Elektrofysiologische opname van de activiteit van het centrale zenuwstelsel van derde-Instar Drosophila Melanogaster

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van insectentoxicologie en insectenfysiologie door het meten van de elektrogenese van het Drosophila melanogaster centrale zenuwstelsel. Dit maakt het mogelijk om een breed scala van wetenschappelijke hypothesen te testen en te helpen bij de ontdekking van nieuwe insecticide werkingswijzen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige, reproduceerbare en relatief hoge doorvoer systeem met minimale financiële input om het zenuwstelsel van Drosophila studie biedt.

Open om te beginnen de acquisitie/analyse software. Klik op Instellen op de hoofdwerkbalk en selecteer Kanaalinstellingen, waarmee een dialoogvenster wordt geopend. Verlaag het aantal totale kanalen tot drie.

Kanaal een zal het ruwe signaal van de versterker met een bereik van 100 millivolts. Kanaal twee wordt gebruikt om het aantal gebeurtenissen van kanaal één te tellen dat zich boven een bepaalde drempelwaarde bevindt. Klik hiervoor op het tabblad Berekening om een vervolgkeuzemenu voor kanaal twee te openen.

Selecteer Cyclische metingen, waarmee een tweede dialoogvenster wordt geopend. Selecteer kanaal één als bron. Selecteer vervolgens in de vervolgkeuzelijst meting Eenheidspie bij gebeurtenissen.

Selecteer ten slotte in het gebied detectie-instellingen in het vervolgkeuzemenu de optie Eenvoudige drempelwaarde. Het drempelniveau wordt ingevoerd op het detectieverstellingsvenster dat boven achtergrondgeluid moet worden ingesteld. Als u de elektrische activiteit wilt omzetten in een tariefplot uitgedrukt in hertz, selecteert u Rekenen op het derde kanaal.

Op het nieuwe venster, input 1000 keer smoothsec, haakjes kanaal twee komma twee. Selecteer vervolgens in het vervolgkeuzemenu van de eenheden de frequentie-eenheid hertz. Sluit de dialoogvensters om terug te keren naar het hoofdscherm.

De y-as van kanaal drie moet worden uitgedrukt in hertz en de x-as in de tijd. Ontleden de larve Drosophila CNS door eerst het identificeren en extraheren van een zwervende derde-instar Drosophila melanogaster uit de cultuur flacon en het plaatsen van het in 200 microliters van zout. Pak vervolgens de mondhaken met een paar fijne tangen en pak de buik van de made met een tweede paar tangen, met lichte druk, om te voorkomen dat de dunne cuticulaire laag wordt gescheurd.

Trek voorzichtig de mondhaken en buik in verschillende richtingen om het caudale uiteinde van de made te scheiden van het hoofdgebied en de ingewanden van de made bloot te leggen. Het CZS zal worden verweven met de luchtpijp en het spijsverteringskanaal. Plaag het CZS uit het spijsverteringskanaal en luchtpijp met tangen.

De dissectie van het Drosophila centrale zenuwstelsel van de made is een cruciale stap voor succes. De ontleede ganglia moet intact zijn, zonder noemenswaardige schade aan de dalende motorzenuwen. Een groter aantal motorische zenuwen aan de ganglia zal de uitgangsfrequentie verhogen.

Indien nodig, verstoren de bloed-hersenbarrière door handmatig transecting de CNS achterste naar de hersenklobben met Vannas lente schaar. De transsectie moet worden gedaan op basis van de fysiochemische eigenschappen van de chemische stof die wordt gebruikt. De rode lijn is de voorgestelde transsectie punt en de doorgesneden CNS met intact dalende perifere zenuwstammen hier weergegeven.

Om te beginnen, trek eerst de glas pipetelektrode uit borosilicaat glazen haarvaten naar een weerstand van vijf tot 15 megaohms. Steek het doorgesneden CZS in een waskamer met 200 microliter zout. Klem een ongecoate insectenspeld met een alligatorclip gesoldeerd aan de gronddraad en steek de pin in de zoutoplossing om het circuit te voltooien.

Oriënteren de elektrode met behulp van de micromanipulatoren naar het caudale uiteinde van het getransecteerde CZS. Elimineer achtergrondgeluid door het drempelniveau in de acquisitie-/analysesoftware aan te passen voordat de perifere zenuwstammen worden aangesloten. Breng lichte negatieve druk op de spuit aan om perifere zenuwen in de zuigelektrode te trekken.

Start de opname op de software voor gegevensacquisitie en de startsnelheid van de basislijn om vijf minuten te equiliberen voordat basislijnsnelheidgegevens worden verzameld. Voeg na vijf minuten 200 microliter zout en voertuig toe om het totale volume van de kamer op 400 microliters te brengen om te beginnen met het registreren van de vuursnelheid. Gooi het preparaat en de opname weg als het patroon van het afvuren van de controlebehandeling niet vergelijkbaar is met het hier getoonde voorbeeld.

Wanneer de uitgangswaarde na drie tot vijf minuten van de registratie is vastgesteld, trekt u 200 microliter zout en voegt u 200 microliter van het experimentele middel toe dat in zoutoplossing is opgenomen. Label dit keer punt van drug toepassing in de overname / analyse software door het opnemen van een opmerking die de drug en de uiteindelijke concentratie omvat. Hier is een representatieve zenuwontlading spoor voor en na blootstelling aan DMSO.

De pijl geeft het tijdstip van de toepassing aan. Een beperkte reactie op DMSO wordt gezien. Toenemende doses propoxur versterkten de piekaflossingsfrequentie van de doorgesneden Drosophila CNS op een concentratieafhankelijke manier, terwijl het neurodepressivum GABA de piekaflossingsfrequentie op een concentratieafhankelijke manier verminderde.

Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat het een ex vivo experiment is, en daarom zijn de voorwaarden van de zoutoplossing, zoals pH en temperatuur, van cruciaal belang voor langdurige activiteit van de voorbereiding van het centrale zenuwstelsel. Ook het gebrek aan externe elektrische activiteit, een effectieve Kooi van Faraday en een vermindering van 60-hertz ruis zijn van cruciaal belang voor het succes van deze test. De gegevens die via deze test worden verzameld, kunnen helpen bij het identificeren van de specifieke werkingswijze van insecticiden.

Latere validatie van deze gegevens door middel van andere methoden, zoals spanning-klem elektrofysiologie, biochemische analyses, en extra farmacologische tests kunnen worden uitgevoerd.