Analyse van eiwitcomplexen thylakoïde membraan door blauwe inheemse gelelektroforese

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de samenstelling en dynamische organisatie van de fotosynthetische eiwitcomplexen in plant thylakoid membraan. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de analyse van functionele interacties tussen inheemse eiwitcomplexen mogelijk maakt en de plasticiteit van de eiwitcomplexe organisatie in wisselende omgevingsomstandigheden opheldert. Stel de gel caster acht centimeter bij 10 centimeter platen volgens de instructies van de fabrikant met behulp van 0,75-millimeter afstandhouders.

Plaats een gradiëntmixer op een roerplaat en sluit deze aan bij de peristaltische pomp door buizen te maken. Bevestig een spuitnaald aan de andere kant van de slang en plaats de naald tussen de glas- en aluminiumplaat. Plaats een magnetische roerder in de zware kamer.

Bereid 3,5% en 12,5% acrylamide oplossingen in 15-milliliter conische centrifuge buizen zoals beschreven in het tekstprotocol te gebruiken voor de scheiding gel gradiënt. Om vroegtijdige polymerisatie te voorkomen, houdt u de centrifugebuizen op ijs terwijl u de oplossingen voorbereidt. Voeg 5%APS en TEMED toe vlak voordat de oplossingen aan de verloopmixer worden toegevoegd.

Pipette de 12,5%-oplossingen voor de zware kamer. Verwijder luchtbellen uit het kanaal dat de licht- en zware kamer verbindt door de klep te openen die de twee kamers verbindt, waardoor de oplossing naar de lichtkamer kan worden ingevoerd. Sluit de klep en pipet de sporen van de oplossing terug naar de zware kamer.

Tot slot, pipet de 3,5%-oplossing voor de lichtkamer. Schakel de magneetroerder in. Open de kleppen en schakel de peristaltische pomp in.

Laat de geloplossingen tussen de glas- en aluminiumplaat stromen met een stroomsnelheid van ongeveer 0,5 milliliter per minuut. De naald moet te allen tijde boven de vloeistof staan. Wanneer de zware en lichte kamers hebben geleegd vul ze met ultrazuiver water.

En laat water om zachtjes overlay de gel oppervlak. Gelpolymeerisatie duurt ongeveer een tot twee uur bij kamertemperatuur. Bereid de 3%acrylamide oplossing voor de stapelgel op kamertemperatuur.

Pipette de stapelen gel op de top van de gepolymeriseerde scheiding gel en plaats een monster gel kam tussen het glas en aluminium plaat vermijden luchtbellen. Nadat de gel 30 tot 60 minuten op kamertemperatuur heeft gepolymeriseerd, verwijdert u de kam voorzichtig onder ultrazuiver water. Op dit punt kan de gel worden opgeslagen bij positieve vier graden Celsius in vochtige omstandigheden voor een paar dagen.

Verdun geïsoleerde thylakoïden met ijskoude 25BTH20G buffer tot een definitieve chlorofylconcentratie van één milligram per milliliter. Bereid twee buizen voor elk thylakoïde monster om zowel bèta-DM als digitonin oplosbilisatie uit te voeren. Voeg nu een gelijk volume wasmiddel buffer.

Meng het wasmiddel en thylakoïde monster voorzichtig met een pipet en vermijd het maken van luchtbellen. Solubilize de thylakoïden gedurende twee minuten op ijs voor de beta-DM oplosbilisatie. Of 10 minuten bij kamertemperatuur met continu zachte mengen op een rocker of shaker voor de digitonin oplosbilisatie.

Verwijder na incubatie het onoplosbare materiaal door centrifugatie op 18.000 g gedurende 20 minuten bij positieve vier graden Celsius. Breng de supernatant naar een nieuwe 1,5-milliliter buis en voeg 1/10 volume van Coomassie briljante blauwe buffer aan het monster. Zet de gel in een verticaal elektroforesesysteem.

Vul de bovenste bufferkamer met blauwe kathodebuffer en giet anodebuffer naar de onderste bufferkamer. Laad de thylakoïde monsters in de putten. Start de elektroforese en verhoog geleidelijk de spanning zoals vermeld in het tekstprotocol.

Voer de gel op positieve vier graden Celsius, hetzij met behulp van een koude kamer of het aanpassen van de gel temperatuur met een koelsysteem. Verander de blauwe kathodebuffer in een duidelijke kathodebuffer wanneer het monsterfront ongeveer 1/3 van de gel heeft gemigreerd. Na de elektroforetische run scan de gel met een fotoscanner voor beeldarchivering.

Voor het uitvoeren van 2-SDS PAGE monteren van de verticale elektroforese systeem met behulp van een millimeter afstandhouders. Bereid een standaard SDS gel met een 2D-kam zoals beschreven in het tekstprotocol. Snijd de baan van de BN gel en plaats deze in een buis van vijf milliliter.

Voeg vervolgens twee milliliter Laemmli buffer en incubeer de strip gedurende 45 minuten met zachte schudden bij kamertemperatuur. Plaats de baan met behulp van een spacer op de top van de gel het vermijden van luchtbellen. Pipette vijf microliters van moleculair gewicht marker op een smal stuk filter papier en plaats het papier in de standaard put.

Om de BN gel strip en de marker papier te verzegelen giet een 0,5%agarose in lopende buffer op de top van de gel strip en laat het stollen. Elektroforese uitvoeren volgens standaardprotocollen. Na de elektroforetische run visualiseren de eiwitten met SUPRO Ruby vlek of zilver vlekken.

Representatieve resultaten van thylakoïde eiwitcomplexe patronen van bèta-DM en in opgetallen oplosbaar monsters worden hier weergegeven. De kleine complexen migreren sneller tijdens de elektroforetische run en bevinden zich daarom in het onderste deel van de gel. Terwijl de grote complexen zich in het bovenste deel van de gel bevinden.

Digitonin behoudt over het algemeen eiwitcomplexen in grotere samenstellingen, terwijl bèta DM de interacties tussen de complexen interfereert met labiele eiwit-eiwitinteritussen. De subunit samenstelling van eiwitcomplexen van bèta-DM en digitonin-oploskte thylakoïden worden hier gepresenteerd. De subeenheden van elk complex zijn te vinden vanaf de verticale lijn onder het uitgelijnde complex.

In principe vertegenwoordigt elke plek in de 2D gel een individueel eiwit. Maar in de praktijk kunnen verschillende eiwitten van dezelfde moleculaire massa op één plek aanwezig zijn. De identificatie van de vlekken is gebaseerd op massaspectrometrie analyse.

Na het toepassen van deze procedure kan men met andere methodes zoals elektronenmicroscopie en enige deeltjesanalyse van de eiwitcomplexen voortzetten die van de blauwe inheemse gel worden ontlokt om structurele inzichten in de eiwitcomplexen te krijgen. Om onbekende eiwitsubeenheden te identificeren kunnen de individuele eiwitvlekken van tweedimensionale SDS PAGE worden geanalyseerd met massaspects. Vergeet niet dat het werken met acrylamide en digitonine uiterst schadelijk kan zijn en voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van beschermende handschoenen moeten altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.