie scheiding wordt bereikt met behulp van een lineaire acrylamide concentratie verloop. Tijdens de elektroforese migreren de eiwitcomplexen naar de anode totdat ze hun grootte-afhankelijke porie-grootte limiet is bereikt. De porie-grootte van polyacrylamidegel hangt af van (i) de totale acrylamide /BIB- acrylamide concentratie (T) en (ii) op de cross-linker bis- acrylamide monomeer concentratie (C) ten opzichte van de totale monomeren4. Na de scheiding met BN-pagina, kunnen de eiwitcomplexen worden verder onderverdeeld in hun individuele eiwit subeenheden door tweede-dimensie (2D) - SDS - PAGE. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de analyse van thylakoïde membraan eiwitcomplexen door BN-/ 2D-SDS-pagina.

<table><tbody><tr><td>6-aminocaproic acid (ACA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>BisTris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4429</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide (AA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9099</td><td>Let op: Neurotoxisch!</td></tr><tr><td>n-dodecyl-&beta;-D-maltoside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4641</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>VWR</td><td>442444H</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>VWR</td><td>28877.292</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>J.T. Baker</td><td>7044</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Fluoride (NaF)</td><td>J.T. Baker</td><td>3688</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodium salt</td><td>J.T. Baker</td><td>1073</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Calbiochem</td><td>300410</td><td>Let op: Toxisch!</td></tr><tr><td>Pefabloc SC</td><td>Roche</td><td>11585916001</td><td></td></tr><tr><td>Serva Coomassie Blue G</td><td>Serva</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610710</td><td></td></tr><tr><td>APS (Ammonium persulfate)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>TEMED (Tetramethylethylenediamine)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610801</td><td></td></tr><tr><td>(N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide</td><td>Omnipur</td><td>2610</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher</td><td>G0800</td><td></td></tr><tr><td>Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa)</td><td>New England Biolabs</td><td>P7708</td><td></td></tr><tr><td>Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml</td><td>Corning</td><td>352093</td><td></td></tr><tr><td>Dual gel caster with 10 x 8 cm plates</td><td>Hoefer</td><td>SE215</td><td></td></tr><tr><td>Gradient maker SG5</td><td>Hoefer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.75 mm T-spacers</td><td>Hoefer</td><td>SE2119T-2-.75</td><td></td></tr><tr><td>Sample gel comb, 0.75 mm</td><td>Hoefer</td><td>SE211A-10-.75</td><td></td></tr><tr><td>Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system</td><td>Hoefer</td><td>SE250</td><td></td></tr><tr><td>IPC-pump</td><td>Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Power supply, PowerPac HV</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5097</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Rocker-Shaker</td><td>Biosan</td><td>BS-010130-AAI</td><td></td></tr><tr><td> PROTEAN II xi Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1651813</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse van eiwitcomplexen thylakoïde membraan door blauwe inheemse gelelektroforese

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Fotosynthetische elektron overdracht keten (ETC) omgezet zonne-energie in chemische energie in de vorm van NADPH en ATP. Vier grote eiwitcomplexen ingebed in de thylakoïde membraan oogst zonne-energie rijden elektronen van water naar NADP+ via twee photosystems, en het verloop van de gemaakte proton gebruiken voor productie van ATP. Photosystem PSII, PSI, cytochroom b6f (Cyt b6f) en ATPase zijn alle multiprotein complexen met verschillende oriëntatie en dynamiek in het membraan van thylakoïde. Waardevolle informatie over de samenstelling en de interacties van de complexen van de eiwitten in het membraan van thylakoïde kan worden verkregen door het solubilizing van de complexen van de membraan integriteit door milde detergentia gevolgd door inheemse gel elektroforetische scheiding van de complexen. Blauwe inheemse polyacrylamide-gel-elektroforese (BN-pagina) is een analytische methode gebruikt voor het scheiden van eiwitcomplexen in hun geboorteland en functionele vorm. De methode kan worden gebruikt voor complexe eiwitreiniging voor meer gedetailleerde structurele analyse, maar het biedt ook een instrument om de dynamische interacties tussen de eiwitcomplexen ontleden. De methode heeft werd ontwikkeld voor de analyse van mitochondriale respiratoire eiwitcomplexen, maar sindsdien zijn geoptimaliseerd en verbeterd voor de dissectie van de thylakoïde eiwitcomplexen. Hier, bieden wij een gedetailleerde up-to-date protocol voor analyse van onstabiele fotosynthetische eiwitcomplexen en hun interacties in Arabidopsis thaliana.

Een representatieve 2D-BN/SDS-pagina systeem in Figuur 1 toont de scheiding tussen digitonin en β-DM-ontbindend thylakoïde eiwitcomplexen en hun gedetailleerde eiwit subeenheid samenstelling. Het eiwit complex patroon van digitonin ontbindend ze (horizontale gel op de bovenkant aan de bovenkant van figuur 1A) bevat de PSII-LHCII-PSI megacomplex, twee grote PSII-LHCII supercomplexes (sc), PSI-LHCII supercomplex, PSI monomeer (m), ...

Een protocol voor het ontrafelen van plant thylakoïde eiwit complexe organisatie en samenstelling met blauwe inheemse polyacrylamide gel elektroforese (BN-pagina) en 2D-SDS-pagina wordt beschreven. Het protocol is geoptimaliseerd voor Arabidopsis thaliana, maar kan worden gebruikt voor andere plantensoorten met kleine wijzigingen.

Analyse van eiwitcomplexen thylakoïde membraan door blauwe inheemse gelelektroforese

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de samenstelling en dynamische organisatie van de fotosynthetische eiwitcomplexen in plant thylakoid membraan. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de analyse van functionele interacties tussen inheemse eiwitcomplexen mogelijk maakt en de plasticiteit van de eiwitcomplexe organisatie in wisselende omgevingsomstandigheden opheldert. Stel de gel caster acht centimeter bij 10 centimeter platen volgens de instructies van de fabrikant met behulp van 0,75-millimeter afstandhouders.Plaats een gradiëntmixer op een roerplaat en sluit deze aan bij de peristaltische pomp door buizen te maken. Bevestig een spuitnaald aan de andere kant van de slang en plaats de naald tussen de glas- en aluminiumplaat. Plaats een magnetische roerder in de zware kamer.Bereid 3,5% en 12,5% acrylamide oplossingen in 15-milliliter conische centrifuge buizen zoals beschreven in het tekstprotocol te gebruiken voor de scheiding gel gradiënt. Om vroegtijdige polymerisatie te voorkomen, houdt u de centrifugebuizen op ijs terwijl u de oplossingen voorbereidt. Voeg 5%APS en TEMED toe vlak voordat de oplossingen aan de verloopmixer worden toegevoegd.Pipette de 12,5%-oplossingen voor de zware kamer. Verwijder luchtbellen uit het kanaal dat de licht- en zware kamer verbindt door de klep te openen die de twee kamers verbindt, waardoor de oplossing naar de lichtkamer kan worden ingevoerd. Sluit de klep en pipet de sporen van de oplossing terug naar de zware kamer.Tot slot, pipet de 3,5%-oplossing voor de lichtkamer. Schakel de magneetroerder in. Open de kleppen en schakel de peristaltische pomp in.Laat de geloplossingen tussen de glas- en aluminiumplaat stromen met een stroomsnelheid van ongeveer 0,5 milliliter per minuut. De naald moet te allen tijde boven de vloeistof staan. Wanneer de zware en lichte kamers hebben geleegd vul ze met ultrazuiver water.En laat water om zachtjes overlay de gel oppervlak. Gelpolymeerisatie duurt ongeveer een tot twee uur bij kamertemperatuur. Bereid de 3%acrylamide oplossing voor de stapelgel op kamertemperatuur.Pipette de stapelen gel op de top van de gepolymeriseerde scheiding gel en plaats een monster gel kam tussen het glas en aluminium plaat vermijden luchtbellen. Nadat de gel 30 tot 60 minuten op kamertemperatuur heeft gepolymeriseerd, verwijdert u de kam voorzichtig onder ultrazuiver water. Op dit punt kan de gel worden opgeslagen bij positieve vier graden Celsius in vochtige omstandigheden voor een paar dagen.Verdun geïsoleerde thylakoïden met ijskoude 25BTH20G buffer tot een definitieve chlorofylconcentratie van één milligram per milliliter. Bereid twee buizen voor elk thylakoïde monster om zowel bèta-DM als digitonin oplosbilisatie uit te voeren. Voeg nu een gelijk volume wasmiddel buffer.Meng het wasmiddel en thylakoïde monster voorzichtig met een pipet en vermijd het maken van luchtbellen. Solubilize de thylakoïden gedurende twee minuten op ijs voor de beta-DM oplosbilisatie. Of 10 minuten bij kamertemperatuur met continu zachte mengen op een rocker of shaker voor de digitonin oplosbilisatie.Verwijder na incubatie het onoplosbare materiaal door centrifugatie op 18.000 g gedurende 20 minuten bij positieve vier graden Celsius. Breng de supernatant naar een nieuwe 1,5-milliliter buis en voeg 1/10 volume van Coomassie briljante blauwe buffer aan het monster. Zet de gel in een verticaal elektroforesesysteem.Vul de bovenste bufferkamer met blauwe kathodebuffer en giet anodebuffer naar de onderste bufferkamer. Laad de thylakoïde monsters in de putten. Start de elektroforese en verhoog geleidelijk de spanning zoals vermeld in het tekstprotocol.Voer de gel op positieve vier graden Celsius, hetzij met behulp van een koude kamer of het aanpassen van de gel temperatuur met een koelsysteem. Verander de blauwe kathodebuffer in een duidelijke kathodebuffer wanneer het monsterfront ongeveer 1/3 van de gel heeft gemigreerd. Na de elektroforetische run scan de gel met een fotoscanner voor beeldarchivering.Voor het uitvoeren van 2-SDS PAGE monteren van de verticale elektroforese systeem met behulp van een millimeter afstandhouders. Bereid een standaard SDS gel met een 2D-kam zoals beschreven in het tekstprotocol. Snijd de baan van de BN gel en plaats deze in een buis van vijf milliliter.Voeg vervolgens twee milliliter Laemmli buffer en incubeer de strip gedurende 45 minuten met zachte schudden bij kamertemperatuur. Plaats de baan met behulp van een spacer op de top van de gel het vermijden van luchtbellen. Pipette vijf microliters van moleculair gewicht marker op een smal stuk filter papier en plaats het papier in de standaard put.Om de BN gel strip en de marker papier te verzegelen giet een 0,5%agarose in lopende buffer op de top van de gel strip en laat het stollen. Elektroforese uitvoeren volgens standaardprotocollen. Na de elektroforetische run visualiseren de eiwitten met SUPRO Ruby vlek of zilver vlekken.Representatieve resultaten van thylakoïde eiwitcomplexe patronen van bèta-DM en in opgetallen oplosbaar monsters worden hier weergegeven. De kleine complexen migreren sneller tijdens de elektroforetische run en bevinden zich daarom in het onderste deel van de gel. Terwijl de grote complexen zich in het bovenste deel van de gel bevinden.Digitonin behoudt over het algemeen eiwitcomplexen in grotere samenstellingen, terwijl bèta DM de interacties tussen de complexen interfereert met labiele eiwit-eiwitinteritussen. De subunit samenstelling van eiwitcomplexen van bèta-DM en digitonin-oploskte thylakoïden worden hier gepresenteerd. De subeenheden van elk complex zijn te vinden vanaf de verticale lijn onder het uitgelijnde complex.In principe vertegenwoordigt elke plek in de 2D gel een individueel eiwit. Maar in de praktijk kunnen verschillende eiwitten van dezelfde moleculaire massa op één plek aanwezig zijn. De identificatie van de vlekken is gebaseerd op massaspectrometrie analyse.Na het toepassen van deze procedure kan men met andere methodes zoals elektronenmicroscopie en enige deeltjesanalyse van de eiwitcomplexen voortzetten die van de blauwe inheemse gel worden ontlokt om structurele inzichten in de eiwitcomplexen te krijgen. Om onbekende eiwitsubeenheden te identificeren kunnen de individuele eiwitvlekken van tweedimensionale SDS PAGE worden geanalyseerd met massaspects. Vergeet niet dat het werken met acrylamide en digitonine uiterst schadelijk kan zijn en voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van beschermende handschoenen moeten altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

analysis-thylakoid-membrane-protein-complexes-blue-native-gel

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In deze video, beschrijven we de karakterisering van multiprotein complexen (MPL), door blauwe inheemse polyacrylamide gel elektroforese (BN-PAGE). In een eerste dimensie, worden gedialyseerd cellulaire lysaten gescheiden door BN-PAGE om individuele Mediterrane partnerlanden te identificeren. In een tweede dimensie SDS-PAGE, zijn mediterrane partnerlanden van belang verder onderverdeeld naar hun kiezers te analyseren door immunoblotting.

Blauwe Inheemse polyacrylamidegelelektroforese (BN-PAGE) voor de Analyse van multiprotein complexen van Cellular Lysaten

In this video, we demonstrate an electrophoretic technique, called blue native PAGE, for the analysis of mitochondrial respiratory protein complexes in their natively folded and functionally active state. The anionic Coomassie blue dye causes the protein complexes to become negatively charged, allowing separation based on size and structure.

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis: A Non-Denaturing Separation Technique for Analysis of Intact Mitochondrial Respiratory Chain Complexes

De beschreven vergelijkende, kwantitatieve proteomics aanpak is gericht op het verkrijgen van inzicht in de samenstelling van multiprotein complexen onder verschillende omstandigheden en wordt aangetoond door het vergelijken van genetisch verschillende stammen. Voor kwantitatieve analyse gelijke volumes van verschillende fracties van een sucrose dichtheidsgradiënt gemengd en geanalyseerd met massaspectrometrie.

Een nieuwe aanpak voor de Vergelijkende analyse van de multiprotein Complexen Gebaseerd op<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabole Labeling en kwantitatieve massaspectrometrie

Dit protocol beschrijft hoe je clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE) kunt voorbereiden en uitvoeren, een native scheidingstechniek voor niet-covalente biomoleculaire assemblages en eiwitten uit heterogene monsters die compatibel is met verschillende downstream-eiwitanalysetechnieken.

CN-GELFrEE - Clear Inheems Gel-uitgewassen vloeibare fractie Entrapment elektroforese

De Tandem Affinity Purification (TAP) methode is veel gebruikt om native complexen te isoleren uit cellulaire extracten, voornamelijk eukaryotisch, voor proteomics. Hier presenteren we een TAP-methodeprotocol dat is geoptimaliseerd voor de zuivering van native complexen voor structurele studies.

Zuivering van Inheemse Complexen voor de structurele studie Met behulp van een Tandem Affinity Tag Method

Hier presenteren we protocollen voor affiniteitszuivering van eiwitcomplexen en hun scheiding door blauwe natieve PAGE, gevolgd door proteïne correlatie profilering middels label vrije kwantitatieve massaspectrometrie. Deze methode is nuttig voor interactomen in verschillende proteïnecomplexen lossen.

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

Dit protocol beschrijft de scheiding van functionele mitochondriale elektronen transportketen complexen (Cx) IV en supercomplexen daarvan door gebruik te maken van natieve elektroforese om informatie over hun montage en structuur te onthullen. De inheemse gel kan onderworpen worden aan immunoblotting, in-gel assays, en zuivering door elektroelutie om individuele complexen verder te karakteriseren.

Analyse van supercomplexen van de Mitochondrial Electron Transport Chain met Native Electrophoresis, In-gel Assays, en Electroelution

Wij presenteren protocollen hierin voor hoog rendement isolatie van fysiologisch actief ze en eiwit vervoer testen voor de chloroplast twin arginine translocatie (cpTat), secretoire (cpSec1) en signaal erkenning deeltje (cpSRP) trajecten.

Isolatie van fysiologisch actief thylakoiden en hun gebruik in energie-afhankelijke proteÃ¯ne vervoer Assays

Hier presenteren we een protocol om te scheiden van ontbindend thylakoïde complexen door Native groen gelelektroforese. Groene gel banden worden vervolgens gekenmerkt door tijd gecorreleerd Single Photon Counting (TCSPC) en basisstappen voor data-analyse worden verstrekt.

Scheiding van spinazie thylakoïde eiwitcomplexen door elektroforese van het Gel van de Native groen en karakterisering van de Band met Time-Correlated Single Photon Counting

Dit protocol wordt de analyse van mitochondriale respiratoire ketencomplexen blauwe inheemse polyacrylamide-gel-elektroforese. De methode toegepast op gekweekte menselijke cellen wordt hier beschreven.

Analyse van mitochondriale respiratoire ketencomplexen in gekweekte menselijke cellen met blauwe Native Polyacrylamide-Gel-elektroforese en Immunoblotting

Hier presenteren we een protocol te halen, op te lossen en te identificeren mitochondriale supercomplexen die blootstelling aan detergenten en Coomassie blauw minimaliseert. Dit protocol biedt een optimaal evenwicht tussen resolutie, en behoud van enzymactiviteiten, terwijl het minimaliseren van het risico om labiele proteïne-eiwitinteractie te verliezen.

Hybride duidelijke/blauwe inheemse elektroforese voor de scheiding en de analyse van mitochondrial Ademhalingsketen supercomplexen

Leer de analyse van thylakoïde-eiwitcomplexen in planten met blauwe native PAGE en 2D-SDS-PAGE. Deze methode onthult functionele interacties en organisatie van photosynthetische complexen.

Analyse van eiwitcomplexen thylakoïde membraan door blauwe inheemse gelelektroforese

Meer video's verkennen