Name: Een roman In Vitro Model van traumatische hersenenverwonding Blast (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Leer een nieuw in vitro model voor traumatisch hersenletsel door schokgolven op muizenhippocampusslices toe te passen. Deze eenvoudige, reproduceerbare methode ondersteunt screening van neuroprotectieve geneesmiddelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ondersteund door: Koninklijke centrum voor defensie geneeskunde, Birmingham, Verenigd Koninkrijk, Koninklijke Britse legio centrum voor Blast letsel Studies, Imperial College London, Verenigd Koninkrijk. Medische Onderzoeksraad, London, Verenigd Koninkrijk (MC_PC_13064; MR/N027736/1). De veiligheid van Gas vertrouwt, London, Verenigd Koninkrijk. Rita Campos-Pires was de ontvanger van een doctoraatsvorming award van de Fundação para een Ciência e een Tecnologia, Lissabon, Portugal. Katie Harris ontving een PhD studententijd van de Westminster Medical School Research Trust, London, Verenigd Koninkrijk.
Dit model werd ontwikkeld met de steun van het Royal British Legion centrum voor Blast letsel Studies (RBLCBIS) aan het Imperial College. Wij willen de financiële steun van het Royal British Legion erkennen. Onderzoekers die geïnteresseerd zijn in samenwerkingen of nader contact opnemen met de auteurs of RBLCBIS.
Wij danken Dr Amarjit Samra, directeur van het onderzoek, Royal-centrum voor defensie geneeskunde, Birmingham, Verenigd Koninkrijk, voor de ondersteuning van dit werk, Scott Armstrong, afdeling chirurgie & kanker, Imperial College London, voor hulp bij het voorbereidende experimenten , Theofano Eftaxiopolou, Hari Arora & Luz Ngoc Nguyen, departement van Bioengineering Imperial College London, William Proud, departement van natuurkunde Imperial College London, voor advies over de schok-buis, Raquel Yustos, technicus, departement onderzoek van biowetenschappen, Imperial College London, voor technische ondersteuning, Paul Brown MBE, workshop manager en Steve Nelson, werkplaats technicus, ringen Department of Physics, Imperial College London, voor het maken van de metalen, Neal Powell van de faculteit natuurkunde, Imperial College London, voor illustraties.

De beschreven in dit manuscript experimenten werden gedaan in overeenstemming met de wet van het Verenigd Koninkrijk dieren (wetenschappelijke procedures) van 1986 en zijn goedgekeurd door de Animal Welfare & ethische beoordeling lichaam van Imperial College London. Verzorging van de dieren was in overeenstemming met de institutionele richtsnoeren van Imperial College London.
1. hippocampal Organotypic Slice voorbereiding en cultuur
Opmerking: Dit protocol maakt het mogelijk de productie van hippocampal segmenten van de organotypic volgens de interfacemethode beschreven door Stoppini en collega's met kleine wijzigingen21,22,23. Idealiter moeten niet meer dan drie dieren euthanized en ontleed in één sessie om ervoor te zorgen dat elke stap gebeurt snel en om te voorkomen dat afbreuk te doen aan de kwaliteit van de segmenten. Gebruik van aseptische techniek in.
<ol><li>Ervoor dat de volgende stappen worden genomen voordat het protocol van de dissectie.<ol>
<li>Bereiden en filter steriliseren alle oplossingen van tevoren met behulp van een 0,22 µm filter.</li>
		<li>De oplossingen bij 4 ° C houden tijdens de opslag en de rest van de hersendissectie en de voorbereiding van de hippocampal segment door het houden van de opslagtanks en de petrischaaltjes op een metalen heat sink zittend op nat ijs te allen tijde.</li>
		<li>Autoclaaf geheel metalen instrumenten, ringen en papier weefsels.</li>
		<li>Zorgen voor alle instrumenten en materiaal moet worden gebruikt voor elke stap van het protocol zijn klaar voor gebruik, vooraf aangelegd en besproeid met 70% ethanol. Ervoor dat ze te koelen en drogen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Een 5-7-daagse euthanaseren-oude C57BL/6N muis pup door cervicale dislocatie en kort de hele huid Navegen met steriel papier weefsel gedrenkt in 70% ethanol. DEP de huid droog en de pup met behulp van Mayo schaar onthoofden.</li>
	<li>Snijd de hoofdhuid huid met een iris schaar langs de middellijn van het hoofd in de occipital regio begint en eindigt in de buurt van de snuit en het lateraal intrekken.</li>
	<li>Breng de tip van Vannas schaar in het achterhoofdsgat en bezuinigen twee kleine laterale op het bot langs de dwarse sinussen, dan snijden de schedel langs de middellijn tot de bulbus olfactorius en bezuinigen twee kleine loodrecht op de middellijn in deze regio.</li>
	<li>Met fijne punt gebogen pincet, intrekken van de kleppen van been zijwaarts weg van de middellijn, zorgvuldig verwijderen van de hersenen met een kleine spatel en overbrengen naar een 90 mm silicone-elastomeer beklede petrischaal met "dissectie medium". Opmerking: Dissectie medium is dat Gey de evenwicht zoutoplossing (D-glucose 5 mg/mL, 1% antibioticum-antimycotic oplossing, met 10.000 eenheden/mL penicilline, 10 mg/mL streptomycine en 25 µg Mo/mL amfotericine B).</li>
	<li>Verwijder het cerebellum en scheiden van de hersenhelften langs de middellijn met behulp van een scheermesje. Gebruik een spatel de hersenhelften overbrengen naar een nieuwe 90 mm siliconen petrischaal elastomeer beklede gevuld met verse ijskoude dissectie medium. Als meer dan één dier worden gebruikt in één sessie, herhaal stap 1.2-1.6.</li>
	<li>Onder een stereomicroscoop, snijd de bulbus olfactorius en het puntje van de frontale cortex met een scheermesje en de hersenschors te scheiden van de rest van de cerebrale weefsel met fijne punt pincet. Deze stap laat de hippocampus op het mediale oppervlak van de corticale weefsel wordt blootgesteld. Vanuit deze stap verder, met een laminaire flow weefselkweek kap (ultraviolet gesteriliseerd en gereinigd met 70% ethanol oplossing).</li>
	<li>Ijskoude dissectie medium van toepassing op een plat plastic hakken schijf en het hersenweefsel met behulp van een spatel, positie op de schijf zodanig dat het mediale oppervlak van de cortex boven ligt en de as van de hippocampus loodrecht op de as van het hakken blad is.</li>
	<li>Verwijder zo veel mogelijk van het medium van de dissectie van de hakken schijf met behulp van een fijne tip Pipet van Pasteur.</li>
	<li>Snijd de hersenen in 400 µm plakjes met behulp van een weefsel chopper met een 50% hakken snelheid en kracht. Opmerking: Het is zeer belangrijk dat deze stap zo spoedig mogelijk het hersenweefsel wordt niet ondergedompeld in dissectie medium wordt gedaan.</li>
	<li>Vervang het medium van de dissectie in de silicone-elastomeer beklede petrischaal met verse ijskoude medium.</li>
	<li>Zodra de helikopter weefsel wordt gebeëindigd, zorgvuldig onderdompelen het hersenweefsel in verse dissectie medium, en de gesneden weefsel ook terug overzetten naar de 90 mm siliconen elastomeer beklede petrischaal met behulp van een scalpel rechte blade.</li>
	<li>Onder een stereomicroscoop, Scheid zorgvuldig de corticale segmenten met fijne punt pincet. Voor elk segment, Inspecteer de hippocampus voor morfologie en potentieel weefselschade die voortvloeit uit de dissectie of snijden.</li>
	<li>Scheid de hippocampi uit de Entorinale cortex en de fimbria met fijne punt pincet en kleine Vannas schaar. Meestal worden ongeveer 6 tot 8 hippocampal segmenten gegenereerd per halfrond.</li>
	<li>Maximaal 6 hippocampal segmenten overbrengen in een weefselkweek invoegen met behulp van een knip Pasteur pipet en plaats het binnen een 35 mm Petri schotel. Zorg ervoor dat de segmenten verspreid een paar millimeter uit elkaar (hierdoor dat elk segment afzonderlijk image kan worden gemaakt).</li>
	<li>Onmiddellijk toevoegen ijskoude "groeimedium" aan de onderkant van elke petrischaal, onder de weefselkweek invoegen, net onder de top van de weefselkweek invoegen rand. Opmerking: Groeimedium bevat 50% Minimum essentiële medium Eagle, 25% Hanks evenwichtige zoutoplossing, 25% paard serum, 5 mg/mL D-glucose, 2 mmol/L L-glutamine, antibioticum-antimycotic 1%-oplossing en 10 mmol/L HEPES, pH 7,2 met natronloog wordt getitreerd.</li>
	<li>Wijzig het groeimedium overmorgen de dissectie en vervolgens elke 2 tot 3 dagen daarna (gebruik groeimedium bij 37 ° C). Ervoor zorgen dat het groeimedium is toegevoegd in voldoende bedrag, maar niet zozeer dat het loopt over in de weefselkweek invoegen membraan, dat kan de levensvatbaarheid van de plakjes weefsel.</li>
	<li>Houd de plakjes weefsel in een bevochtigde incubator bij 37 ° C met 5% kooldioxide in de lucht voor 12 tot 14 dagen vóór het wordt gebruikt in experimenten.</li>
</ol>2. voorbereiding van de Hippocampal Organotypic-segmenten voor de experimentele Blast TBI Protocol
Opmerking: Alle stappen van deze sectie, met uitzondering van imaging, plaatsvinden in een laminaire flow weefselkweek kap.
<ol><li>De op maat gemaakte roestvrij stalen ringen invoegen in een 6 goed plaat (één per putje). OPMERKINGEN: De ringen hebben een rand met een inkeping (die moet zitten in de 12 uur positie) en pasvorm zonder speling in de putten, terwijl de weefselkweek voegt gemakkelijk passen in de velg. Zorg ervoor dat de ringen zijn gewassen met een bactericide ontsmettingsmiddel, grondig gespoeld met gezuiverd water, gesteriliseerde met autoclaaf en toegestaan om af te koelen op voorhand.</li>
	<li>Vul de put van de 6-well plaat met voorverwarmde (37 ° C) serumvrij "experimentele medium" met propidium jodide. Opmerking: Experimental medium met propidium jodide is: 75% Minimum essentiële medium adelaar, 25% Hanks evenwichtige zout oplossing, 5 mg/mL D-glucose, 2 mmol/L L-glutamine, antibioticum-antimycotic 1%-oplossing, 10 mmol/L HEPES en 4.5 µmol/L propidium jodide, milliliters gestelde pH tot 7.2 met natriumhydroxide.</li>
	<li>Ervoor zorgen dat het niveau van het medium niet boven de inkeping van de ring bereikt. De 6-well plaat met de ringen ook terug overzetten naar de incubator voor 1 h om ervoor te zorgen dat het medium bij 37 ° C onmiddellijk voordat de weefselkweek inserts worden overgebracht.</li>
	<li>De weefselkweek inzetstukken met de segmenten van de organotypic van de 35 mm petrischalen overboeken naar de 6-well plaat met de ringen en het experimentele medium met een tang.</li>
	<li>Maak een stip op de velg invoegen in de 3 oclock ' toestand met een permanente marker pen. Opmerking: De inserts zijn gonna worden verwijderd uit de 6-well plaat tijdens het experiment en deze stap vergemakkelijkt het invoegen op de oorspronkelijke positie terugkeren na de schokgolf blootstelling en voor het gemakkelijk bijhouden van elk segment in het gehele protocol.</li>
	<li>Label elke 6-well-plaat met een unieke naam & datum en maak een kaart van de putten van elke plaat, naamgeving elk putje (bv., A, B, C, enz.) en elk segment in elk putje (bv. 1, 2, 3, enz.), zodat elk segment een unieke id ( heeft bijvoorbeeld., A1, A2, A3, enz.).</li>
	<li>De 6-well plaat overbrengen in de incubator voor 1 h om ervoor te zorgen dat de segmenten zijn bij 37 ° C vóór imaging. Opmerking: Vermijd overloop van medium of bubbels van lucht onder de weefselkweek invoegen membraan, dat kan de levensvatbaarheid van de segmenten.</li>
	<li>1 h na de overdracht op experimentele gemiddeld, afbeelding, elke slice afzonderlijk met behulp van een fluorescentie Microscoop (2 X doelstelling, NB 0,06) voorzien van een passende excitatie (BP 535/50 nm) en emissie (LP 610 nm) filter te beoordelen segment gezondheid voordat de schade Protocol wordt uitgevoerd. OPMERKINGEN: De segmenten die vertonen gebieden van dichte rode vlekken in dit stadium moeten worden geacht gecompromitteerde levensvatbaarheid en moeten worden uitgesloten van verdere analyse (deze vertegenwoordigen typisch minder dan 10% van het totale aantal segmenten gegenereerd). Zorgen dat de beeldvorming wordt uitgevoerd op een sequentiële wijze en zo spoedig mogelijk om te minimaliseren van de tijd die de segmenten buiten de incubator zijn (meestal 6 putten moeten nemen amper 30 min naar afbeelding).</li>
	<li>Houd het deksel van de 6-well plaat op te allen tijde. Sommige condensatie kan aan de binnenkant van het deksel opbouwen. Als dit gebeurt, moet u kort een haardroger gebruiken op de instelling laag.</li>
	<li>Zorg ervoor dat alle imaging voorwaarden identiek, op verschillende dagen en tussen experimenten zijn. Opmerking: Het doel van imaging is te kwantificeren van de fluorescentie van weefsel, vandaar deze stap is belangrijk om te zorgen voor de reproduceerbaarheid van de resultaten en de vergelijking van de verkregen gegevens.</li>
</ol>3. onderdompeling en vervoer van de weefselkweek wordt ingevoegd met de segmenten van de Hippocampal Organotypic
<ol><li>Onmiddellijk na imaging, een laminar flow Hood, nemen een weefselkweek invoegen uit de plaat van de 6-well met pincet</li>
	<li>Zorgvuldig borrelen overdracht de invoegen om een steriele polyethyleen zak (3 "x 5") vooraf gevuld met 20 mL warm (37 ° C) experimentele voedingsbodem vers met 95% zuurstof en 5% kooldioxide. Opmerking: Zorg ervoor dat de zuurstof en kooldioxide verrijkt experimentele medium werd voor ten minste 40 min. met 95% te zuurstof en 5% koolstofdioxide borrelen, met behulp van een scintered-glazen waterpijp in een Dreschel fles en overgebracht in de steriele polyethyleen zakken binnen een laminaire flow weefselkweek kap met behulp van een spuit van 20 mL met een bacteriële filter en een steriel vullen buis (127 mm) aangesloten. Verzegel de zakken onmiddellijk en hen overbrengen in een incubator 37 ° C gedurende ten minste 1 uur voordat de weefselkweek invoegt overdracht.</li>
	<li>Ervoor zorgen dat elke steriele zak (met de plaat en goed identificatie) is correctgeëtiketteerd. Herhaal deze stap voor elke weefselkweek invoegen. Uitsluiten van de luchtbellen zorgvuldig bij het afdichten van de steriele zakken (gedaan veilig door het draaien van de bovenkant van de zakken en door een plastic klem toe te passen).</li>
	<li>De steriele zakken met de weefselkweek inzetstukken en de 6-Wells-platen met experimentele medium in de 37 ° C incubator retourneren</li>
	<li>Na 1 h, zorgvuldig koffers de steriele met de weefselkweek inserts in kunststof dozen binnen een thermo-gereglementeerde doos gevuld met-geïoniseerd water bij 37 ° C te houden van de segmenten van de organotypic op fysiologische temperatuur die overal in het blootstelling van de schokgolf Protocol.</li>
</ol>4. voorbereiding van de schok buis en Hippocampal Organotypic Slice schokgolf blootstelling
<ol><li>Draag beschermende laarzen van staal-teen, een laboratorium jas en handschoenen tijdens de voorbereiding van de buis van de schok en de blootstelling van de schokgolf.</li>
	<li>Bout het steriele zak houder frame aan de schok buis distale flens, ervoor te zorgen dat het centrale gat wordt uitgelijnd met de schok buis uitlaat (met behulp van een blanking staaf).</li>
	<li>Mount twee druk transducers radiaal: sensor 1, in het middelste deel van de gedreven sectie en de sensor 2 in de distale flens van de schok-buis (figuur 1A). De druk transducers verbinden met een oscilloscoop door middel van een huidige vermogen brontoestel.</li>
	<li>Zorg ervoor dat alle schok buis release kleppen en stroom besturingselementen zijn gesloten.</li>
	<li>Open de externe persluchtleiding en laad de magneetklep naar 2.5 bar.</li>
	<li>Open de perslucht cilinder veiligheidsklep en langzaam de drukregelaar te verhogen de druk naar ongeveer 5 bar. Opmerking: De druk instellen voor deze regulator moet iets boven het hoogste middenrif barstdruk.</li>
	<li>Bereid het pessarium door snijden 23 µm dik polyester vellen in 10 x 10 cm2 vierkanten. Bereiden de grepen met behulp van autoclaaf tape en hen vast te houden aan de boven- en onderkant van elke middenrif.</li>
	<li>Positie één membraan (één sleuf van de dubbele staartstuk - één membraan configuratie) of twee pessarium (beide sleuven van de dubbele staartstuk - dubbel membraan configuratie) in het staartstuk (figuur 1B).</li>
	<li>Het pessarium centreren, en klem hen met behulp van vier M24 bouten en moeren, vastmaken hen opeenvolgend een diagonaal symmetrische wijze en ervoor te zorgen dat het pessarium zijn rimpel-vrij.</li>
	<li>Klem elke steriele zak individueel in verticale positie op het frame van de houder, ervoor te zorgen dat het oppervlak van de weefselkweek inzetstukken met de organotypic hippocampal segmenten wordt geconfronteerd met de schok buis uitlaat en de weefselkweek invoegen is gecentreerd binnen de steriele tas (Figuur 1 c). Zorg ervoor dat het steriele zak om stevig en zelfs immobilisatie veilig rondom is geklemd.</li>
	<li>Draag oor verdedigers en veiligheid bril bij druk uit op de buis van de schok. Zet de huidige vermogen brontoestel en oscilloscoop te verwerven van de gegevens van de schokgolf (overname tarief van 50 mega-monsters/s, record lengte 20 ms, 1 miljoen punten) en magneetventiel te sluiten.</li>
	<li>Met de bedieningsknop van de stroom op het bedieningspaneel van schok buis, langzaam druk uitoefenen van de driver volume sectie van de buis van de schok voor één membraan configuratie of zowel de bestuurder volume en de dubbele stuitligging sectie van de schok buis voor dubbel membraan configuratie. Opmerking: Voor één membraan configuratie, de barstdruk hangt alleen het middenrif materiaal en dikte en het middenrif zal spontaan scheuren als het materiaal barstdruk is bereikt. Voor de configuratie van de dubbele membraan, de barst druk zal ook afhangen van het gas drukverschil in zowel de bestuurder en de dubbele stuitligging kamers en, voor het pessarium te barsten op een gecontroleerde manier, de dubbele stuitligging veiligheidsklep handmatig eenmaal is geopend de druk van het doel zijn bereikt.</li>
	<li>Zodra het middenrif breuken (produceren een luid geluid), snel sluit de stroom van de samengeperste lucht met behulp van de stroom-knop en open de solenoïde ventiel voor vers. Opmerking: Het totale volume van de driver sectie kan worden gewijzigd door de invoeging van blanking segmenten, waardoor een breder scala van schokgolf piek overdruk en duur te worden verkregen. De ideale combinatie van schokgolf parameters moet voldoende zijn om weefsel letsel te veroorzaken, maar niet zo hoog dat het veroorzaakt weefselkweek invoegen of steriele zak vervorming of breuk.</li>
	<li>Elke steriele zak met een weefselkweek invoegen om een enkele buis schokgolf bloot en het onmiddellijk terugkeren naar het vak thermo-gereglementeerde voordat een nieuwe steriele zak is genomen uit de doos en geklemd op het frame van de houder. Ervoor zorgen dat stappen 4.10 – 4.14 zijn uitgevoerd als soepel en snel mogelijk (binnen een paar minuten) om te voorkomen dat de experimentele middellange koeling naar beneden, als temperaturen minder dan 37 ° C met de ontwikkeling van de schade interfereren kunnen.</li>
	<li>Zodra alle weefselkweek inserts zijn blootgesteld aan een schokgolf (of sham protocol), de weefselkweek inserts terugkomen op de oorspronkelijke 6-well-plaat en hun respectieve goed (binnen een laminaire flow weefselkweek kap) en terugkeren naar de incubator.</li>
	<li>De 6-well-plaat in de incubator met 5% kooldioxide in de lucht houden bij 37 ° C tot verdere imaging.</li>
	<li>Sham besturingselementen opnemen voor elk experiment, samen met de blootstelling van de schokgolf segment. Opmerking: Sham segmenten zijn identiek getrakteerd op de segmenten blootgesteld aan een schokgolf (verzegeld in de steriele zakken met experimentele medium, vervoerd naar het laboratorium van de buis schok in dezelfde thermo-gereglementeerde vak en geschorst op het metalen frame voor een equivalente periode van tijd) maar de schok buis wordt niet gestart.</li>
</ol>5. hippocampal Organotypic segment schade kwantificering
<ol><li>Bij 24 uur, 48 uur en 72 h, het imago van de segmenten zoals beschreven in stappen 2.8 en 2.9.</li>
	<li>Na beeldvorming op 72 h post schokgolf blootstelling, negeren de weefsel volgende lokale biologische afval protocollen en desinfecteren en autoclaaf de metalen ringen.</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Onder alle mechanismen van schade die is gekoppeld aan blast TBI (primaire, secundaire en tertiaire hoogoven letsel mechanismen), primaire hoogoven letsel is uniek voor blast trauma en het is de minst begrepen van de blast-geassocieerde mechanismen1,2 . Het nieuwe protocol hier beschreven werd ontwikkeld om te bestuderen van primaire blast TBI met behulp van een buis open schok om in vitro hippocampal segment culturen van de muis om een enkele schokgolf met behulp van een eenvoudige en snelle protocol waarmee de oprichting van een reproduceerbare bloot te stellen primaire blast TBI met een hoog debiet.
De eerste in vitro primaire blast TBI modellen toegepast hydrostatische drukgolven op cellen26,27. De druk-uitvoer heeft de Friedlander-functie echter niet model zoals de duur van een puls hydrostatische druk veel langer dan lucht blast overdruk golven13 was. Het kenmerk Friedlander functie kan gemakkelijk worden gemodelleerd in het laboratorium met behulp van een schok buis1,8. De schok-buis kan produceren schokgolven die levensechte open veld explosies in een conventionele labo-omgeving, simuleren terwijl de nauwkeurige controle van Golf parameters, zoals de piek overdruk, positieve Golf duur en impuls, door het variëren van de middenrif materiaal en dikte, en de bestuurder volume8,28,29.
Eenvoudige in vitro modellen zoals celculturen ontbreken meestal de heterogeniteit van de celtypes en synaptische verbinding30. Onlangs, is het effect van de ontploffing op in vitro hersenen cel 'spheroïden' integratie van verschillende celtypes onderzochte31geweest. Nader onderzoek van deze interessante preparaten is verdiend; het is echter niet duidelijk hoe de intact hersenen komt overeen met de cellulaire organisatie en connectiviteit. OHSC zijn een gevestigde in vitro experimentele model23,32, zijn gemakkelijk aan cultuur en hun drie-dimensionale weefsel cytoarchitecture, celdifferentiatie en synaptische verbinding zijn goed bewaard gebleven en zeer soortgelijk aan die in vivo33,34,35,,36. OHSCs vertegenwoordigen een intermediair niveau van complexiteit tussen celkweek en een in vivo model23,32. OHSCs hebben aangetoond te reproduceren in vitro pathologische neurodegeneratieve cascades gezien in in-vivo modellen en zijn zeer nuttig in de screening van potentiële neuroprotectieve drugs en inzicht in de mechanismen van actie17,21,22,37,38. Tot slot, de anatomische gebied bestudeerd, de hippocampus, is zeer relevant in translationeel TBI studies, deze regio is vaak beschadigd in TBI patiënten39,40,41. OHSC zijn gebruikt om model blast TBI28,42,43,44, ons model is echter relatief eenvoudig en kan worden aangepast aan de bestaande schok-buizen in een horizontale of verticale configuraties zonder ingewikkelde aanpassingen.
OHSC kunnen worden gehouden in cultuur voor vele dagen, dat het onderzoek naar biologische processen over tijd34vergemakkelijkt. In dit model, de weefsel schade die het gevolg is van blootstelling van de schokgolf dagelijks werd gemeten gedurende drie dagen, na de ontploffing blootstelling met behulp van propidium jodide, een gevestigde marker van celbeschadiging. Propidium jodide is een niet giftig zeer polaire kleurstof die de cellen met gecompromitteerde cellulaire membranen, waar het zich bindt aan nucleïnezuren en vertoont een karakteristieke felle rode fluorescentie24,25,45doordringt. De fluorescentie gemeten met propidium jodide is aangetoond dat een goede correlatie met gewonde cel tellen met behulp van Nissl kleuring van46,47.
Gezien het feit dat de schade in dit model geproduceerd was diffuus (figuur 2C), werd de fluorescentie van het hele segment gemeten bij het uitvoeren van de analyse, vergelijkbaar met de eerder gepubliceerde werk in andere hersenen letsel paradigma's21,22 , in plaats van met behulp van specifieke regio's, zoals is gebeurd in andere in vitro blast TBI modellen28,43,44,48. De totaalaanpak gebruikt in de in dit artikel beschreven model schaft ook de potentiële variabiliteit die is geïntroduceerd als waarin gebieden van belang omschreven en het geeft een vollediger beeld van de ontploffing-gerelateerde schade. Zowel schokgolf piek overdrukken, 50 kPa en 55 kPa, geproduceerd significant (p < 0,05 en p < 0,0001, respectievelijk) letsel in vergelijking met sham segmenten (Figuur 2B). Zoals verwacht, de schokgolf met de hoogste piek overdruk, produceerde 55 kPa, meer schade dan de 50 kPa Golf. In een in vitro model met geïsoleerde hersenen blootgesteld weefsel rechtstreeks aan een shockwave, hoe nauwkeurig schaal aan het hele organisme of een menselijk wezen is niet eenvoudig. De schokgolven die we gebruikten zijn echter binnen het bereik van de piek overdrukken waargenomen in het veld, meestal 50-1.000 kPa8,49.
Teneinde de OHSC blootgesteld aan fysiologische temperatuur en niveaus van zuurstof en kooldioxide, en tegelijkertijd te garanderen dat zij vrij van besmetting in het gehele protocol schokgolf blootstelling waren, waren de weefselkweek inserts verzegeld in steriele polyethyleen zakken na een aseptische techniek, ondergedompeld in experimentele medium opgewarmd tot 37 ° C en vers borrelen met 95% zuurstof en 5% van kooldioxide, ook tot eerder gepubliceerde werk28,43,44 ,48. In tegenstelling tot deze modellen waar complexe apparaten werden gebruikt om te houden van de steriele zakken tijdens de schokgolf blootstelling, in dit protocol, werd een eenvoudige en snelle methode gebruikt op te schorten de OHSC weefselkweek inserts voor de schok buis outlet (figuur 1A, C ). Het model, als beschreven in dit document maakt snelle verwerking en hoge doorvoer, terwijl het minimaliseren van het risico van onderkoeling. Deze aspecten zijn bijzonder relevant voor neuroprotectie studies, gezien het feit dat sommige therapeutische interventies een zeer beperkte tijd venster van potentiële toepassing na TBI wellicht. Deze roman schokgolf blootstelling protocol kunnen 6 tot en met 9 weefselkweek wordt ingevoegd (doorgaans 36 tot en met 54 hippocampal organotypic weefsel segmenten) worden blootgesteld aan een schokgolf in een korte tijd (ongeveer 1 h).
De OHSCs vereisen goede aseptische techniek in. Het is belangrijk dat u de kap van een aseptische laminaire flow tijdens het kweken en bij het overbrengen naar de steriele zakken voor blast. Ter vervulling van de segment-beeldvorming onder aseptische condities met de deksels van de 6-Wells-platen op zijn plaats, gebruiken we op maat gemaakte metalen ringen om de cel cultuur inzetstukken aan het brandvlak van de Microscoop. Een belangrijk onderdeel van ons protocol is dat we ongedeerd sham segmenten in elk experiment opnemen. Sham segmenten zijn identiek getrakteerd op blast segmenten met de uitzondering dat de schok-buis niet ontslagen wordt; een andere belangrijke stap is dat alle segmenten 1 h zijn beeld voor letsel of sham behandeling, om ervoor te zorgen dat de gezondheid van de bevolking van segmenten gebruikt identiek (figuur 2B).
Naast het kwantificeren van de schade van de cel in de segmenten na verloop van tijd, kan het weefsel worden bevestigd aan het einde van het experiment voor conventionele immunohistochemistry50. Wij ontwikkeld en geëvalueerd van de methode met behulp van de muis hippocampal segmenten. Onze techniek zou echter eenvoudig aangepast aan het gebruik van andere weefsels die kan worden geteeld in cultuur, zoals ruggenmerg, netvlies, Long of epitheelweefsel. In dit papier en onze eerdere werk met het model onderzochten we alleen het effect van blootstelling aan een enkele stoot. Het model zou echter zeer geschikt voor het onderzoeken van de effecten van herhaalde low-level ontploffingen op de hersenen of andere weefsels. OHSCs kunnen worden bewaard in cultuur voor vele weken of zelfs maanden, chronische effecten moeten worden onderzocht.
In vitro modellen, wordt eenvoudiger dan in vivo modellen, hebben een hogere doorvoer, zijn minder duur en experimenten kunnen meestal worden voltooid op een kortere tijd schaal17. De resultaten verkregen met behulp van in vitro modellen moeten echter worden gevalideerd in diermodellen zoals in vitro gekweekt weefsels worden bewaard in een kunstmatige omgeving en kunnen reageren op letsel verschillend van wat zij zouden in vivo17. Niettemin, in vitro modellen zijn uiterst waardevol in het vergroten van onze kennis voor hersenen letsel cascades en bij bevolkingsonderzoek neuroprotectieve drugs voordat het gebruik van meer complexe in-vivo modellen17,22 , 51 , 52. ondanks de vele voordelen door dit model aangeboden, het is belangrijk op te merken dat in vitro modellen ontbreken de sleutel functies van TBI in dieren en in vivo modellen, zoals de gevolgen voor het vaatstelsel presenteren, verhoogde intracraniële Druk, systemische immuunrespons en functionele gedrags bijzondere waardevermindering, waarin wordt gewezen op de noodzaak voor het valideren van de resultaten uit in vitro modellen in het hele dier. In vitro modellen zoals de model, als beschreven in dit document zijn echter uiterst nuttig translationally relevante wetenschappelijke tools.
Kortom, beschrijft dit werk een eenvoudig en ongecompliceerd nieuwe methode waar muis organotypic hippocampal weefselcultures blootstaan aan een strak gecontroleerde en reproduceerbare levensechte relevante schokgolven met behulp van een laboratorium schok buis. De resulterende globale schade, die werd gekwantificeerd aan de hand van propidium jodide, een gevestigde marker van celschade, zeer reproduceerbaar is en is evenredig aan de piek overdruk van de schokgolven toegepast.

Blast traumatisch hersenletsel (TBI) is een complexe vorm van hersenletsel die uit de ontploffing van explosieven1,2 voortvloeit. Blast TBI heeft ontpopt als een belangrijke gezondheidskwestie in de afgelopen 15 jaar met de recente militaire conflicten in Irak en Afghanistan2,3. Over het algemeen geschat wordt dat tussen 4,4% en 22,8% van soldaten die terugkeren uit Irak en Afghanistan hebben geleden milde TBI, een groot deel daarvan wordt blast-gerelateerde, met een gerapporteerde hoger voor blast TBI in de Amerikaanse troepen in vergelijking met de UK-forces4 ,5.
Het gebruik van geïmproviseerde explosiemiddelen zijn geweest die verantwoordelijk is voor de meeste van de blast-geassocieerde trauma, met inbegrip van ontploffing TBI, doorstaan door de strijdkrachten6. De detonatie van een explosieve lading resulteert in een zeer snelle — maar voorbijgaande — toename van de druk, die zich in milliseconden. De resulterende overdruk ondulatie vanuit een levensechte vrije-veld explosie is geïnspireerd door de Friedlander-functie, met een plotselinge stijging tot de piek overdruk gevolgd door een exponentiële afname7,8. Het bereik van extreme krachten en hun snelle tijdsverloop gezien in het geval van een ontploffing zijn meestal niet ervaren in niet-blast trauma's1,9. De piek overdruk, dat is de maximale druk van de golfvorm, en de duur van de positieve Golf worden verondersteld te zijn belangrijke bijdragen aan blast hersenletsel en deze hangen af van de explosieve lading en de afstand van de detonatie10, 11.
Het trauma dat de resultaten van een explosieve blast is geclassificeerd als vier afzonderlijke componenten, aangewezen als primaire, secundaire, tertiaire en quaternaire hoogoven letsel10,12,13,14. Elk van deze onderdelen wordt geassocieerd met specifieke mechanismen van letsel. Primaire hoogoven letsel het gevolg van de directe actie van de overdruk Golf op organen en weefsels2,13. Secundaire hoogoven letsel resultaten uit het effect van projectiel fragmenten, indringende en niet-penetrating veroorzaakt verwondingen2,15. Tertiaire blast de schade zich voordoet wanneer het lichaam van het slachtoffer tegen de grond of de omliggende objecten wordt verplaatst en wordt geassocieerd met versnelling/vertraging krachten1,10,13. Quaternaire hoogoven letsel beschrijft een heterogene groep van verwondingen die rechtstreeks verband houden met de explosie die niet worden gedekt door de eerste drie letsel mechanismen beschreven12,13. Het omvat (maar is niet beperkt tot) thermische schade, inademen van rook, straling, elektromagnetische golven en psychologische bijwerkingen13,15. Meeste blast-geassocieerde TBI resulteert rechtstreeks van de eerste drie mechanismen voor letsel, terwijl de quaternaire mechanismen van hoogoven letsel meestal geassocieerd met systemische schade13 zijn. De effecten van de krachten van de versnelling/vertraging (b.v., whiplash), blunt en doordringende traumatisch hersenletsel zijn uitvoerig bestudeerd met betrekking tot andere soorten TBI (bijvoorbeeldmotorvoertuig crasht, watervallen, ballistische letsel). Echter, de primaire blast overdruk Golf is uniek voor blast letsel en de gevolgen ervan voor hersenweefsel zijn veel minder goed begrepen16. De primaire hoogoven letsel mechanismen, geassocieerd met een overdruk Golf, zijn de eerste van de mechanische krachten om te communiceren met de hersenen.
Talrijke preklinische TBI modellen zijn ontwikkeld in de afgelopen decennia die onschatbare waarde zijn te begrijpen blast TBI mechanismen van letsel en pathofysiologie en onderzoeken van mogelijke nieuwe behandelingen, die anders zouden onmogelijk om te doen het uitsluitend instellen in de klinische17,18,19. Hoewel geen enkel preklinische model de complexiteit van klinische blast hersentrauma reproduceren kunt, meestal met verschillende preklinische TBI modellen verschillende aspecten van menselijke TBI repliceren. De schadelijke werking van de krachten die is gekoppeld aan een blast explosie kan worden bestudeerd, op zich of in combinatie in zowel in vitro als in vivo blast TBI modellen. In vitro modellen hebben het voordeel dat een strakke controle van de experimentele omgeving (fysiologische voorwaarden van weefsel en schade biomechanica), die vermindert biologische variabiliteit en verbetert de reproduceerbaarheid, de studie van het toelaat specifieke moleculaire cascades zonder de verstrengeling aanwezig in dierlijke modellen20. Ons doel was om het ontwikkelen van een in vitro model voor het onderzoek naar de effecten van primaire blast op hersenweefsel. We gericht op het ontwikkelen van een model met een supersonische shockwave met een vertegenwoordiger van de golfvorm Friedlander van de explosie van een vrije-veld zoals die geproduceerd door een geïmproviseerd explosief (IED).

```html
<table><tbody><tr><td>Geys balanced salt solution</td><td>Sigma UK</td><td>G9779</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma UK</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic/antimycotic</td><td>Sigma UK</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Minimum essential medium Eagle</td><td>Sigma UK</td><td>M4655</td><td></td></tr><tr><td>Hanks balanced salt solution</td><td>Sigma UK</td><td>H9269</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>Sigma UK</td><td>H1138</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma UK</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR Prolabo, Belgium</td><td>441476L</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma UK</td><td>S-0945</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture inserts</td><td>Millicell CM 30 mm low height Millipore</td><td>PICM ORG 50</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates</td><td>NUNC, Denmark</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>Sigma UK</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>Sterile polyethylene bags - Twirl'em sterile sample bags</td><td>Fisherbrand</td><td>01-002-30</td><td></td></tr><tr><td>Portex Avon Kwill Filling Tube 5" (127 mm)</td><td>Smiths Medical Supplies</td><td>E910</td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescence microscope</td><td>NIKON Eclipse 80i, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope objective</td><td>Nikon Plan UW magn. 2x, NA 0.06, WC 7.5 mm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope filter</td><td>Nikon G-2B (longpass emission)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mylar electrical insulating film, 304 mm x 200 mm x 0.023 mm</td><td>RS Components UK</td><td>785-0782</td><td></td></tr><tr><td>Pressure transducer</td><td>Dytran Instruments Inc.</td><td>2300V1</td><td></td></tr><tr><td>Tissue chopper</td><td>Mickle Laboratory Engineering Co., Guildford, Surrey, United Kingdom.</td><td>Mcllwain tissue chopper</td><td></td></tr><tr><td>Silicone elastomer</td><td>Dow Corning, USA</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Graphing & statistics software</td><td>GraphPad Software, USA</td><td>Prism 7.0</td><td></td></tr></tbody></table>
```

een roman in vitro model van traumatische hersenenverwonding blast

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

Traumatisch hersenletsel is een belangrijke oorzaak van sterfte en invaliditeit in militaire en civiele populaties. Blast traumatische hersenen letsel resultaten van de ontploffing van explosieven, echter de mechanismen die ten grondslag liggen aan de schade aan de hersenen als gevolg van blast overdruk blootstelling worden niet volledig begrepen en worden verondersteld te zijn uniek voor dit soort hersenletsel. Preklinische modellen zijn cruciale instrumenten die bijdragen tot een beter inzicht in hersenletsel blast-geïnduceerde. Een roman in vitro blast TBI model werd ontwikkeld met behulp van een buis open schok te simuleren van levensechte open-veld ontploffing golven gemodelleerd door de golfvorm Friedlander. C57BL/6N muis organotypic hippocampal segment culturen werden blootgesteld aan één schokgolven en de ontwikkeling van de schade werd gekenmerkt tot 72 h met behulp van propidium jodide, een gevestigde fluorescerende marker van celbeschadiging dat alleen cellen met doordringt cellulaire membranen in gevaar komen. Propidium jodide fluorescentie was significant hoger in de segmenten blootgesteld aan een blast Golf in vergelijking met sham segmenten gedurende de looptijd van het protocol. Het weefsel hersenletsel is zeer reproduceerbaar zijn en evenredig aan de piek overdruk van de schokgolf toegepast.

De buis van de schok gebruikt bij deze methode kan de generatie van overdruk transiënten die levensechte open veld explosies gemodelleerd door de Friedlander functie7,8te simuleren. Supersonische schokgolven met een snelheid van 440 m/s (Mach 1.3) werden verkregen (figuur 2A). De golfgegevens gemeld is van sensor 2, radiaal geplaatst aan het einde van de gedreven sectie van de schok-buis.
Met behulp van het protocol zoals hierboven beschreven, ontwikkelen organotypic hippocampal segment culturen blootgesteld aan een enkele schokgolf (figuur 2A) ernstig letsel gekwantificeerd aan de hand van propidium jodide, een zeer polaire fluorescerende kleurstof die alleen de cellen met dringt cellulaire membranen24,25 (figuur 2B, C) in gevaar komen.
Zelfs onder optimale omstandigheden, en consistent aan andere OHSC gepubliceerd modellen21,22, er is een laag niveau van achtergrond propidium jodide fluorescentie, gedeeltelijk vanwege geringe schade als gevolg van de inherente weefsel manipulaties ( zoals media wijzigingen tijdens de periode van de cultuur of de verwijdering uit de incubator voor imaging). Deze explosie TBI protocol omvat aanzienlijke manipulatie waarin de onderdompeling van de segmenten in medium binnen steriele zakken en een aanzienlijke mate van behandeling tijdens de schokgolf blootstelling protocol (bv., klemmen van de steriele zakken naar de frame met houder). Echter, als alle stappen zorgvuldig worden uitgevoerd, deze extra manipulatie heeft geen invloed op de onderliggende gezondheid van de OHSC zoals geen significante verschillen tussen een controlegroep van segmenten in de 6-Wells-platen te allen tijde bewaard werden gezien (dwz., de inserts waren niet ondergedompeld of behandeld) en de sham-groep, waaronder segmenten die werden ondergedompeld in steriele zakken geklemd aan de schok-buis (figuur 2B).
De twee schokgolven gekozen, op 50 kPa en 55 kPa piek overdruk, geproduceerd significant (p < 0,05 en p < 0,0001, respectievelijk) en reproduceerbare verwonding in vergelijking met de ongedeerd schijn plakjes op alle tijdstippen na de ontploffing blootstelling Protocol (figuur 2B) zonder dat enige schade aan de weefselkweek inserts of de steriele zakken. Om te bepalen van de gevoeligheid van het model aan kleine verschillen in piek-overdruk, besloten hebben we om waarden die met ~ 10 verschilden % te selecteren. Deze resultaten blijkt ook dat, zoals verwacht, de schade die voortvloeit uit 55 kPa hoger dan die na de schokgolf van een 50 kPa is.
De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaardafwijking van het gemiddelde. Betekenis werd beoordeeld met behulp van een 2-weg herhaalde maatregelen variantie-analyse met behulp van Holm-Sidak post hoc test. Factor 1 was groep (controle, veinzerij, blast) en factor 2 was tijd na de verwonding (-1 h, 24 h, 48 uur en 72 h), waar de factor 1 was de herhaalde factor. De aanpassing van de p -waarde voor meerdere vergelijkingen werd gebruikt. P -waarden van minder dan 0,05 werden genomen om aan te geven van een significant verschil tussen groepen. Statistische tests werden uitgevoerd met behulp van een softwarepakket grafieken en statistieken.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58400/58400fig1.jpg"> Figuur 1: schematische van de Schoktoestel voor de buis met de steriele zak houder frame. (A). de buis van de schok is een 3.8 m lang roestvrij-staal buis, gemaakt van 1,22 m lange driedelig, verbonden door pakkingen en flenzen, met een inwendige diameter van 59 mm. (B) inzet toont de dubbele stuitligging vergadering. Één of twee Mylar pessarium kunnen worden geklemd in de vergadering met zegel geboden door rubberen o-ringen. (C) steriele zak houder frame. Het lichaam van het frame bestaat uit twee metalen platen met een gecentreerde circulaire gat (59 mm doorsnede), dat wordt uitgelijnd met de schok buis uitlaat. Silicone-elastomeer twee dunne (4 mm) vellen zijn aangebracht tussen de twee metalen platen. Het doel van deze bladen is te bieden een zelfs en niet-glad oppervlak om klem de steriele zakken. De afstand tussen de zak en de uitlaat van de schok-buis is 7 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58400/58400fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58400/58400fig2.jpg"> Figuur 2: typische shockwave en de daaruit voortvloeiende schade met organotypic hippocampal slice culturen. (A) representatieve voorbeeld van schokgolf verkregen met behulp van 23 µm dik polyester film, 2.16 bar barstdruk 55 kPa piek overdruk, 0,4 ms positieve Golf duur, 10.1 kPa·ms impuls. Golfgegevens werden verkregen sensor 2 radiaal gemonteerd op de distale flens van de buis van de schok gedreven sectie. De snelheid van de schokgolf was 440 m/s (Mach 1.3). (B) de ontwikkeling van de schade is evenredig aan de intensiteit van de schokgolf. 50 kPa zowel 55 kPa piek overdruk schokgolven veroorzaakt ernstige schade die in het gehele protocol 72 h in vergelijking met de sham-groep ontwikkeld. De schade als gevolg van een 55 kPa piek overdruk Golf blootstelling was aanzienlijk hoger dan na 50 kPa op 48 uur en 72 h. Sham segmenten identiek werden getrakteerd op blast segmenten maar schok buis niet werd ontslagen. Controle segmenten werden onderhouden in 6 goed platen in een incubator zonder iedere manipulatie. Gemiddelde waarden van de staven en foutbalken zijn standaardfouten (n = 7, besturingselementen; n = 48, veinzerij; n = 30, blast 50 kPa; n = 51, blast 55 kPa; n = aantal segmenten, uit 6 aparte experimenten). * p < 0,05, *p < 0,0001 vergeleken met schijnvertoning. # p < 0,05, #p < 0.01 vergeleken met blast 55 kPa. (C) vertegenwoordiger propidium jodide fluorescentie beelden van organotypic plakjes van sham (ik), (ii) blast 50 kPa en (iii) blast 55 kPa groepen 72 uur na letsel. Het segment sham toont lage niveaus van fluorescentie, dwz., schade, en de explosie blootgestelde segmenten tonen hoge niveaus van diffuus letsel, meer uitgesproken op de 55 kPa piek overdruk blootgesteld slice (schaal bar = 500 µm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58400/58400fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Dit document beschrijft een nieuwe model van traumatische hersenenverwonding primaire blast. Een drukluchtremmen gedreven schok buis wordt gebruikt voor het blootstellen van in vitro hippocampal segment culturen van de muis om een enkele schokgolf. Dit is een eenvoudige en snelle protocol voor het genereren van een reproduceerbare hersenletsel met weefsel met een hoog debiet.

Een roman In Vitro Model van traumatische hersenenverwonding Blast

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van blast schadelijke traumatisch hersenletsel en kan worden gebruikt om neuroprotectieve drugs scherm voor het gebruik van meer complexe in Vivo modellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het gebruik maakt van een laboratoriuminstrument om in Vitro massa hersenweefsel bloot te stellen aan een schokgolf met behulp van een eenvoudige en hoge doorvoer protocol dat het mogelijk maakt het creëren van een reproduceerbare schade. Steek eerst steriele op maat gemaakte roestvrijstalen ringen in de putten van een zesputplaat.Voeg vervolgens voorverwarmd serumvrij experimenteel medium met propidiumjodide toe aan de putten, zodat het niveau van medium niet boven de inkeping van de ring komt. Breng de plaat een uur naar de couveuse om ervoor te zorgen dat het medium op 37 graden Celsius staat voordat de weefselkweekinserts worden overgedragen. Na een uur, overdracht weefsel cultuur inserts met organotypische plakjes van hun groei gerechten op de ringen in de zes put plaat.Maak een stip op de insert velg in de drie uur positie met een permanente marker pen te vergemakkelijken terug te keren van de inserts naar zijn oorspronkelijke positie, dan label elke zes goed plaat met een unieke naam en datum en maak een kaart van de putten van elke plaat, naamgeving elk goed met een letter en elk plakje in de put met een nummer, zodat elk segment heeft een unieke identificatie. Incubeer op 37 graden Celsius gedurende een uur om ervoor te zorgen dat de plakjes zijn op 37 graden Celsius vlak voor beeldvorming. Een uur na de overdracht naar experimenteel medium, beoordelen slice gezondheid door snel imaging elk segment individueel en sequentieel onder laag vermogen.Gebruik een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een geschikte excitatie en emissiefilter idealiter in een donkere kamer of een kamer met weinig licht. Houd het deksel op de plaat bij het beeldvorming. Aan de binnenkant van het deksel kan condensatie ontstaan.Als dit gebeurt, kort gebruik maken van een haardroder op de lage instelling aan de buitenkant van het deksel. Zorg ervoor dat de beeldomstandigheden identiek zijn op verschillende dagen en tussen experimenten. Bij baseline, gezonde plakjes tonen zeer weinig fluorescerende vlekken.Plakjes die gebieden met dichte rode vlekken vertonen, geven gecompromitteerde levensvatbaarheid aan en moeten worden uitgesloten van verdere analyse. Ter vergelijking, fluorescentie van de explosie gewonde slice op 72 uur wordt hier weergegeven. Onmiddellijk na beeldvorming, verwijder een weefsel cultuur insert uit de zes put plaat en zorgvuldig de overdracht van de insert naar een steriele polyethyleen zak met 20 milliliter van voorverwarmde experimentele medium bubbelde met 95%zuurstof en 5% kooldioxide.Verwijder voorzichtig eventuele luchtbellen en verzegel de steriele zak door de bovenkant te draaien en een plastic klem aan te brengen. Zorg ervoor dat elke steriele zak correct is gelabeld met de plaat en goed identificatie. Na het overbrengen van elke weefselkweek invoegen op een individuele steriele zak, plaats de zakken en de zes put platen met experimenteel medium in de 37 graden Celsius incubator.Na een uur, zorgvuldig pak de steriele zakken met de weefselcultuur inserts in plastic dozen in een thermische gereguleerde doos gevuld met het geïoniseerde water op 37 graden Celsius. Het water moet de organotypische plakjes op fysiologische temperatuur houden gedurende het protocol voor blootstelling aan schokgolven. Draag stalen laarzen, een laboratoriumjas en handschoenen tijdens de voorbereiding van de schokbuis en de blootstelling aan schokgolven.Gebruik een loslegstaaf om het steriele zakhouderframe vast te bouten aan de schokbuis distale flens die ervoor zorgt dat het centrale gat is uitgelijnd met de schokbuisuitlaat. Sensor één, een drukomvormer, bevindt zich in het middelste deel van de aangedreven sectie en sensor twee bevindt zich in de distale flens van de schokbuis. Sluit deze druktransducers aan op een oscilloscoop via een stroombron en zet de oscilloscoop aan.Zorg ervoor dat de solenoïde klep en de stroomregeling van de schokbuis gesloten zijn, open vervolgens de externe persluchtlijn en laad de solenoïde klep op tot 2,5 bar. Open de persluchtcilinder veiligheidsklep en open langzaam de drukregelaar om de druk te verhogen tot ongeveer vijf bar. Bereid vervolgens diafragma's door 23 micron dikke polyester platen in 10 bij 10 centimeter vierkanten te snijden.Bereid handvatten van autoclave tape en plak ze aan de boven-en onderkant van elk diafragma. Plaats een diafragma in de breuk en zorg ervoor dat ze gecentreerd zijn. Klem vervolgens het middenrif met vier M24 bouten en moeren.Mode ze sequentieel in een diagonaal symmetrische manier, terwijl ervoor te zorgen dat de diafragma's zijn rimpel vrij. Klem een steriele zak in een verticale positie op het houderframe om ervoor te zorgen dat het oppervlak van de weefselkweek invoegen met de organotypic hippocampal plakjes is gericht op de schokbuis uitlaat en de weefselcultuur insert is gecentreerd in de steriele zak. Voor de dubbele diafragmaconfiguratie is de barstende druk afhankelijk van het gasdrukverschil tussen de bestuurder en de dubbele breukkamer.Daarom wordt de dubbele inbreukveiligheidsklep handmatig geopend zodra de doeldruk is bereikt. Zet op oor verdedigers en veiligheidsbril als niet al versleten. Sluit de solenoïde klep.Schakel de huidige bronkrachtcentrale in om de shockwavegegevens te verkrijgen. Manipuleer de stroomregelknop op het bedieningspaneel van de schokbuis om het bestuurdersvolumegedeelte van de schokbuis langzaam onder druk te zetten voor een enkele diafragmaconfiguratie of zowel de sectie van het bestuurdersvolume als het dubbele breukgedeelte van de schokbuis voor een dubbele diafragmaconfiguratie. Zodra het membraan scheurt, snel gesloten de persluchtstroom met behulp van de stroomknop en open de solenoïde klep.De ideale combinatie van schokgolfparameters moet voldoende zijn om weefselletsel te veroorzaken, maar niet zo hoog dat het weefselcultuur insert of steriele zakvervorming of breuk veroorzaakt. Nadat u elk segment aan één schokbuisgolf hebt blootgesteld, brengt u het onmiddellijk terug naar de thermisch geregelde doos. Neem vervolgens de volgende steriele zak uit de doos en klem deze vast op het houderframe.Voer de schakelaar soepel en snel uit om koeling van het experimentele medium te voorkomen, aangezien temperaturen onder de 37 de ontwikkeling van de schade kunnen verstoren. Zodra alle weefselkweek inserts zijn blootgesteld aan een shockwave of sham protocol, terug de weefselcultuur inserts om hun putten in u originele zes put plaat en terug te keren naar de incubator tot verdere beeldvorming. Dit beeld is een representatief voorbeeld van een schokgolf verkregen met behulp van 23 micron dikke polyester film met 55 kilopascal piek overdruk.De schokgolfsnelheid was 440 meter per seconde. Zowel 50 als 55 kilopascal piek overdruk schokgolven veroorzaakt aanzienlijke schade die ontwikkeld in de 72 uur protocol in vergelijking met de sham groep. De schade als gevolg van een 55 kilopascal piek overdruk golf blootstelling was aanzienlijk hoger dan na 50 kilopascal op 48 uur en 72 uur, waaruit blijkt dat de ontwikkeling van de schade evenredig is aan de intensiteit van de schokgolf.Dit beeld toont een plak 72 uren na een 50 kilopascal ontploffing. Een hoog niveau van diffuus letsel is zichtbaar. Letsel is meer uitgesproken na een 55 kilopascal piek overdruk blast.Deze propidium jodide fluorescentie afbeelding toont een organotypic slice van een schijnexperiment. De schijnschijf toont lage niveaus van fluorescentie. Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om een aseptische techniek te handhaven in de hele om besmetting van het weefsel te voorkomen en om weefselculturen snel te manipuleren, maar zeer voorzichtig om onbedoelde celschade te voorkomen.Na deze procedure, andere methoden zoals immunofluorescentie vlekken kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals wat zijn de mechanismen van celdood betrokken bij blast geïnduceerd traumatisch hersenletsel? Deze techniek maakt een hoge doorvoertest voor onderzoekers op het gebied van neuroprotectie om het potentieel voor drugs te verkennen om de verspreiding van celdood en hersenweefsel na blootstelling aan blast shockgolven te voorkomen.

a-novel-in-vitro-model-of-blast-traumatic-brain-injury

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In this video, a shock tube device is used to generate a shockwave by rupturing a polymer diaphragm through controlled pressurization. The shockwave impacts brain slices contained in a secured bag, inducing traumatic injury to the brain slice.

Inducing Traumatic Injury in a Brain Slice Using a Shock Tube Device

In vitro traumatisch hersenletsel modellen gewerkt te reproduceren in vivo hersenen vervorming. Stretch-geïnduceerde schade is werkzaam voor astrocyten, neuronen, gliacellen, aorta, en de hersenen endotheelcellen. Echter, maakt gebruik van ons systeem een bloed-hersenbarrière (BBB) ​​model dat eigenschappen die een legitiem model van de BBB om een te vestigen in vitro TBI model bezit.

Strekken in Brain microvasculaire endotheelcellen (CEND) als een<em&gt; In Vitro</em&gt; Traumatisch Hersenletsel Model van de Blood Brain Barrier

Acuut hersenletsel is een ernstige verwonding die geen adequate behandeling tot op heden. Multifoton microscopie maakt het bestuderen van lengterichting van het proces van acuut hersenletsel ontwikkeling en indringende therapeutische strategieën bij knaagdieren. Twee modellen van acuut hersentrauma bestudeerd met in vivo twee-foton beeldvorming van de hersenen worden gedemonstreerd in dit protocol.

Acute Brain Trauma in Muizen gevolgd door Longitudinale Twee-foton Imaging

Traumatische hersenverwondingen (THV) blijven een ernstig gezondheidsprobleem. Met behulp van het gecontroleerde corticale impactchirurgie-model kan onderzoek worden gedaan naar de effecten van THV en mogelijke behandelmethoden.

Gecontroleerde Corticale Impact Model voor traumatisch hersenletsel

De gewijzigde gewichtsdruppeltechniek is een eenvoudige, kosteneffectieve procedure die wordt gebruikt voor het induceren van milde traumatische hersenschade bij jonge ratten. Deze nieuwe techniek produceert klinisch relevante symptomen die de studie van milde traumatische hersenschade (mTBI) en hersenschudding zullen bevorderen.

A Novel model van Mild Traumatic Brain Injury voor jonge ratten

Hier beschrijven we een nieuwe aanpak om traumatisch hersenletsel in Drosophila melanogaster te veroorzaken . Onze methode heeft het voordeel om herhaalde effecten te leveren met instelbare sterkte aan het hoofd alleen. Verdere verkenning van het ongewervelde systeem zal helpen bij het verlichten van de pathogenese van chronische traumatische encefalopathie.

Een nieuwe methode om chronische traumatische encefalopathie te modelleren in<em&gt; Drosophila</em

Atleten absorberen jaarlijks enkele honderden milde traumatische hersenletsels (mTBI) / hersenschudden; Het gevolg van deze op de hersenen is echter slecht begrepen. Daarom, een diermodel van enkelvoudige en herhalende mTBI die consequent repliceren klinisch relevante symptomen, biedt de middelen om de studie van mTBI en hersenschudding te bevorderen.

Een muismodel van een- en herhalende milde traumatische hersenbeschadiging

Neurotransmitter wijziging is een mechanisme van neurale disfunctie die optreedt na hersenschudding en draagt bij aan de soms catastrofale gevolgen op lange termijn. Dit rat model combineert microdialyse, waardoor in vivo neurotransmitter kwantificering, met een gewicht-druppel techniek die snelle acceleratie en vertraging van het hoofd en de romp, een belangrijke factor van menselijke craniocerebrale trauma.

Een roman en translationeel rat model van hersenschudding combineren van kracht en rotatie met in vivo cerebrale Microdialyse

Hier beschrijven we een protocol voor de inductie van muriene traumatisch hersenletsel via een open-Head gecontroleerd corticale impact.

Murine model van gecontroleerde corticale impact voor de inductie van traumatisch hersenletsel

We presenteren hier een protocol van een explosiegolfmodel voor knaagdieren om neurobiologische en pathofysiologische effecten van mild tot matig traumatisch hersenletsel te onderzoeken. We hebben een gasgestuurde, bench-top opstelling opgezet die is uitgerust met druksensoren die een betrouwbare en reproduceerbare generatie van door ontploffing geïnduceerd mild tot matig traumatisch hersenletsel mogelijk maken.

Blast Wave-model met lage intensiteit voor preklinische beoordeling van licht traumatisch hersenletsel met gesloten hoofd bij knaagdieren

Dit protocol beschrijft een op maat gemaakt luchtdruksysteem dat is ontworpen om verwondingen aan het centrale zenuwstelsel (CZS) van een gesloten systeem bij muizen te induceren, inclusief oculaire, hersen- en ruggenmergtrauma's. Het doel van dit protocol is om een kader te bieden voor onderzoekers om het systeem gemakkelijk aan te passen en uit te breiden voor hun unieke CZS-traumastudies.

Systeem voor focaal, gesloten systeem letsel aan het centrale zenuwstelsel

Leer een nieuw in vitro model voor traumatisch hersenletsel door schokgolven op muizenhippocampusslices toe te passen. Deze eenvoudige, reproduceerbare methode ondersteunt screening van neuroprotectieve geneesmiddelen.

Een roman In Vitro Model van traumatische hersenenverwonding Blast

Meer video's verkennen