Geautomatiseerde Multiplex immunofluorescentie paneel voor Immuno-oncologie Studies over formaline-vaste Carcinoma weefsel Specimens

Dit protocol is belangrijk omdat de optimalisatie en overdracht van multiplex immunofluorescentie protocollen complex en uitdagend is. Voor veel laboratoria is het vasthouden van een geoptimaliseerd protocol van onschatbare waarde. Multispectrale immunofluorescentie stelt ons in staat om zowel de locatie als de identiteit van meerdere celtypen in en rond de tumor te beoordelen.

Dit is een krachtige combinatie van informatie in immuunoncologiestudies. Het meest dwingende gebruik voor multiplex immunofluorescentie is immuunoncologie. Maar de mogelijkheid om meerdere immuunceltypes in setu te onderzoeken kan worden gebruikt in alle auto-immuun- en ontstekingstherapieën.

Het kennen van de locatie en het fenotype van immunocellen in en rond vaste cellen is zowel prognostische als voorspelbare reacties op tumorspecifieke immunotherapie. De optimalisatie en validatie van het protocol zijn belangrijke stappen die niet moeten worden overhaast. Nieuwe ontwikkelaars moeten vertrouwd raken met de nieuwe soorten artefacten in verband met multi-spectrale beeldvorming.

Om het basis multi-plex protocol te lokaliseren, vooraf laden op de geautomatiseerde vlek. Filter voor alles in plaats van voorkeur'op het protocolscherm. Voordat u wijzigingen aanbrengt, slaat u het oorspronkelijke protocol op en klikt u op het tabblad Protocollen en klikt u met de rechtermuisknop op Opal 6 Multiplex om kopiëren te selecteren.

Wijzig de naam in 7 Multiplex Protocol 1'in het nieuwe venster en selecteer het tabblad dat is gekoppeld aan het juiste apparaat. Overeenkomen met het protocol in aanvullende tabel S1'en klik reagens toevoegen om een tien minuten paroxidies remming stap toe te voegen, het selecteren van de peroxidase remmer als het reagens. Bevestig dat de blokkerende stappen gebruik maken van een eiwitkinaseremmer blokkeren buffer, dat elke primaire anti-lichaam verwijst naar de juiste reagens, dat de secundaire anti-lichaam stappen gebruik maken van een mierikswortel peroxidase polymeer en dat de spectrale dapi voorzien van de multi-spectrale automatisering kit wordt gebruikt.

Zorg ervoor dat het protocol de peroxidaseremmer bevat, gevolgd door zes sequentiële kleuringsruns die elk een eiwitblokkeerstap bevatten, een primair antilichaam, een secundair antilichaam, een Tyramide-vloer en vervolgens antigeen ophalen om de antilichamen te verwijderen. Als u de dropbesturingselementen wilt toevoegen, kopieert u de naam van 7 Multiplex Protocol 1 en wijzigt u deze in 7 Multiplex Protocol 1 CD68 Drop. Verander het CD68 anti-body reagens in Mouse IgG en sla het protocol op.

Maak vervolgens nog zes nieuwe protocollen, één voor elke dropcontrole en één voor het volledige iso-type besturingselement op dezelfde manier. Maak een drop control protocol voor elk doel op dezelfde manier als ik je hier heb laten zien. Om een onderzoeksdetectiekit voor te bereiden, vult u de 30 milliliter open container die is gemarkeerd voor 1x tris-gebufferde zoutoplossing met 1x tris-gebufferde zoutoplossing, en plaatst u de container in de verste positie van de handgreep in de Multiplex Research Kit 1.

Label twee 30 milliliter open containers muli-spectrale blok'en multi-spectrale secundaire, en vul de mutli-spectrale blok container met 30 milliliter van het blokkeren van buffer antilichaam verdunningsmiddel uit de Multi-Spectral Kleuring Kit. Vul de multispectrale secundaire container met 30 milliliter anti-muis anti-rabiate secundaire antilichaam polymeer uit de Multi-spectrale kleuring kit en voeg 600 microliter antilichaam verdunningsmiddel aan elk van de tien 7 milliliter open containers. Voeg vervolgens het geconcentreerde primaire antilichaam toe aan de juiste buizen in de volumes die in de tabel worden aangegeven, en meng door zachte pipetting.

Voeg 3 milliliter dubbel gedestilleerd water, plus 12 druppels spectrale dapi in een 7 milliliter open container, en 3 milliliter peroxidase blok in een tweede 7 milliliter open container. Schorsen elke geliathalized vloer met 75 microliter van dimethylsulfoxide en meng door pipetting. Bewaar vervolgens de Tyramide signaalversterkingsvloervoorraden op 4 graden Celsius tot ze klaar zijn.

Tijdens de voorbereiding van de individuele TSA vloerverdunningen. Registreer alle reagentia op de auto-vlek, plaats dan elke container in een reagens rek en laad alle reagentia op de geautomatiseerde vlek. De vlek zal de aanwezigheid detecteren en het volume van elk reagens bevestigen.

Zodra alle reagentia zijn geladen, activeert u het protocol om 's nachts uit te voeren. Aan het einde van de kleuringsprocedure u de monsters met afdekslips monteren en de monsters in de Multi-Spectral Imaging Platform Scanner laden om te scannen. Wanneer alle monsters zijn gescand, worden de afbeeldingen opgemaakt als qptiff-bestanden.

Open een geschikt qptiff-analysesoftwareprogramma en klik op laaddia'om een hele diascan van vijf filters van de dia van belang te openen. Log in en gebruik het stempelgereedschap om vijf regio's te selecteren voor multispectrale beeldvorming. Selecteer onder Selecteren voor:selecteer Acquisitie'under Grootte in velden:selecteer 1x1 en selecteer onder Veldresolutie'selecteer 0,5 micrometer 20x.

Op basis van deze cytokeratine kleuring selecteer verschillende regio's met zowel cytokeratine positieve tumorweefsel, en cytokeratine negatieve stromal weefsel te worden afgebeeld uit de totale scan. Wanneer alle multispectrale afbeeldingen zijn geselecteerd, schakelt u over naar de Vectra-software en wijzigt u de taak van scan' naar multispectrale beeldvorming'voor elke dia. Klik vervolgens op scannen om de multispectrale imaging-collectie uit te voeren.

Wanneer de multispectrale beeldverwerving is voltooid, gebruikt u de spectrale niet-mengsoftware om bestanden te openen in de multispectrale afbeeldingsmap. Selecteer onder afbeeldingsformaat'select multi-spectral'Under sample format'select fluorescentie'En onder Spectral Library Source'select inForm'Om de vloeren te selecteren, alle zes verdiepingen te selecteren en te laden, en dapi uit de voorbeeldbibliotheekdia's en klik op alles voorbereiden. De spectrale niet-mengsoftware zal spectrale unmixing uitvoeren op alle open beelden met behulp van de meegeleverde spectrale profielen.

Identificeer en annoteren van de auto-fluorescerende spectrale profiel. Zorg ervoor dat u de auto-fluorescerende functie te controleren om ervoor te zorgen dat het volledig is vastgelegd in de auto-fluorescerende kanaal na het niet mengen en om verschillende bemonsteringen te testen totdat het aanvaardbaar wordt verwijderd. Beoordeel vervolgens het kleurpatroon tegen de chromogene enkele vlekken van hetzelfde doel in sequentiële dia's van hetzelfde weefsel met een patholoog.

Als u de fluorescentieintensiteit van elk kanaal wilt beoordelen, gebruikt u het gereedschap telt om de geopende beelden te onderzoeken. Ga vervolgens terug naar het kleuringsprotocol en pas de TSA-concentratie aan om genormaliseerde tellingen aan te pakken die het aanvaardbare bereik overschrijden of niet bereiken. In deze representatieve analyse toonde het tonsillenweefsel een duidelijk gedefinieerde cytokeratine-kleuring binnen het tonsillenoppervlak, plaveiselepeel zonder achtergrond in het lymfeweefsel met cytokeratine en PDL-1-kleuring zichtbaar in het reticulatele epitheel van de crypten.

De folliculaire kiminale centra waren gemakkelijk herkenbaar en rijk aan Ki-67 positieve lymfocyten. De macrofagen aanwezig in de kiedelcentra werden geïdentificeerd door hun CD-68 expressie met een aantal macrofagen ook waargenomen buiten het kiedelcentrum. CD-8 gekleurde lymfocyten met een T-celverdeling en PD-1 expressie sterk gekleurd kleine lymfocyten geclusterd aan de periferie van het kiercentrum, evenals verspreid over het interfolliculaire gebied.

Nadat het verwachte kleuringspatroon werd bevestigd in de amandelweefselcontrole, kon dezelfde kleuring vervolgens worden geëvalueerd in een longkankermonster. Isotype negatieve controles en drop controles moeten ook worden geëvalueerd;niet alleen voor de detectie van achtergrond en auto-fluorescentie, maar ook voor paraplu effecten en spectrale bloeding. Drop controles zijn belangrijk voor de evaluatie van potentiële artefacten in de kleuring als gevolg van de multi-plex immunofluorescentie methode tijdens de optimalisatie van een nieuwe multi-plex paneel.

Elke druppelcontrole moet hetzelfde kleurpatroon vertonen als het volledige multiplex-paneel, met uitzondering van het enkele primaire antilichaam dat op elke specifieke controle moet worden verwijderd. Immunoprofilering met multispectrale immunofluorescentie zorgt voor de gelaagdheid van tumoren en regio's op immuuncriteria die vervolgens kunnen worden onderzocht door massaal multiplex genomische, transcriptomische en proteomische studies. Ik heb multi-plex immunofluorescentie gebruikt om werkingsmechanismen in oncologie en auto-immuunziekten te onderzoeken die de identificatie en karakterisering van immuun en pathogene cellen in één sectie in setu mogelijk maakt.

Algemene voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen bij het werken met antilichamen tegen menselijke eiwitten, Tyramide en dapi, maar geen reagens of materiaal in dit protocol is bekend dat bijzonder gevaarlijk.