Phospho Stroom Cytometry met fluorescerende cel Barcoding voor eencellige signalering analyse en ontdekking van Biomarker
October 4th, 2018
Hier, wordt een protocol voor de analyse van de middellange - tot hoog-productie van proteïne fosforylatie gebeurtenissen op cellulair niveau gepresenteerd. Phospho stroom cytometry is een krachtige aanpak van signalering aberraties karakteriseren, identificeren en valideren van biomarkers en farmacodynamica beoordelen.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van celbiologie en immunologie, zoals hoe worden signaleringstrajecten beïnvloed door verschillende stimuli of medicijnen? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het u toelaat om eencellige signalering analyse uit te voeren in de medium tot hoge doorvoer mode. Na het opnieuw ophangen van de cellen in het aanvullende RPMI 16/40-medium, breng je de vereiste hoeveelheid celsuspensie over naar de putten van een 96-put V-bodemplaat.
Breng de plaat naar een voorverwarmd waterbad van 37 graden Celsius en laat het daar 10 minuten rusten. Voeg vervolgens 60 microliter vaste buffer een aan elke put van een nieuwe 96 put plaat om het opzetten van de fix plaat. Plaats deze plaat in het 37 graden Celsius waterbad.
Breng een 50 microliter controlemonster naar de plaat en meng door pipetting op en neer. Voeg optioneel 10 microliter per milliliter anti-IgM toe aan de cellen om de simulatietijdcursus te starten en te mixen door op en neer te pipetten. Breng een monster van 50 microliter op elk moment naar de fixplaat en meng elk monster terwijl het wordt toegevoegd.
Nadat het laatste monster is toegevoegd, laat u de fixplaat 10 minuten in het waterbad. Eerst, was de cellen drie keer met PBS. Centrifuge de plaat op 500 keer G gedurende vijf minuten en gooi de supernatant.
Bereid vervolgens een verse 96 goed V-bodem plaat met barcoding reagentia, door pipet vijf microliters van elke barcoding reagens in elke put vullen van het aantal putten die nodig zijn om elk van de monsters vlek. In de vaste celplaat, resuspend de cellen in elke put met 190 microliters van PBS. Breng vervolgens elke put van cellen over naar de overeenkomstige put in de barcodingplaat en meng elk goed grondig.
Laat de plaat 20 minuten rusten op kamertemperatuur in het donker. Centrifuge de plaat op 500 keer G gedurende vijf minuten en gooi de supernatant. Na deze, was de cellen in elke put twee keer met de stroom wassen.
Voeg vervolgens 190 microliter flow wash toe aan elke put van cellen. Combineer alle barcodemonsters in één buis van 15 milliliter en breng elke compensatiecontrole over naar een aparte buis van 1,7 milliliter. Centrifuge op 500 keer G gedurende vijf minuten en gooi de supernatant.
Om te beginnen, breng twee milliliter perm buffer drie tot een 15 milliliter buis. Bewaar op min 20 graden Celsius dus het zal ijskoud zijn wanneer het wordt gebruikt. Voeg 1,5 milliliter ijskoude permanent buffer toe aan de 15 milliliter buis met de barcodecelpopulatie dropwise terwijl je moet draaien om celklonteren te voorkomen.
Voeg op dezelfde manier 100 microliter ijskoude permanent buffer toe aan elk van de compensatiecontroles. Breng de cellen onmiddellijk gedurende minimaal 30 minuten over naar een vriezer bij min 80 graden Celsius. Wanneer u klaar bent om te beginnen met antigeen kleuring, verwijder de cellen uit de vriezer en breng ze naar een doos ijs.
Was de cellen drie keer met een teveel aan flow wash. Centrifugeren de cellen op 500 keer G en vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en schort de barcodecelpopulatie opnieuw op in een volume van flow wash, zoals dat er 25 microliters celsuspensie per fosfo-antilichaamvlek is.
Schort de compensatiecontroles opnieuw op in 200 microliters van flow wash. Om te beginnen met het voorbereiden van antilichamen voor vlekken, voeg 10 microliters van fosfo-specifieke antilichaam, verdund in flow wash, om elke put van een verse 96 goed V-bodem plaat. Voeg 15 microliter oppervlaktemarkering, verdund in flow wash en 25 microliter celsuspensie toe aan elke put voor een eindvolume van 50 microliters per put.
Laat de cellen 30 minuten rusten bij kamertemperatuur in het donker. Daarna was je de gekleurde cellen twee keer met flowwash. Centrifuge op 500 keer G gedurende vijf minuten.
Gooi de supernatant weg en schort de cellen opnieuw op in 150 microliter van flow wash. Voer vervolgens de analyse van de stroomcytometrie uit zoals beschreven in het tekstprotocol. In het gepresenteerde protocol wordt driedimensionale barcoding uitgevoerd door drie barcoding-kleurstoffen te combineren.
Individuele monsters worden vervolgens gede-convoluted door latere gating op elke barcoding reagens versus kant strooigebied. De basale en stimulatie geïnduceerde fosforylatieniveaus van 20 signaalmoleculen stroomafwaarts van de B-celreceptor worden vervolgens gekenmerkt in B-cellen van CLL-patiënten en normale controles onder verschillende omstandigheden. De stat3 fosfo tyrosine 705 wordt gezien als aanzienlijk omhoog geregeld.
Cellen worden gestimuleerd met anti-IgM voor maximaal 30 minuten om signalering aberraties veroorzaakt door de B-cel receptor route te identificeren. Terwijl CLL-cellen van patiënten met ongemuteerde IGVH een verhoogde gevoeligheid voor anti-IgM-stimulatie vertonen, is het alleen statistisch significant voor AKT-fosfor serine 473. Cellen worden vervolgens blootgesteld aan de PI 3-kinase delta remmer idelalisib om te testen of de afwijkende AKT pS473 signaal kan worden omgekeerd.
Zoals hier getoond, worden de afwijkende niveaus aanzienlijk verminderd bij behandeling op een concentratieafhankelijke manier die aantoont dat kinaseremmers kunnen worden toegepast om afwijkende signalering in CLL-cellen te normaliseren. Voordat u deze procedure probeert, is het belangrijk om te onthouden dat reagentia en antilichamen van barcoding worden getiterd en controleren of geselecteerde oppervlaktemarkers compatibel zijn met fixatie- en permeabilisatiereagentia. De cellen moeten worden in suspensie voor fosfor analyse, nog steeds het protocol kan worden aangepast aan afwijkende cellen of weefsel na procedures om eencellige suspensie te verkrijgen, zoals hele trypzination.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor medium- tot hoog-doorvoeranalyse van eiwitfosforyleringsgebeurtenissen op cellulair niveau met behulp van fosfo flowcytometrie. Deze methode is effectief voor het karakteriseren van signaaloverschrijdingen, het identificeren en valideren van biomarkers, en het beoordelen van farmacodynamica.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Immunologie
- Signaaloverdracht
Achtergrond
- Fosfo flowcytometrie maakt single-cell signaalanalyse mogelijk.
- Deze techniek kan aantonen hoe signaalroutes worden beïnvloed door verschillende stimuli of geneesmiddelen.
- Het is geschikt voor medium tot hoge doorvoeranalyse.
- De methode verbetert de mogelijkheid om cellulaire reacties op gedetailleerd niveau te bestuderen.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbaar protocol te bieden voor het analyseren van eiwitfosforylering.
- Om de identificatie van biomarkers in cellulaire signalering te vergemakkelijken.
- Om de farmacodynamica van verschillende behandelingen te beoordelen.
Gebruikte methoden
- Cellen worden opgeschort in aangevuld RPMI 16/40 medium.
- Een bepaalde hoeveelheid celsuspensie wordt overgebracht naar een 96-well V-bodemplaat.
- De plaat wordt geïncubeerd in een voorverwarmd waterbad op 37 graden Celsius.
- Gefixeerd buffer wordt toegevoegd om de fixatieplaat voor analyse op te zetten.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt efficiënte analyse van signaalroutes mogelijk.
- Het biedt inzicht in de effecten van geneesmiddelen op cellulaire signalering.
- Single-cell resolutie verbetert het begrip van cellulaire reacties.
- Resultaten kunnen leiden tot de identificatie van potentiële therapeutische doelen.
Conclusies
- Fosfo flowcytometrie is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van eiwitfosforylering.
- Het protocol maakt hoge doorvoeranalyse mogelijk, waardoor het toegankelijk is voor verschillende onderzoekstoepassingen.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze methode om complexe signaalnetwerken te verkennen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Phospho flow cytometry with fluorescent cell barcoding enables medium- to high-throughput single-cell analysis of protein phosphorylation, supporting target validation and biomarker discovery in oncology and immunology. By quantifying drug-induced signaling changes at single-cell resolution, the method enhances predictive confidence in preclinical models and informs go/no-go decisions in therapeutic development. Its compatibility with standard cytometer hardware allows scalable integration into discovery workflows for pathway interrogation and pharmacodynamic assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring phosphorylation dynamics of signaling proteins downstream of receptors such as B cell receptor in disease-relevant cells.
- Operational Value: Enables functional target validation through multiplexed detection of 20 signaling molecules in primary patient-derived cells under stimulated and inhibited conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying aberrant nodes like AKT pS473 and STAT3 pY705 that correlate with drug sensitivity and resistance mechanisms.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Fluorescent cell barcoding allows pooling of multiple samples and conditions into a single tube, increasing throughput and reducing run-to-run variability on standard flow cytometers.
- Quantitative Output: Generates single-cell resolution data on phosphorylation levels, enabling dose-response analysis of kinase inhibitors such as idelalisib in CLL models.
- Platform Reuse: Standardized fixation, permeabilization, and antibody staining steps support adaptation across immune cell types and stimulation paradigms for longitudinal screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses primary CLL patient cells to model signaling aberrations, providing a clinically relevant system for evaluating targeted therapies.
- Translational Continuity: Links ex vivo drug response to biomarker discovery by correlating pS473 reduction with IGVH mutation status, supporting patient stratification strategies.
- Mechanistic De-risking: Demonstrates reversal of aberrant signaling by PI3Kδ inhibition, validating target engagement and mechanism of action for kinase inhibitors in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through lead optimization to preclinical efficacy testing, particularly in immunology and oncology programs focused on signal transduction modulators.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying stimulus-induced phosphorylation changes in primary human B cells, clarifying pathway activation states under basal and drug-treated conditions.
- Screening: Enables reproducible, multiplexed assessment of compound effects on signaling networks, with barcoding facilitating side-by-side comparison of doses, time points, and genetic backgrounds.
- Analytics: Delivers quantitative, single-cell phosphorylation readouts that allow statistical comparison of signaling states across conditions, supporting biomarker threshold setting and response classification.
- Translational Research: Connects in vitro drug response to ex vivo biomarker validation using primary CLL specimens, aligning with preclinical-to-clinical transition criteria.
- Enterprise Reuse: Standardized reagent panel and barcoding strategy allow reuse across projects studying cytokine signaling, antigen receptor activation, or drug mechanism in immune and malignant cell populations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking receptor stimulation to downstream effector phosphorylation at single-cell resolution in heterogeneous primary cell samples.
- Operational Value: Standardized workflow with barcoding increases sample throughput, minimizes technical variance, and maximizes instrument utilization on existing flow cytometry platforms.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early evidence of target modulation and pathway inhibition, reducing investment in compounds with insufficient biological activity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of leads based on target engagement and signaling normalization in disease-relevant human cells.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, antibody titration, and phospho-specific reagent validation to ensure signal specificity and minimize background.
- Dependent on access to flow cytometers with sufficient laser and detector configuration for multiplexed phospho- and surface marker panels.
- Necessitates standardization of fixation, permeabilization, and washing steps across users and sites to maintain reproducibility of phosphorylation signals.
- Requires optimization of barcoding reagent concentrations to avoid spectral overlap and ensure accurate sample deconvolution during analysis.
- Limited to cells in suspension; adherence-dependent or tissue samples require prior dissociation to single-cell suspension using validated enzymatic or mechanical methods.
