Name: Meten lever mitochondriale zuurstofverbruik en Proton lek kinetiek te schatten van mitochondriale ademhaling in Holstein melkvee (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-30T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Leer mitochondriale zuurstofconsumptie meten in lever van Holstein melkvee om proton lek en ademhalingsefficiëntie te evalueren. Deze methode verbetert inzicht in mitochondriale functie en voederefficiëntie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gesteund door Alltech en USDA Hatch fondsen door het centrum voor levensmiddelen, diergezondheid bij UC Davis School voor diergeneeskunde.

Alle methoden, protocol en studies die hier beschreven werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Californië, Davis.
1. het verkrijgen van een lever biopsie van een melkkoe van Holstein
Opmerking: Een lever biopsie moet worden uitgevoerd door een erkende dierenarts. Lever biopten kunnen worden uitgevoerd op de zuivel-site waar de koeien zich bevinden. Zogende melkkoeien kunnen blijven normaal worden gemolken en melk hoeft niet te worden onttrokken aan de voedselvoorziening voor of na de ingreep. Het wordt aangeraden dat er minstens 4 personen nodig zijn voor het uitvoeren van de lever biopsie op een melkkoe: een dierenarts uit te voeren van de biopsie, een dierlijke handler te staan op de koemelk hip de biopsie gebied en de dierenarts, een lab technicus op de buitenkant van de pen om transf te beschermen Translator tools, materialen en biopsie proef en naar de dierenarts en handhaven van de schone omgeving, die in de achterkant van een voertuig (Figuur 1), en een technicus worden kan voor het ophalen van de lever monster en beginnen mitochondriale isolatie.
<ol><li>Één maand vóór de biopsieën van het lever, koeien geven een clostridia vaccinatie. Maken van chirurgische packs door autoclaaf chirurgische handdoeken, biopsie instrument, scalpel houders en chirurgische apparatuur.</li>
	<li>Een dag voordat de lever biopsie, injecteren de koe met Ceftiofur Hydrochloride 0,044 mL/kg lichaamsgewicht subcutaan in de nek. Controleren van de temperatuur van de koe, inname en fecale scores te gebruiken als een basislijn voor normale functie.</li>
	<li>Mitochondriën isolatie media (MIM) containining 220 mM mannitol, sacharose 70 mM, 20 mM HEPES, 1 mM EDTA en 0,1% (g/v) vetzuur gratis BSA, pH 7.4 maken bij 4 ° C. Ongeveer 30 mL per monster nodig zullen zijn.</li>
	<li>Beperken van koe fysiek met behulp van een wurggreep met een halster desgewenst (Figuur 2). Met behulp van de halter, binden haar hoofd naar de linker kant van de staander. Indien nodig, een chemische terughoudendheid (Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV op 0.010-0,015 mg/kg lichaamsgewicht) kan worden gebruikt.</li>
	<li>Het gebied van de biopsie is gevonden op de recht 10 - 11e intercostale ruimte (Figuur 3). Een rechte lijn trekken met de juiste Knol coxae tot het punt van de rechterschouder. De biopsie site is waar deze lijn kruist met de 10-11e intercostale ruimte. Steriliseren van het gebied van de koe als biopsied door het scheren van een 10 cm vierkante ruimte (Figuur 4). Wassen gebied met 10% providone scrub (Figuur 5) met behulp van een cirkelvormige beweging. Spray gebied met 70% ethanol oplossing (Figuur 6). Terugkerende providone en ethanol wast. Opmerking: De lever is in een enigszins andere positie in Holstein melkvee in vergelijking met runderen.</li>
	<li>Injecteren van 2% lidocaïne HCl (10-15 mL) lokaal naar het gebied te verstrekken van de verdoving van de huid en de onderliggende spier en bindweefsel (Figuur 7). Herhaal providone en 70% ethanol wast. Opmerking: De zenuwuiteinden in de huid en spier, maar geen inwendige organen, dus alleen een lokale anesthestic is nodig. De koe moet hooguit slechts enkele druk en geen pijn voelen tijdens de biopsie-procedure.</li>
	<li>Het maken van een steek-incisie van 1-2 cm via de huid van de 10-11e intercostale ruimte (Figuur 8). Doorgeven van een Schackelford-Courtney boviene lever biopsie instrument via de huid en het instrument van de biopsie direct in een lichte craniale richting terwijl het voortdurend door het middenrif en in de lever (Figuur 9, Figuur 10). Verkrijgen van een monster van 1 g van de lever en het verwijderen van het instrument (Figuur 11). Sluit de huid met hechtdraad plaatsing (Figuur 12).</li>
	<li>Leg lever monster in een conische buis met genoeg MIM ter dekking van de steekproef, op ijs voor onmiddellijke mitochondriën isolatie</li>
	<li>Selectievakje ingesneden voor eventuele roodheid, zwelling, warmte, of pijn binnen 24 uur na biopsie en injecteren de koe met Ceftiofur Hydrochloride 0,044 mL/kg lichaamsgewicht subcutaan in de nek eenmaal per dag gedurende de komende 3 dagen (Figuur 13). Controleren dagelijks de koemelk temperatuur, inname en fecale scores voor 1 week na biopsie van de lever. Indien een koorts ontwikkelt, blijven antibiotica ter beoordeling van de dierenarts. Opmerking: Als een koe is vertonen tekenen van pijn, zoals schoppen op de insnijding site, recumbancy, roodheid, warmte, of reactie te raken binnen 1 uur na de lever biopsie, een 1 mg/kg lichaamsgewicht IV injectie van flunixin meglumine kan worden gebruikt voor het verlichten van pijn en ontsteking. Een tweede injectie kan worden toegediend indien nodig.</li>
	<li>Het verwijderen van hechtingen 7 dagen na biopsie.</li>
</ol>2. het isoleren van Mitochondria van melkkoe lever
<ol><li>Zo spoedig mogelijk nadat de lever monster is verwijderd uit de koe, wassen het lever monster in MIM (stap 1.3) te verwijderen van de rode bloedcellen en fijn gehakt van het monster met een schaar. De lever moet worden gehakt in een gekoeld bekerglas van voldoende isolatie media om te houden van het weefsel vochtig.</li>
	<li>Plaats de gehakte lever in een 30 mL glazen ampul met een teflon stamper van 0.16 mm klaring geïncubeerd in ijs en met MIM (1:4 m/v).</li>
	<li>Meng lever monster in teflon stamper bij 500 t/min voor een min met 4 slagen/min. Opmerking: De lever homogenaat wordt gehouden in een bekerglas van ijs-verpakt in MIM tijdens het hele proces, en alle volgende centrifugeren stappen zijn voltooid bij 4 ° C</li>
	<li>Centrifugeer homogenaat bij 500 x g gedurende 10 min, negeren pellet, supernatant overbrengen in een gekoeld centrifugebuis en vervolgens de resulterende supernatant bij 10.000 x g gedurende 10 minuten te verkrijgen van de mitochondriale pellet centrifugeren.</li>
	<li>Resuspendeer en wassen van de pellet in 10 mL MIM met vetzuur gratis BSA samen en centrifugeer bij 8100 x g voor 10 min. Discard supernatant.</li>
	<li>Resuspendeer en wassen van de pellet in 10 mL MIM zonder vetzuur gratis BSA samen en centrifugeer bij 8100 x g voor 10 min. Discard supernatant.</li>
	<li>Suspendeer de pellet in 200 µL van isolatie media en plaats op ijs totdat gebruikt voor zuurstofverbruik en proton lek kinetische testen.</li>
	<li>Bepaal de concentratie van de eiwitten van de pellet schorsing (verdunning 1/100) gebruikend Bicinchoninic zuur (BCA) kit per fabrikant protocol met BSA als norm. Wordt beschouwd als alle eiwitten mitochondriaal eiwit.</li>
</ol>3. meting van de mitochondriale zuurstofverbruik (stand 3 en stand 4)
<ol><li>Zuurstof verbruik media (OCM) maken op basis van 120 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes en 1 mM EGTA, pH 7.4 bij 30 ° C met 0,3% BSA ontvet. Ongeveer 3 mL per monster nodig zullen zijn. Ook bereid een oplossing van 8 μg/mL oligomycin in ethanol.</li>
	<li>Incubeer OCM bij 30 ° C. Ademhaling kamer, pomp en zuurstof-elektrode volgens de aanwijzingen van de fabrikant (oxygraph systeem) ingesteld. De software van de oxygraph moet al geïnstalleerd op de computer.</li>
	<li>1 mL van de OCM in de ademhaling kamer plaatsen en roer krachtig. Dit zal helpen verzekeren dat de oplossing verzadigd is met lucht.</li>
	<li>0.35 mg eiwitten mitochondriaal eiwit toevoegen aan de kamer van de ademhaling en temperatuur van 30 ° C.</li>
	<li>Record zuurstofverbruik gedurende ongeveer 5 minuten. De zuurstofconcentratie van oxygraph systeem records zo ademhaling toeneemt, zuurstofconcentratie vermindert. Wanneer wordt het zuurstofverbruik constante (een afnemende rechte lijn), record zuurstofverbruik (helling van lijn = concentratie van zuurstof/tijd). Dit is de basislijn zuurstofverbruik.</li>
	<li>Voeg 1,25 µL van 4 mM rotenon oplossing voor de remming van Complex ik en voeg vervolgens toe 5 µL van 1 M succinaat oplossing tot een uiteindelijke concentratie in de luchtwegen kamer van 5 mM succinaat. Dit is de staat 4 ademhaling.</li>
	<li>Voeg 1 µL van 100 mM ADP oplossing tot een uiteindelijke concentratie in de zaal van de ademhaling van 100 μM. Zuurstofconcentratie zal dalen (verhoogde ademhaling) en vervolgens na ongeveer 5 min verandert in een rechte lijn. Opnemen van zuurstofverbruik (helling van lijn = concentratie van zuurstof/tijd). Dit is de staat 3 ademhaling.</li>
	<li>Optioneel: Aan het einde van de termijn, toevoegen FCCP (0,2 micrometer totaalvolume) om maximale ademhaling. Ademhaling voor ongeveer 5 minuten (ongeveer) opnemen. Wanneer zuurstofverbruik verandert constant, record zuurstofverbruik. Dit is de maximale zuurstofverbruik.</li>
	<li>Berekenen van respiratoire controle Ratio (RCR) met behulp van de vergelijking staat 3 zuurstofverbruik / State 4 zuurstofverbruik.</li>
	<li>Gecombineerd alle oplossingen uit de kamer van de ademhaling. Spoel de kamer meerdere malen met dubbele gedeïoniseerd water.</li>
</ol>4. meten van de Mitochondriale membraanpotentiaal (MMP) en Proton Motive Force (PMF)
<ol><li>Bereid de oplossing van 80 ng/mL nigericin in ethanol. Opmerking: Deze chemische stoffen zijn opgelost in ethanol, en alles in het werk moet worden gemaakt om de hoeveelheid ethanol die wordt toegevoegd aan minder dan 1 μL, omdat ethanol kan het elektronentransport systeem afkoppelen en mitchondrial dysfunctie veroorzaken te beperken.</li>
	<li>Na het grondig spoelen de zaal met dubbele gedeïoniseerd water, plaats 1 mL van de OCM in de zaal van de ademhaling en roer krachtig met een magnetische roer bar. Dit zal helpen verzekeren dat de oplossing verzadigd is met lucht. Methyl-triphenyl-fosfonium (TPMP +) gevoelige elektrode om setup kamer toevoegen. TPMP + elektrode moet worden aangesloten op een pH-meter en waarden van de pH-meter worden gelezen.</li>
	<li>0.35 mg van mitochondriale eiwit toevoegen aan de kamer van de ademhaling.</li>
	<li>Voeg 1,25 µL van 4 mM rotenon oplossing voor de remming van de ademhaling van de complexe I. Record voor 2-5 min (ongeveer). Wanneer zuurstofverbruik verandert constant, record zuurstofverbruik.</li>
	<li>Toevoegen van 0.56 μL van 8 μg/mL oligomycin oplossing voor een eindconcentratie van 2,8 µg oligomycin /0.35 mg van mitochondriale eiwit voor de remming van ADP gebruik. Opnemen (ongeveer) ademhaling voor 2-5 min. Wanneer zuurstofverbruik verandert constant, record zuurstofverbruik.</li>
	<li>Voeg 0.112 μL 80 ng/mL nigericin oplossing af te schaffen het pH verloop over de mitochondriale binnenste membraan. Opnemen (ongeveer) ademhaling voor 2-5 min. Wanneer zuurstofverbruik verandert constant, record zuurstofverbruik. Opmerking: Rotenon en oligomycin worden gebruikt voor het blokkeren van elektronentransport ketting op Complex ik en ATP-synthase, respectievelijk. Nigericin is toegevoegd aan de transmembrane H + verloop omzetten in een K + verloop dat kan worden gemeten met een electrode.</li>
	<li>Voorbereiden op een standaard curve TPMP + door 5 µL van 10 mM TPMP + oplossing toe te voegen aan de mitochondriale incubatie. Herhaal deze stap vier keer tot een totale concentratie van 2,5 μM TPMP + is toegevoegd.</li>
	<li>Starten ademhaling door 5 μL van 1M succinaat toe te voegen aan de kamer.</li>
	<li>Record ademhaling totdat u een stabiele spoor hebben bereikt, en Titreer vervolgens het systeem door toevoeging van malonaat. Toevoegingen van malonaat moet 0,5 µL 1 µL, 1.5 µL, 3.0 µL, 6.0 µL, 9.0 µL, dan 12,5 µL van 0.1 mM malonaat oplossing om opeenvolgende toevoegingen van malonaat concentraties in de zaal van de incubatie van 0,1 0,2 0,3, 0,6, 1.2, 1.8, en 2,5 mM.</li>
	<li>Gegevens verzamelen van de twee elektroden (zuurstof en TPMP+). De software van de overname van gegevens uit het oxygraph-systeem kan worden gebruikt voor het verzamelen van gelijktijdige metingen van mitochondriale zuurstofverbruik en Mitochondriale membraanpotentiaal en observeren van veranderingen in het zuurstofverbruik in real-time. Figuur 14 toont hoe de oxygraph systeem registreert zuurstofverbruik naarmate het experiment vordert.</li>
	<li>MMP in mV op basis van de Nernst vergelijking worden berekend: MMP = 61,5 log ([TPMP +] toegevoegd – extern [TPMP +]) x TPMP+ bindende correctie / (0,001 x mg van eiwit/mL x [TPMP +]) Een TPMP + bindende correctie van 0.4 µL/mg van mitochondriale eiwit-1 wordt gebruikt. Voorbeeld berekening is gebaseerd op concentraties in protocol: MMP 61,5 x log (5 µM-2 µM) x 0,4 = / (0,001 x 0.35 mg mitochondriale eiwit/mL x 2 µM) MMP 198.9 = mV</li>
	<li>Schatting PMF uitzetten van een grafiek van MMP vs. zuurstofverbruik (Figuur 15). PMF is gerapporteerd als zuurstofverbruik op een membraanpotentiaal van 165 mV. Opmerking: Titrating van het elektronentransport ketting met malonaat (0.1 tot en met 2.5 mM) toont de kinetische reactie van proton lek aan MMP. MMP samenzwering tegen zuurstofverbruik bepaalt vervolgens, proton lek kinetiek. PMF is bepaald op basis van zuurstofverbruik op een gemeenschappelijke membraanpotentiaal (165 mV).</li>
	<li>Toevoegen aan het einde van de laatste run van het monster, FCCP (0,2 micrometer totaalvolume) om maximale ademhaling veroorzaken en release TPMP + voor correctie van de basislijn.</li>
	<li>Gecombineerd alle oplossingen uit de kamer van de ademhaling. Spoel de kamer meerdere malen met dubbele gedeïoniseerd water. Aan het eind van de dag, moet de kamer ook worden gespoeld een paar keer met ethanol.</li>
</ol>

<ol><li>Brand, M. D., Divakaruni, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+and+physiology+of+mitochondrial+proton+leak%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">The regulation and physiology of mitochondrial proton leak.</a> Physiology. 26, 192-205 (2011).</li>
<li>Stephenson, E. J., Hawley, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+function+in+metabolic+health%3A+A+genetic+and+environmental+tug+of+war%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial function in metabolic health: A genetic and environmental tug of war.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840, 1285-1294 (2014).</li>
<li>Bartlett, K., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+B+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial B oxidation.</a> European Journal of Biochemistry. 271, 462-469 (2004).</li>
<li>Acetoze, G., Kurzbard, R., Klasing, K. C., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Oxygen Consumption, Respiratory Control Ratio (RCR) and Mitochondrial Proton Leak of broilers with and without growth enhancing levels of minerals supplementation challenged with Eimeria maxima (Ei). Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 101, e210-e215 (2016).</li>
<li>Wallace, D. C., Fan, W. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1567724909001536">Energetics, epigenetics, mitochondrial genetics.</a> Mitochondrion. 10, 12-31 (2010).</li>
<li>Paradies, G., Petrosillo, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress%2C+mitochondrial+bioenergetics+and+cardiolipin+in+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radicals+in+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress, mitochondrial bioenergetics and cardiolipin in aging.</a> Free Radicals in Biology and Medicine. 48, 1286-1295 (2010).</li>
<li>Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+mitochondrial+oxygen+consumption+and+efficiency+of+milk+production+in+lactating+Holstein+cows+supplemented+with+Copper%2C+Manganese+and+Zinc%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Physiology+Animal+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Liver mitochondrial oxygen consumption and efficiency of milk production in lactating Holstein cows supplemented with Copper, Manganese and Zinc.</a> Journal of Animal Physiology Animal Nutrition. 102, e787-e797 (2017).</li>
<li>Brown, D. R., DeNise, S. K., McDaniel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+metabolism+and+performance+of+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory metabolism and performance of cattle.</a> Journal of Animal Science. 66, 1347-1354 (1988).</li>
<li>Golden, M. S., Keisler, J. W., H, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+mitochondrial+function+and+residual+feed+intake+in+Angus+steers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">The relationship between mitochondrial function and residual feed intake in Angus steers.</a> Journal of Animal Science. 84, 861-865 (2006).</li>
<li>Lancaster, P. A., Carstens, G. E., Michal, J. J., Brennan, K. M., Johnson, K. A., Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+between+residual+feed+intake+and+hepatic+mitochondrial+function+in+growing+beef+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Relationships between residual feed intake and hepatic mitochondrial function in growing beef cattle.</a> Journal of Animal Science. 92, 3134-3141 (2014).</li>
<li>Acetoze, G., Weber, K. L., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. <a target="_blank" href="https://www.hindawi.com/archive/2015/194014/abs/">Relationship between liver mitochondrial respiration and proton leak kinetics in low and high RFI steers from two lineages of RFI Angus bulls.</a> ISRN Vet Sci. 2015 (194014), (2015).</li>
<li>Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. Protection against oxidants in biological systems: The superoxide theory of oxygen toxicity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHalliwell%2C+B+%22Free+Radicals+in+Biology+and+Medicine%22">Free Radicals in Biology and Medicine</a>. , Oxford University Press. Oxford. 186-187 (1989).</li>
<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Nutrient+Requirements+of+Dairy+Cattle%22">Nutrient Requirements of Dairy Cattle</a>. , 7th revised edition, National Academy Press. Washington, DC. (2001).</li>
<li>Ramsey, J. J., Harper, M. E., Weindruch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+of+energy+intake%2C+energy+expenditure%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Restriction of energy intake, energy expenditure, and aging.</a> Free Radical Biology and Medicine. 29, 946-968 (2000).</li>
<li>Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+control+of+immunity%3A+beyond+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial control of immunity: beyond ATP.</a> Nature. 17, 608-620 (2017).</li>
<li>Kirby, D. M., Thorburn, D. R., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+assays+of+respiratory+chain+complex+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Biochemical assays of respiratory chain complex activity.</a> Methods in Cell Biology. 80, 93-119 (2007).</li>
<li>Alex, A. P., Collier, J. L., Hadsell, D. L., Collier, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milk+yield+differences+between+1x+and+4x+milking+are+associated+with+changes+in+mammary+mitochondrial+number+and+milk+protein+gene+expression%2C+but+not+mammary+cell+apoptosis+or+SOCS+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Milk yield differences between 1x and 4x milking are associated with changes in mammary mitochondrial number and milk protein gene expression, but not mammary cell apoptosis or SOCS gene expression.</a> Journal of Dairy Science. 98, 4439-4448 (2015).</li>
<li>Lossa, S., Lionetti, L., Mollica, M. P., Crescenzo, R., Botta, M., Barletta, A., Liverini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+high-fat+feeding+on+metabolic+efficiency+and+mitochondrial+oxidative+capacity+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Effect of high-fat feeding on metabolic efficiency and mitochondrial oxidative capacity in adult rats.</a> British Journal of Nutrition. 90, 953-960 (2003).</li>
<li>Boily, G., Seifert, E. L., Bevilacqua, L., He, X. H., Sabourin, G., Estey, C., Moffat, C., Crawford, S., Saliba, S., Jardine, K., Xuan, J., Evans, M., Harper, M. E., McBurney, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SirT1+regulates+energy+metabolism+and+response+to+caloric+restriction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">SirT1 regulates energy metabolism and response to caloric restriction in mice.</a> PloS One. 3 (3), e1759(2008).</li>
<li>Chen, Y., Hagopian, K., Bibus, D., Villaba, J. M., Lopez-Lluch, G., Navas, P., Kim, K., McDonald, R. B., Ramsey, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+dietary+lipid+composition+on+liver+mitochondria+from+mice+following+1+month+of+calorie+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">The influence of dietary lipid composition on liver mitochondria from mice following 1 month of calorie restriction.</a> Bioscience Reports. 33, 83-95 (2013).</li>
<li>Chacko, B. K., Kramer, P. A., Ravi, S., Benavides, G. A., Mitchell, T., Dranka, B. P., Ferrick, D., Singal, A. K., Ballinger, S. W., Bailey, S. M., Hardy, R. W., Zhang, J., Zhi, D., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bioenergetic+health+index%3A+a+new+concept+in+mitochondrial+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Science%22%5BJournal%5D)">The bioenergetic health index: a new concept in mitochondrial translational research.</a> Clinical Science. 127, 367-373 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het meest kritieke punt in het protocol is het verkrijgen van een steekproef representatief leverweefsel en beginnen het isolement van de mitochondriën zo spoedig mogelijk na biopsie. Variatie in ademhaling metingen is laag (tabel 1) als gevolg van een korte transporttijd van koe naar laboratorium. Verklein de transporttijd en een klein laboratorium opgericht in het kantoor van de melkerij, en lever monsters naar het laboratorium van office werden verdreven, zoals elk werd verzameld zodat mitochondriën g...

Mitochondriën zijn zeer gevoelig voor stress en hun cellulaire omgeving kan bijdragen tot een breed scala aan metabole ziekten. Zuurstofverbruik en proton lek in mitochondriën zijn indicatoren voor de gezondheid van de mitochondriën. De methoden die worden beschreven in dit papier schatting mitochondriale energie-efficiëntie met behulp van RCR gebaseerd op zuurstofverbruik met en zonder proton lek. Deze resultaten kunnen goed voor 30% van de energie verloren in nutriënten gebruik1. Wijzigingen in zuurstof verbruik en proton lek herkent mitochondriale dysfunctie die bijdraagt tot metabole ziekte en resulteert in verminderde energie-efficiëntie. Deze methoden kunnen ook worden gebruikt om te onderzoeken van het effect van verschillende behandelingen op mitochondriale ademhaling. Het algemene doel van het meten van mitochondriale zuurstofverbruik en proton lek kinetiek is mitochondriale functie en energetische doeltreffendheid te beoordelen.
Hepatische mitochondriale dysfunctie is gekoppeld aan verschillende ziekten in melkvee. Het vermogen van cellulaire metabolisme om te schakelen tussen koolhydraten en lipide brandstoffen wanneer zij worden geconfronteerd met een energie tekort in begin lactatie wordt beïnvloed door het aantal en de functie van de mitochondriën in de cel2. Defecten in het vermogen van de mitochondriën aan te passen aan een grotere vraag naar energie en hogere β-oxidatie kunnen leiden tot ophoping van intracellulaire lipide geassocieerd met insulineresistentie en kunnen leiden tot de vorming van vette lever in begin lactatie melkkoeien. Mitochondriën, kunnen als de site van keton lichaam productie en gebruik, een belangrijke rol in ketose in melkkoeien3. Een gebrek van de mitochondriën of mitochondriale dysfunctie zal gevolgen hebben voor de beschikbaarheid van de brandstof naar de periferie en worden weerspiegeld in veranderingen in zuurstofverbruik of RCR.
Mitochondriale zuurstof verbruik verandert in reactie op ontsteking. Zeven-dag-oude vleeskuikens werden willekeurig toegewezen aan een groep geïnfecteerd met Eimeria maxima en een controle groep4. Vleeskuikens die coccidiosis uitdaging niet ondergaan had lager zuurstofverbruik als gevolg van proton lek en hogere RCR die aangeeft dat de lever-mitochondria op een immuun uitdaging door toenemende proton lek reageren. Terwijl het proton lek en reactieve zuurstof soorten productie werd ooit beschouwd als een teken van mitochondriale membraan dysfunctie en ten koste van energetische efficiëntie, nu het is bekend dat het belangrijk is voor de invoer van proteïnen en calcium in mitochondriën5 , en voor de opwekking van warmte1.
Elektron lek uit de luchtwegen keten maakt mitochondriën vatbaar voor reactieve zuurstof soorten productie en oxidatieve schade aan mitochondriale membraaneiwitten, lipiden en mitochondriaal DNA. Als mitochondriën leeftijd, schade kan accumuleren vooral aan mtDNA, waardoor verdere dysfunctie in mitochondriale metabolisme6 en grotere gevoeligheid van de koe voor ziekte. In de praktijk worden veel dieren dieren hoge niveaus van supplementen zoals Cu, Zn en Mn te stimuleren anti-oxidant functie gevoed. Echter voeding van hoge niveaus van Cu, Zn en Mn daalde de melkproductie en toegenomen zuurstofverbruik als gevolg van proton lek (staat 4 ademhaling)7.
Eerder onderzoek over de rol van mitochondriale functie in energie-efficiëntie bij runderen heeft gericht op veranderingen in de mitochondriale zuurstofverbruik en proton lek. Weinig studies zijn gepubliceerd in melkvee en de meeste papieren vergelijk productie-efficiëntie in de vorm van residuele voeropname (RFI) aan mitochondriale functie in runderen. Variabiliteit in mitochondriale ademhaling tarieven werden onderzocht door het meten van toestand 3, staat 4 en RCR in levers van zowel zogende Holstein koeien en rundvlees zogende koeien (Angus, Brangus en Hereford)8. De onderzoekers did niet vondst ieder correlatie in mitochondriale ademhaling met groei of eigenschappen voor runderen melken maar een correlatie tussen mitochondriale ademhaling en melken eigenschappen voor Holsteins verslag. In twee studies, bedroeg RFI vergeleken in rundvlees vee naar mitochondriale ademhaling tarieven (staat 3, staat 4 en RCR) in spier mitochondriën9,10. Mitochondriale ademhaling tarieven gewijzigd in reactie op DMI en lage tarieven werden geassocieerd met minder efficiënt rundvlees ossen. In een andere studie, RFI van ossen uit de hoge of lage RFI stieren werden vergeleken met de tarieven van mitochondrial ademhaling en proton lek kinetiek tussen de twee groepen van nakomelingen11. Verschillen waren te wijten aan winst bevestigen de conclusie dat krijgen doet niet effect mitochondriale ademhaling in runderen.
In deze paper, een experiment dat onderzoekt lever RCR in reactie op het vervoederen van 3 antioxidant mineralen aan zogende melkvee het gebruik van methoden illustreert voor het meten van zuurstofverbruik tijdens staat 4 en staat 3 ademhaling en PMF.

```html
<table><tbody><tr><td>Leverbiopsie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uitrusting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schackelford-Courtney boviene leverbiopsie instrument</td><td>Sontec Instruments Englewood CO</td><td>1103-904</td><td></td></tr><tr><td>Sutuurdraad</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-037-516</td><td></td></tr><tr><td>Sutuurnaalden</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Meegeleverd met Sutuurdraad</td></tr><tr><td>Schelpels</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S2896 / S2646</td><td># voor handvat en bladen</td></tr><tr><td>Operatiedoeken</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-129-6667</td><td></td></tr><tr><td>Falconbuizen 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>Z168750</td><td></td></tr><tr><td>Spuiten 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-314387</td><td></td></tr><tr><td>Injectienaalden (22, 2 1/2)</td><td>VWR</td><td>MJ8881-200342</td><td></td></tr><tr><td>Koeienhalsband</td><td>Tractor Supply Co.</td><td>101966599</td><td></td></tr><tr><td>Wattenstaafjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-102</td><td></td></tr><tr><td>Wattenschijfjes (4x4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-246069</td><td></td></tr><tr><td>Medische schaar</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>Z265969</td><td></td></tr><tr><td>Chemicaliën</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coccidiose Vaccin 0,75 fles/koe</td><td></td><td></td><td>Verstrekt door dierenarts</td></tr><tr><td>Clostridia Vaccin</td><td></td><td></td><td>Verstrekt door dierenarts</td></tr><tr><td>Leverbiopsie antibiotica excenel 2 cc/100 lbs gedurende 3 dagen</td><td></td><td></td><td>Verstrekt door dierenarts</td></tr><tr><td>Providone Scrub</td><td>Aspen Veteterinary Resources</td><td>21260221</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 70%</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>793213</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV bij 0,010-0,015 mg/kg lichaamsgewicht</td><td></td><td></td><td>Verstrekt door dierenarts</td></tr><tr><td>2% lidocaine HCl (10-15 mL)</td><td></td><td></td><td>Verstrekt door dierenarts</td></tr><tr><td>1 mg/kg IV injectie van flunixin meglumine</td><td></td><td></td><td>Verstrekt door dierenarts</td></tr><tr><td>Isolering van Mitochondria (lever)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uitrusting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wheaton buisje 30 mL met een Teflon stamper van 0,16 mm ruimte</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-911-527</td><td></td></tr><tr><td>Homogenisator Motor</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-04369-10</td><td></td></tr><tr><td>Homogenisator Sonde</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-04468-22</td><td></td></tr><tr><td>Automatische Pipet (10 mL)</td><td>Cole Parmer</td><td>SK-21600-74</td><td></td></tr><tr><td>Beker (500 mL) met ijs</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB100600</td><td></td></tr><tr><td>Gekoelde microfuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-002-441EW3</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge buisjes (1,5 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>Chemicaliën</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bicinchoninic zuur (BCA) eiwit assay kit (microplaten voor plate reader)</td><td>abcam</td><td>ab102536</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S7903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>EDS-1KG</td><td></td></tr><tr><td>BSA (vetzuurvrij)</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>M4125-1KG</td><td></td></tr><tr><td>De-ioniseerd water</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>38796</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>Gebruikt om mitochondria isolatie media te maken: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, en 0,1% (w/v) vetzuurvrije BSA,&nbsp; pH 7,4 bij 4 &deg;C, zal 2 dagen meegaan in de koelkast</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mitochondriale Zuurstof Consumptie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uitrusting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oxygraaf Opstelling + Clark type zuurstof elektrode</td><td>Hansatech (PP Systems)</td><td>OXY1</td><td></td></tr><tr><td>Thermogeregelde Waterpomp</td><td>ADInstruments</td><td>MLE2001</td><td></td></tr><tr><td>Clark type Zuurstof elektrode</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Autopipet (1 mL)</td><td>Cole Parmer</td><td>SK-21600-70</td><td>Meegeleverd met Oxy1</td></tr><tr><td>Kleine magnetische roerbar</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-513-95</td><td></td></tr><tr><td>Micropipet (10 &mu;L)</td><td>Cole Parmer</td><td>SK-21600-60</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemicaliën</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P9333-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P5655-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>M1028-100ML</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>E3889-100G</td><td></td></tr><tr><td>Gebruikt om mitochondriale zuurstof consumptie media te maken: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes en 1 mM EGTA,&nbsp; pH 7,4 bij 30 &deg;C met 0,3% ontvette BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotenone (4 mM oplossing)</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>R8875-5G</td><td></td></tr><tr><td>Succinate (1 M oplossing)</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S3674-250G</td><td></td></tr><tr><td>ADP (100 mM oplossing)</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A5285-1G</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycin (oplossing van 8 &mu;g/mL in ethanol)</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>Mitochondriale Membraan Potent

meten lever mitochondriale zuurstofverbruik en proton lek kinetiek te schatten van mitochondriale ademhaling in holstein melkvee

Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

Zuurstofverbruik proton motive force (PMF) en proton lek zijn metingen van de mitochondriale ademhaling, of hoe goed de mitochondriën zijn kundig voor bekeerling NADH en FADH in ATP. Aangezien mitochondriën ook de primaire site voor zuurstof gebruik en nutriënten oxidatie in kooldioxide en water zijn, hoe efficiënt ze zuurstof gebruiken en produceren van ATP rechtstreeks betrekking heeft op de efficiëntie van nutriënten metabolisme, voedingsstoffen eisen van het dier, en gezondheid van het dier. Het doel van deze methode is te onderzoeken van mitochondriale ademhaling, die kan worden gebruikt voor het bestuderen van de gevolgen van verschillende drugs, diëten en milieueffecten op mitochondriale metabolisme. Resultaten omvatten zuurstofverbruik gemeten als proton afhankelijke ademhaling (staat 3) en proton lek afhankelijke ademhaling (staat 4). De verhouding tussen staat 3 / staat 4 ademhaling wordt gedefinieerd als respiratoire controle verhouding (RCR) en mitochondriale energetische efficiëntie kan vertegenwoordigen. Mitochondriale proton lek is een proces waarmee dissipatie van Mitochondriale membraanpotentiaal (MMP) door ontkoppelingseiwit oxidatieve fosforylatie van ADP minderen van de efficiëntie van de ATP-synthese. Zuurstof en TRMP + gevoelige elektroden met mitochondriale substraten en elektronentransport keten remmers worden gebruikt als eenheid staat 3 en staat 4 ademhaling, mitochondriale membraan PMF (of het potentieel voor de productie van ATP) en proton lek. Beperkingen van deze methode zijn dat leverweefsel zo vers mogelijk moet en alle biopsies en tests moeten worden uitgevoerd in minder dan 10 h. Dit beperkt het aantal monsters dat kan worden verzameld en verwerkt door één persoon in een dag om ongeveer 5. Echter, slechts 1 g van leverweefsel nodig is, dus in grote dieren, zoals melkvee, de hoeveelheid monster nodig klein ten opzichte van de grootte van de lever is en er weinig hersteltijd nodig is.

Positieve resultaten tonen de RCR en proton lek kinetiek worden weergegeven in tabel 1 en Figuur 15, respectievelijk. In deze studie7, RCR en eiwit lek kinetiek werden gemeten in Holstein melkkoeien op 70 dagen pas in melk nadat koeien had 1 van 5 verschillende niveaus van Cu, Zn en Mn gevoederd gedurende 28 dagen. Staat 4, maximale proton lek-afhankelijke ademhaling, had de neiging te worden beïnvloed door minerale in...

We delen hier, methoden voor het meten van mitochondriale zuurstofverbruik, een bepalende concept van nutritionele energetics en proton lek, de primaire oorzaak van inefficiëntie in mitochondriale generatie van ATP. Deze resultaten kunnen goed voor 30% van de energie verloren in nutriënten gebruik om te helpen evalueren van mitochondriale functie.

Meten lever mitochondriale zuurstofverbruik en Proton lek kinetiek te schatten van mitochondriale ademhaling in Holstein melkvee

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van energetica, zoals mitochondriale gezondheid, energetische efficiëntie en energieverbruik. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het zuurstofverbruik van geïsoleerde mitochondriën direct wordt gemeten. Resultaten hoeven niet te worden gecorrigeerd voor andere intracellulaire metabolische processen.We hebben eerst besloten om deze methode in melkvee voort te zetten toen we wilden onderzoeken hoe mitochondriale efficiëntie de efficiëntie van het voer beïnvloedt. Video demonstratie van deze methode is van cruciaal belang als de stappen in mitochondriale isolatie zijn moeilijk te leren, omdat ze nodig hebben om consistent en nauwkeurig te zijn. Zo snel mogelijk nadat het levermonster uit de koe is verwijderd, was het monster in mitochondriën isolatiemedia om de rode bloedcellen te verwijderen.Met behulp van een schaar fijn gehakt het weefsel in een gekoeld beker dat genoeg isolatie media bevat om het weefsel vochtig te houden. Breng de gehakte lever in een 30-milliliter glazen flacon met mitochondriën isolatie media. Voeg een Teflon stamper die een klaring van 0,16 millimeter heeft en die is geïncubeerd in ijs en homogeniseren het levermonster op 500 RPM gedurende een minuut met vier slagen per minuut.Breng hierna het homogenaat over op een buis met mitochondriënisolementmedia en plaats dit in een beterde beker met ijs. Centrifuge homogenaat op 500 keer G en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Gooi de pellet weg en breng de supernatant over op een gekoelde centrifugebuis.Centrifuge de resulterende supernatant op 10,000 keer G en vier graden Celsius gedurende 10 minuten om de mitochondriale pellet te verkrijgen. Resuspend en was de pellet in 10 milliliter mitochondriën isolatie media met vetzuurvrije BSA. Dan centrifugeren op 8, 100 keer G en vier graden Celsius gedurende 10 minuten.Gooi de supernatant weg en verleg de pellet in 200 microliter isolatiemedia. Plaats dit op ijs tot klaar voor gebruik voor het zuurstofverbruik en protonlek kinetische testen. Bepaal de eiwitconcentratie van de pelletsuspensie met behulp van een bicinchoninic zuurkit per instructies van de fabrikant met BSA als standaard.Maak eerst zuurstofconsumptiemedia zoals beschreven in het tekstprotocol. Broed het zuurstofverbruik media op 30 graden Celsius. Stel vervolgens de ademhalingskamer, pomp- en zuurstofelektrode voor het oxygraafsysteem in volgens de instructies van de fabrikant.Plaats vervolgens een milliliter zuurstofconsumptiemedia in de ademhalingskamer. Voeg vervolgens 0,35 milligram mitochondriaal eiwit toe aan de kamer. Roer krachtig om ervoor te zorgen dat de oplossing verzadigd raakt met lucht en een temperatuur van 30 graden Celsius te behouden.Nota van het zuurstofverbruik gedurende ongeveer vijf minuten. Wanneer het zuurstofverbruik constant wordt, wordt dit weergegeven door een dalende rechte lijn, registreert u dit als het zuurstofverbruik bij de basislijn. Voeg 1,25 microliter van een vier-millimolar rotenone oplossing om complexe te remmen, en voeg vervolgens vijf microliters van een molaire beknopte oplossing om een definitieve concentratie van vijf millimolar succinate in de ademhalingskamer te bereiken.Dit is het zuurstofverbruik van staat IV. Voeg hierna een microliter van een ADP-oplossing van 100 millimolar toe om een uiteindelijke concentratie van 100 micromolar in de ademhalingskamer te bereiken. Het zuurstofverbruik neemt ongeveer vijf minuten af en wordt dan een rechte lijn.Record dit zuurstofverbruik als de toestand III ademhaling. Bereken de ademcontroleverhouding zoals beschreven in het tekstprotocol. Dan aspirate alle oplossingen uit de ademhalingskamer.Spoel de kamer meerdere malen af met dubbel gedeïmiseerd water. Bereid eerst een oplossing voor van 80 nanogram per milliliter nigericine in ethanol die de hoeveelheid ethanol beperkt die wordt toegevoegd tot minder dan één microliter. Bereid ook een oplossing voor van acht microgram per milliliter oligomycine in ethanol.Na het grondig spoelen van de kamer met dubbel gedeïmiseerd water, plaats een milliliter van de zuurstofconsumptie media in de ademhalingskamer en roer krachtig met een magnetische roerstaaf. Voeg 0,35 milligram mitochondriaal eiwit toe aan de ademhalingskamer. Voeg een methyl triphenylphosphonium-gevoelige elektrode toe aan de kameropstelling om ervoor te zorgen dat het andere uiteinde goed is aangesloten op een pH-meter.Voeg 1,25 microliter van een vier-millimolar rotenone oplossing toe om Complex I.Record de ademhaling gedurende twee tot vijf minuten te remmen. Nota van de waarde van het zuurstofverbruik wanneer deze constant wordt. Voeg vervolgens 0,56 microliter van een oligomycine-oplossing toe om het ADP-gebruik te remmen.Neem de ademhaling op voor ongeveer twee tot vijf minuten. Nota van de waarde van het zuurstofverbruik wanneer deze constant wordt. Voeg vervolgens 0,112 microliter van een 80 nanogram per milliliter nigericin oplossing toe om de pH-gradiënt over het mitochondriale binnenmembraan af te schaffen.Neem de ademhaling gedurende twee tot vijf minuten op en let op de waarde van het zuurstofverbruik wanneer deze constant wordt. Voeg vijf microliter van 10 millimolar methyl triphenylphosphonium oplossing aan de mitochondriale incubatie om te beginnen met de voorbereiding van een standaard curve. Herhaal deze toevoeging vier keer extra tot een totale concentratie van 2,5.micromolar is toegevoegd. Voeg hierna vijf microliters van één molaire beknopte oplossing toe aan de kamer om ademhaling te initiëren. Nota van de ademhaling totdat een stabiel spoor is bereikt.Voeg vervolgens malonaat toe om het systeem te titreren zoals beschreven in het tekstprotocol. In deze studie worden RCR en protonlekkinetiek gemeten in de melk van Holsteinse melkkoeien 70 dagen nadat de melkkoeien gedurende 28 dagen met verschillende niveaus van koper, zink en mangaan waren gevoederd. Staat IV ademhaling wordt gezien als de hoogste in koeien gezien lage niveaus van mangaan, maar is het laagst in de controle koeien, wat aangeeft dat mangaan een belangrijke rol speelt bij het minimaliseren van proton lek-afhankelijke ademhaling.Analyse van de leverprotonlekafhankelijke ademhaling toont aan dat deze ademhaling het grootst is bij koeien die met een laag mangaan worden behandeld en de laagste in controlekoeien. Deze resultaten bevestigen dat de lage mangaangroep de grootste status IV ademhaling heeft, terwijl de controlegroep het laagste heeft. Terwijl de voerefficiëntie hoger is in Angus-ossen die geboren zijn uit lage RFI-stieren dan hoge RFI-stieren, werd dit niet weerspiegeld in de mitochondriale RCR of de protonlekkinetiek.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om alle flesjes en bekers op ijs te houden tijdens het verwerken van de mitochondriën. Na de ontwikkeling van deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van zuivelvoeding om de rol van mitochondriën efficiëntie in voerefficiëntie en mitochondriale functie in de lever te verkennen. Vergeet niet dat het werken met rotenone gevaarlijk kan zijn, en voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van handschoenen, oogbescherming en een goede BESCHERMINGsmiddelen moeten altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

measuring-liver-mitochondrial-oxygen-consumption-proton-leak-kinetics

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Source: Elettra Leo1, Luiza H.D. Cardoso1, Sabine Schmitt1, Erich Gnaiger11Oroboros InstrumentsThis video explains how oxygen flux is used to assess mitochondrial respiration in living and permeabilized mammalian cells. It demonstrates the sequential use of digitonin, metabolic substrates, ADP, an uncoupler, and an inhibitor to characterize different respiratory states. The resulting oxygen flux profile reveals mitochondrial function and energy-coupling efficiency under defined conditions.

Oxygen Flux Measurements to Evaluate Mitochondrial Respiration in Living and Permeabilized Cells

De gepresenteerde methoden bieden stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van een verzameling respirometrische assays op basis van microplates met behulp van geïsoleerde mitochondriën uit minimale hoeveelheden muisskeletspier. Deze assays kunnen mechanistische veranderingen/aanpassingen in het mitochondriale zuurstofverbruik meten in een veelgebruikt diermodel.

Met behulp Isolated Mitochondriën van geringe hoeveelheden van de muis skeletspieren voor High throughput Microplate Respiratory Metingen

Hoge-resolutie respirometrie wordt gebruikt om mitochondriale zuurstofconsumptie bepalen. Dit is een eenvoudige techniek om mitochondriale ademhalingsketen complexen (I-IV) ademhalingssnelheid, maximale mitochondriale elektronentransport systeemcapaciteit en buitenste mitochondriale membraan integriteit te bepalen.

High-resolution respirometrietest aan mitochondriale functie beoordelen in gepermeabiliseerde en intacte cellen

In dit document wordt een methode voor het meten van zuurstofverbruik met behulp van hoge-resolutie respirometrie in permeabel thoraxes van Drosophila beschreven. Deze techniek vereist een minimale hoeveelheid weefsel in vergelijking met de klassieke mitochondriale isolatie-techniek en de verkregen resultaten meer fysiologisch relevant zijn.

Meting van mitochondriale zuurstofverbruik in permeabel vezels van Drosophila met minimale hoeveelheden weefsel

We ontwierpen en bouwden een mobiel laboratorium om de ademhalingsfrequentie te meten in geïsoleerde mitochondriën van wilde dieren die op veldlocaties zijn gevangen. Hier beschrijven we het ontwerp en de inrichting van een mobiel mitochondriaal laboratorium en de bijbehorende laboratoriumprotocollen.

Ontwikkeling van een mobiel laboratorium voor mitochondriale fysiologie voor het meten van mitochondriale energetica in het veld

Hoge resolutie respirometrie gekoppeld aan fluorescentiesensoren bepaalt mitochondriaal zuurstofverbruik en reactieve zuurstofsoorten (ROS) generatie. Het huidige protocol beschrijft een techniek om mitochondriale ademhalingssnelheden en ROS-productie in de gepermeabiliseerde heupzenuw te beoordelen.

Beoordeling van mitochondriale functie in heupzenuw door middel van hoge resolutie respirometrie

We beschrijven stapsgewijze protocollen die de mitochondriale ademhaling van muis en menselijke neutrofielen en HL60-cellen meten met behulp van de metabole extracellulaire fluxanalysator.

Real-time meting van het mitochondriale bio-energetische profiel van neutrofielen

Paarden hebben een uitzonderlijke aërobe inspanningscapaciteit, waardoor paardenskeletspieren een belangrijk weefsel zijn voor zowel de studie van paardeninspanningsfysiologie als de mitochondriale fysiologie van zoogdieren. Dit artikel beschrijft technieken voor de uitgebreide beoordeling van de mitochondriale functie in de skeletspieren van paarden.

Hoge resolutie fluorrespirometrie van equine skeletspieren

Hier presenteren we een compilatie van testen om de mitochondriale functie in zoogdiercellen direct te meten, onafhankelijk van hun vermogen om moleculaire zuurstof te consumeren.

Zuurstofonafhankelijke assays om de mitochondriale functie bij zoogdieren te meten

Hier beschrijven we een uitgebreide methode voor het meten van mitochondriale oxidatieve fosforylering in verse gepermeabiliseerde skeletspiervezels van menselijke of muizenspieren. Deze methode maakt de real-time kwantificering van de mitochondriale ademhaling en de beoordeling van brandstofvoorkeur en metabole flexibiliteit mogelijk, met behoud van bestaande mitochondriale netwerken en membraanintegriteit.

Meting van mitochondriale ademhaling in skeletspiervezels van mens en muis door middel van respirometrie met hoge resolutie

Leer mitochondriale zuurstofconsumptie meten in lever van Holstein melkvee om proton lek en ademhalingsefficiëntie te evalueren. Deze methode verbetert inzicht in mitochondriale functie en voederefficiëntie.

Meten lever mitochondriale zuurstofverbruik en Proton lek kinetiek te schatten van mitochondriale ademhaling in Holstein melkvee (Video) | JoVE Journal

Meten lever mitochondriale zuurstofverbruik en Proton lek kinetiek te schatten van mitochondriale ademhaling in Holstein melkvee

Meer video's verkennen