Individuele kweken van Tigriopus copepoden en kwantitatieve analyse van hun stuurman bewaken gedrag

Het belangrijkste voordeel van deze kweektechniek is dat je maagdelijke roeipootkreeften verkrijgen terwijl je hun koppelingservaring controleert en hun ontwikkeling volgt. De volgende gedragsanalyse methode kan helpen gecontroleerde en reproduceerbare experimenten op de mate-guarding gedrag van de Tigriopus roeipootkreeften die gemeenschappelijk zoöplankton in rotsachtige getijdenpoelen. Hoewel deze methoden inzicht kunnen geven in het voortplantingsgedrag van Tigriopus, kunnen ze ook worden gebruikt om te kijken naar hoe genetische en omgevingsfactoren de fysiologie en het gedrag van deze roeipootkreeften beïnvloeden.

Om te beginnen, gebruik maken van een Pasteur pipet om gravid vrouwtjes die duidelijke oranje eieren uit de voorraad cultuur te verzamelen. Spoel de vrouwtjes met schone cultuur medium via zachte pipetting. Plaats vervolgens elk vrouwtje in een individuele put van een zes-goed cel cultuur plaat met schone cultuur medium.

Plaats vervolgens de plaat in een couveuse om de vrouwtjes te cultuuren totdat ze eierzakjes vrijgeven. Nadat de eierzakjes zijn vrijgegeven, gebruikt u een Pasteur pipet om de vrouwtjes uit de putten van de plaat te verwijderen. Zodra dieren in de eerste copepodid fase of CI beginnen te ontstaan, gebruik maken van een P-10 micropipet om ze te verzamelen.

Elke twee tot drie dagen, controleer de putten voor vermolken exuviae. Na deze, seks de dieren door het onderzoeken van hun antenne morfologie. Om volwassen vrouwen correct te identificeren, zorg ervoor dat ze al vijf exuviae in cultuurputten hebben vermolken, omdat verschillen in vorm van antennes tussen volwassen vrouwen en jongeren in sommige populaties niet zichtbaar significant zijn.

Na het selecteren van dieren van het juiste stadium en geslacht, voer de geselecteerde individuen met fijn gemalen visvoedsel. Terwijl de dieren eten, bereiden twee 48-goed platte bodem cel kweekplaten als testkamers. Na 30 minuten zijn verstreken, spoel elk dier door pipetting in een opeenvolging van vier putten van een 24-put plaat gevuld met schoon kunstmatig zeewater.

Plaats vervolgens de gespoelde personen in de putten van de platen A en B op het LED-lichtkussen. Laat de dieren 30 minuten acclimatiseren en gebruik vervolgens een Pasteur-pipet om de doelen van plaat B naar plaat A over te brengen.Laat een mannetje en een doel in elke put interageren voor de aangewezen observatietijd voordat u de video-opname stopt. Eerst, onderzoek de video voor de timing wanneer elk doel werd overgebracht naar een put op plaat A.Next, definieer de initiatie van een bewakingspoging door een man als een contact van de antenne van de man met een lichaamsdeel van het doel.

Definieer de beëindiging van de bewaking poging door een man als het punt waarop zowel van de antenne van de man los te maken van het lichaam van het doel. Definieer vervolgens de inleiding van de copulatie door een ruglichaambocht van een mannetje, gevolgd door een repetitieve pers van het urosome tegen dat van het vrouwtje. Genereer eerst een videoclip met de aflevering van belang door de film bij te snijden met software voor het bewerken van films.

Open vervolgens ImageJ en importeer de videoclip. Selecteer de 8-bits grijswaardenoptie voor 8 bits om het geheugen dat nodig is voor beeldverwerking te verminderen. Selecteer vervolgens het gereedschap voor de selectie van de rechte lijn voor ruimtelijke kalibratie en teken een selectielijn langs de diameter van de put.

Open het ingestelde schaalmenu en voer de bekende lengte in in het bekende afstandsvak en het apparaat in het vak lengte. Open hierna het eigenschappenmenu en voer het frameinterval in het frameintervalvak in. Open de MTrackJ plugin door plug-ins en MtrackJ te selecteren.

Klik vervolgens op de trackingknop in het dialoogvenster om het configuratiemenu voor bijhouden te openen. Controleer het toepassen van lokale cursor snapping tijdens het bijhouden en selecteer donkere centroid als een snap-functie. Klik vervolgens op de knop Toevoegen in het dialoogvenster MTrackJ om te beginnen met bijhouden.

Plaats een cursor om de personen in de te volgen videoclip te bedekken. Klik vervolgens om de donkere centroid van het object binnen het vierkant te detecteren. Als u gegevenstabel wilt genereren, klikt u op de tabel meten in het dialoogvenster MTrackJ en klikt u vervolgens op de filmknop om een film te genereren met de bijgehouden traject getekend als een gekleurde lijn.

Klik ten slotte op de knop Opslaan in het dialoogvenster MTrackJ om de resultaten op te slaan, inclusief de gegevens in de bijgehouden tweedimensionale traject. In dit experiment werd het stuurbewakende gedrag van Tigriopus-roeipootkreeften geregistreerd en waargenomen. Analyse toont een verschil in de gemiddelde duur van het bewaken van pogingen tussen man-vrouw paren en man-mannelijke paren van Tigriopus californicus waar mannen in de man-mannelijke paren tentoongesteld relatief kortere duur van pogingen dan die in man-vrouw paren.

Twee dimensie ruimtelijke tracking van nieuw gevormde bewaken paren van Tigriopus californicus bleek dat man-mannelijke paren de neiging om een hogere snelheid dan man-vrouw paren te tonen in de eerste drie seconden van het bewaken van pogingen. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van ethologie, biochemie en evolutionaire genetica om het unieke paringssysteem van dit soort roeipootkreeften te verkennen.