Name: Isolatie van volwassen ruggenmerg kernen voor Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Leer de isolatie van kernen uit volwassen ruggenmerg voor single-nucleus RNA-sequencing. Deze methode maakt transcriptoomanalyse van moeilijk te dissociëren weefsels mogelijk en helpt onderzoekers bij het bestuderen van ziekte- en letselreacties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de intramurale programma van NINDS (1 ZIA NS003153 02) en NIDCD (1 ZIA DC000059 18). Wij danken L. Li en C.I. Dobrott voor hun technische ondersteuning en nuttige discussies en C. Kathe voor de herziening van het manuscript.

Alle dierlijke werk werd uitgevoerd overeenkomstig een protocol goedgekeurd door het National Institute of Neurological Disorders beroerte Animal Care en gebruik Comité. Evenwichtig monsters van mannelijke en vrouwelijke ICR/CD-1 wild-type muizen, tussen 8 en 12 weken oud, werden gebruikt voor alle experimenten. Muizen moeten worden behandeld in overeenstemming met lokale institutionele Animal Care en gebruik Comité richtsnoeren.
1. voorbereiding van de materialen en Buffers
<ol><li>Bereiden alle buffers de dag van gebruik en vooraf chill op ijs (Zie tabel 1).<ol>
<li>Als gebruikt wasmiddel-mechanische lysis, bereiden de wasmiddel lysis-buffermengsel (> 500 μL per monster), lage sacharose buffer (> 6 mL per monster), sacharose dichtheid buffer (> 12,5 mL per monster) en de resuspensie oplossing (> 1 mL).</li>
		<li>Als gebruikt hypotone-mechanische lysis, bereiden de hypotone lysis-buffermengsel (> 5 mL per monster) HEB medium (> 5 mL per monster), lage sacharose buffer (> 3 mL per monster), sacharose dichtheid buffer (> 12,5 mL per monster), en de resuspensie oplossing (> 1 mL).</li>
		<li>25 μL van dithiothreitol (DTT) aan 25 mL van de lage sacharose buffer en een ander 25 μL van DTT tot 25 mL van de dichtheid van de kleurovergang buffer van sacharose net voordat het protocol toevoegen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Betrekking hebben op het ontleden oppervlak met aluminium-folie om te minimaliseren van verontreiniging van het monster met vezels van papieren handdoeken of bench beschermers, die microfluidic kanalen gebruikt voor het vastleggen van enkele kernen kunnen verstoppen.</li>
	<li>Spray ontleden tools en Bank ruimte met een RNase decontaminatie oplossing. Bovendien, de binnenkant van de Dounce homogenizer buis (als gebruikt wasmiddel-mechanische cellysis) en Oak Ridge buis te spuiten met een RNase decontaminatie oplossing. De Dounce en Oak Ridge buis met ultrazuiver, RNase-gratis water spoelen.</li>
	<li>Chill vooraf alle collectie buizen (50 mL kegelvormig, Oak Ridge) en Dounce homogenizer buizen op ijs.</li>
	<li>Brand Pools een reeks van Pasteur pipetten (als hypotone-mechanische cellysis gebruikt).</li>
</ol>2. voorbereiding van het ruggenmerg
<ol><li>Als met behulp van vers weefsel, euthanaseren de muis bij CO2 inademing. Spray na euthanasie, de vacht van de muis met 70% ethanol tot een minimum beperken van haar besmetting in de steekproef.</li>
	<li>Decapitate de muis met een scherpe, RNase-gratis chirurgische schaar. Vervolgens voorzichtig het opheffen van de abdominale huid met een tang en een sneetje langs de lengte van het lichaam bloot de binnenorganen te maken.</li>
	<li>Verwijderen van de ingewanden de muis door te trekken van de innerlijke organen uit de lichaamsholte met pincet. Gebruik geen papieren handdoeken om het gebied schoon te maken of te verwijderen van organen zoals dit verontreinigingen kan invoeren. Met behulp van schaar, sneed de wervelkolom tussen de L2 en L3 wervelkolom wervels. Opmerking: Met de praktijk, deze stap kan worden bereikt in minder dan 30 seconden.<ol>
<li>Passen om uit te werpen het ruggenmerg, een 3 mL injectiespuit met ijskoude PBS met een 25 G ¼ inch naald. Plaats de punt van de naald in het sacrale einde van de wervelkolom. Gebruik twee vingers om te knijpen van de wervels te maken van een goede afdichting rond de punt van de naald en druk naar beneden op de plunjer rostrally uitwerpen van het ruggenmerg. Plaats het ruggenmerg in een petrischaal met ijskoude PBS.</li>
		<li>Op dit moment bevriezen van het weefsel en opslaan bij-80 ° C of onmiddellijk voor wasmiddel-mechanische (stap 3) of hypotone-mechanische lysis van de (stap 4) gebruiken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Als met behulp van bevroren weefsel, onderhoudt het weefsel op droog ijs, gaat u verder met wasmiddel-mechanische (stap 3) of hypotone-mechanische lysis van de (stap 4).</li>
</ol>3. wasmiddel-mechanische cellysis
<ol><li>Plaats het lumbale ruggenmerg in een vooraf gekoeld Dounce homogenizer en voeg 500 mL pre gekoeld wasmiddel lysis-buffermengsel. Opmerking: Een muis lumbale ruggemerg is 325.5 mg ± 63.9 mg standaardfout van het gemiddelde (SEM, N = 4). 50 mg-1.5 g van weefsel kan met succes worden gebruikt.</li>
	<li>Dounce met 5 lijnen van stamper een ('losse' stamper), dan 5-10 slagen van stamper B ('strak' stamper). Vermijd opheffing van de homogenizer uit de lysis oplossing tussen lijnen en te voorkomen dat de invoering van de bubbels.</li>
	<li>Plaats een 40 mm zeef boven een vooraf gekoeld 50 mL conische buis en prewet met 1 mL lage sacharose buffer.</li>
	<li>1 mL van lage sacharose buffer toevoegen aan de homogenizer van de Dounce met de ruwe kernen in de lysis-buffermengsel en meng zachtjes door pipetteren 2 tot 3 keer.</li>
	<li>De ruwe kernen prep voorbij door de zeef van 40 mm in de vooraf gekoeld 50 mL conische buis.</li>
	<li>Een extra 1 mL lage sacharose buffer voorbij de zeef van 40 mm, waardoor het eindvolume tot 3 mL van de lage sacharose buffer en 500 mL van de lysis-buffermengsel.</li>
	<li>Herhaal stap 3.1 – 3.6 als het combineren van meerdere koorden, bundelen in de dezelfde conische buis.</li>
	<li>Centrifugeer het monster bij 3200 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Zodra het centrifugeren voltooid is, decanteren in de bovendrijvende substantie. Ga verder met stap 5.</li>
</ol>4. hypotone-mechanische cellysis
<ol><li>Plaats het lumbale ruggenmerg in 5 mL van de hypotone lysis-buffermengsel in een schotel weefselkweek. Met het botte uiteinde van voorjaar schaar bisect van het ruggenmerg en gebruikt u vervolgens voorjaar schaar te knippen het snoer in stukken van 3-4 mm, maar doen geen blad. Opmerking: 50 mg-1.5 g van weefsel kan met succes worden gebruikt.</li>
	<li>Incubeer op het ijs gedurende 15 minuten, 2 tot 3 keer zwenken.</li>
	<li>Voeg 5 mL van HEB medium om te verdunnen de hypotone lysis-buffermengsel.</li>
	<li>Triturate het weefsel 10 keer met een serologische 5 mL-Pipet, of totdat alle stukken van het weefsel soepel doorlopen naar de opening van de pipet.</li>
	<li>Triturate met een reeks van drie brand-gepolijst Pasteur pipetten met geleidelijk smaller diameters (~ 900-600 mm).<ol>
<li>Voor elke Pipet, triturate 5 - 15 keer, toestaan dat weefsel te regelen, verwijderen van 1-2 mL van het supernatans met gedissocieerde kernen en voorbij een 40 mm zeef in een conische buis van vooraf gekoeld 50 mL.</li>
		<li>Na verpulvering met de kleinste middelgrote Pasteur Pipet, zien erop toe dat de homogenaat vlot door het uiteinde van de pipet stroomt. De resterende oplossing voorbij door de zeef van 40 mm in de conische buis van 50 mL. Opmerking: Het totale aantal triturations kan worden aangepast als gewenste. De hersenvliezen van het ruggenmerg muis zal blijven, maar het is belangrijk dat de triturate zichtbare stukjes van het ruggenmerg. De resterende homogenaat voorbij de 40 m-zeef. Vermijd invoering van bubbels tijdens verpulvering.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugeer het gefilterde monster bij 1.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Zodra het centrifugeren voltooid is, decanteren en verwijder het supernatant. Ga verder met stap 5.</li>
</ol>5. de homogenisering en Sucrose dichtheid verloop
<ol><li>Na stap 3 of 4, resuspendeer de pellet met behulp van 3 mL lage sacharose buffer. Zachtjes wervelen om te verwijderen van de pellet uit de muur om de resuspensie. Laat het monster zitten op het ijs gedurende 2 minuten en spoel de suspensie tot een koker Oak Ridge.</li>
	<li>Met behulp van de homogenizer op 1 instelt, meng de kernen in lage sacharose buffer voor 15 – 30 s, houden het monster op het ijs. Opmerking: Gebruik 15 s als een lumbale ruggemerg of 30 s als samengevoegde monsters of een hele ruggenmerg.</li>
	<li>Met behulp van een serologische precisiepipet, laag 12,5 mL dichtheid sacharose buffer onder de lage sacharose buffer homogenaat, verzorgen als u niet wilt maken van een zeepbel die de dichtheid lagen verstoort.</li>
	<li>Centrifugeer de buizen bij 3200 x g gedurende 20 min bij 4 ° C.</li>
	<li>Zodra het centrifugeren voltooid is, onmiddellijk decanteren in de bovendrijvende substantie in een flicking beweging. Opmerking: Een restvolume (minder dan 400 mL) van sacharose buffer kan worden verwijderd indien gewenst een lager volume en schoner eindmonster te produceren, maar deze restvolume bevat kernen en kan worden bewaard om te maximaliseren van de opbrengst van de kernen.</li>
	<li>Gebruik van 100 mL - 1 mL van resuspensie oplossing resuspendeer de kernen die nog op de muur. Vermijd de myeline 'frown' die bij de voorbereiding van wasmiddel gebaseerde opgeslagen blijft.</li>
	<li>Filtreer de kernen door een zeef 30 – 35 mm-poriegrootte en verzamelen in een vooraf gekoeld buis.</li>
	<li>Bepaal de kernen opleveren met behulp van een hemocytometer om te tellen kernen onder een 10 X doelstelling. Opmerking: Trypan blauw kan worden toegevoegd aan het visualiseren van kernen, die moeten worden in blauw weergegeven. Noteer de hoeveelheid cellulaire puin.</li>
	<li>Ga verder met stap 6 of 7.</li>
</ol>6. massively Parallel snRNA-Sequencing: academisch Platform7
<ol><li>Uitvoeren van de sequencing van massaal parallelle snRNA (b.v., Drop-Seq) zoals eerder beschreven methode7 met de volgende wijzigingen:4<ol>
<li>Aanpassen kernen om een eindconcentratie van 225 kernen per mL.</li>
		<li>Bereiden barcoded kralen bij een concentratie van 250 kralen per mL.</li>
		<li>De lysis-buffermengsel met 0,7% sarkosyl voor te bereiden.</li>
		<li>Aanpassen van de stroomsnelheid tot 35 mL per min voor kralen, 35 mL per min. voor kernen en 200 mL per min. voor olie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. massively parallel snRNA-sequencing: commercieel Platform26
<ol><li>Uitvoeren van massaal parallelle snRNA-sequencing met behulp van de commerciële platform (bijvoorbeeld, chroom Single Cell gen expressie oplossing) producten volgens de fabrikant instructies26 met de volgende wijziging:<ol>
<li>Na omgekeerde-transcriptie, voeg toe een extra PCR cyclus aan het berekende aantal cycli voor versterking van cDNA op basis van het herstel van de gerichte cel ter compensatie van de verminderde cDNA van kernen in vergelijking met cellen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li>
<li>Hu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+Cell-Type+Composition+and+Activity-Dependent+Transcriptional+State+in+Mammalian+Brains+by+Massively+Parallel+Single-Nucleus+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq.</a> Molecular Cell. 68 (5), 1006-1015 (2017).</li>
<li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+Activated+Cell+Populations+Using+Single-Cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li>
<li>Sathyamurthy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+Parallel+Single+Nucleus+Transcriptional+Profiling+Defines+Spinal+Cord+Neurons+and+Their+Activity+during+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Massively Parallel Single Nucleus Transcriptional Profiling Defines Spinal Cord Neurons and Their Activity during Behavior.</a> Cell Reports. 22 (8), 2216-2225 (2018).</li>
<li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).</li>
<li>Campbell, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+census+of+arcuate+hypothalamus+and+median+eminence+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A molecular census of arcuate hypothalamus and median eminence cell types.</a> Nature Neuroscience. 20 (3), 484-496 (2017).</li>
<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+RNA-Seq+Reveals+Hypothalamic+Cell+Diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Single-Cell RNA-Seq Reveals Hypothalamic Cell Diversity.</a> Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).</li>
<li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343 (6172), 776-779 (2014).</li>
<li>Li, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatosensory+neuron+types+identified+by+high-coverage+single-cell+RNA-sequencing+and+functional+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity.</a> Cell Research. 26 (8), 967(2016).</li>
<li>Shin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+RNA-Seq+with+Waterfall+Reveals+Molecular+Cascades+underlying+Adult+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis.</a> Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).</li>
<li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).</li>
<li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).</li>
<li>Villani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+reveals+new+types+of+human+blood+dendritic+cells%2C+monocytes%2C+and+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors.</a> Science. 356 (6335), (2017).</li>
<li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).</li>
<li>Lacar, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+RNA-seq+of+single+neurons+reveals+molecular+signatures+of+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation.</a> Nature Communications. 7, 11022(2016).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li>
<li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.pnas.org/content/110/49/19802.short">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li>
<li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).</li>
<li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+nuclei+isolation+from+human+postmortem+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).</li>
<li>Bergmann, O., Jovinge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cardiomyocyte+nuclei+from+post-mortem+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li>
<li>Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Filtration-based+Method+of+Preparing+High-quality+Nuclei+from+Cross-linked+Skeletal+Muscle+for+Chromatin+Immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).</li>
<li>Halder, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+changes+in+plasticity+genes+accompany+the+formation+and+maintenance+of+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">DNA methylation changes in plasticity genes accompany the formation and maintenance of memory.</a> Nature Neuroscience. 19 (1), 102-110 (2016).</li>
<li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-nucleus+RNA-seq+with+DroNc-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq.</a> Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).</li>
<li>10X Genomics. Sample Preparation Demonstrated Protocols: Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing</a> (2018).</li>
<li>10X Genomics. <a target="_blank" href="https://www.salk.edu/wp-content/uploads/2017/11/10XUserGuide.pdf">Single Cell 3' Reagent Kits v2 User Guide</a>. , (2018).</li>
<li>Fu, Y., Rusznak, Z., Herculano-Houzel, S., Watson, C., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+composition+characterizing+postnatal+development+and+maturation+of+the+mouse+brain+and+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">Cellular composition characterizing postnatal development and maturation of the mouse brain and spinal cord.</a> Brain Structure and Function. 218 (5), 1337-1354 (2013).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+strategy+for+single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+confirms+accuracy+in+predicted+cell-type+expression+from+nuclear+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6031(2017).</li>
<li>Bakken, T. E. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/early/2017/12/25/239749">Equivalent high-resolution identification of neuronal cell types with single-nucleus and single-cell RNA-sequencing.</a> bioRxiv. , (2018).</li>
<li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Div-Seq%3A+Single-nucleus+RNA-Seq+reveals+dynamics+of+rare+adult+newborn+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons.</a> Science. 353 (6302), 925-928 (2016).</li>
</ol>

We hebben geen conflicten van belang om te vermelden.

Het uiteindelijke doel van dit protocol is te isoleren van de kernen met kwalitatief hoogwaardige RNA voor downstream transcriptionele analyse. We snRNA-Seq methoden aangepast om alle van de celtypes in het ruggenmerg profile. Aanvankelijk vonden we dat typische cel dissociatie methoden ineffectief voor eencellige RNA sequencing, waren zoals ruggenmerg neuronen bijzonder kwetsbaar voor de dood van de cel zijn. Bovendien veroorzaken cel dissociatie methoden expressie van genen die diverse activiteiten - en stressrespons d...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58413/isolation-adult-spinal-cord-nuclei-for-massively-parallel-single">Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing</a>. The Protocol section was updated.
Step 3.1 was updated from:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 mL pre-chilled detergent lysis buffer.
to:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 &#956;L pre-chilled detergent lysis buffer.
Step 3.6 was updated from:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 mL of the lysis buffer.
to:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 &#956;L of the lysis buffer.
Step 5.5 was updated from:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion. 
NOTE: A residual volume (less than 400 mL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
to:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion. 
NOTE: A residual volume (less than 400 &#956;L) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
Step 5.6 was updated from:
Using 100 mL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin &#8216;frown&#8217; that remains with the detergent-based preparation.
to:
Using 100 &#956;L - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin &#8216;frown&#8217; that remains with the detergent-based preparation.
Steps 6.1.1 - 6.1.4 were&#160;updated from:
<ol>
	<li>Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per mL.</li>
	<li>Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per mL.</li>
	<li>Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.</li>
	<li>Adjust the flow rates to 35 mL per min for beads, 35 mL per min for nuclei, and 200 mL per min for oil.</li>
</ol>
to:
<ol>
	<li>Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per &#956;L.</li>
	<li>Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per &#956;L.</li>
	<li>Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.</li>
	<li>Adjust the flow rates to 35 &#956;L per min for beads, 35 &#956;L per min for nuclei, and 200 &#956;L per min for oil.</li>
</ol>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58413/isolation-adult-spinal-cord-nuclei-for-massively-parallel-single">Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing</a>. The Protocol section was updated.

Erratum: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Het zenuwstelsel bestaat uit heterogene groepen van cellen die een veelzijdige elektrofysiologische, morfologische en biochemische eigenschappen worden weergegeven. Terwijl de bulk RNA sequencing is nuttig voor het bepalen van weefsel bestrijkende veranderingen in de genexpressie onder verschillende omstandigheden, het verzet zich tegen de detectie van transcriptionele veranderingen op het niveau van één cel. Recente vooruitgang in de eencellige transcriptionele analyse de indeling van heterogene cellen in functionele groepen op basis van hun moleculaire repertoire hebt ingeschakeld en zelfs kunnen worden benut voor het detecteren van sets van neuronen die had onlangs actief geweest. 1 , 2 , 3 , 4 de afgelopen tien jaar heeft de ontwikkeling van eencellige RNA sequencing (scRNA-Seq) de studie van genexpressie in afzonderlijke cellen, die een mening wordt celtype diversiteit. 5
De opkomst van schaalbare benaderingen zoals Seq-massively parallel scRNA, heeft verstrekt platformen op volgorde heterogene weefsels, met inbegrip van vele regio's in het centrale zenuwstelsel. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 echter eencellige dissociatie methoden kunnen leiden tot de dood van de cel, evenals de experimentele wijzigingen in genexpressie. 16 recent werk heeft aangepast methodes van eencellige sequencing zodat behoud van endogene transcriptionele profielen. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 deze strategieën zijn bijzonder geschikt voor het opsporen van onmiddellijke vroege (IEG) genexpressie na zintuiglijke prikkel of gedrag. 3 , 4 In de toekomst deze strategie kan ook worden gebruikt om dynamische veranderingen in weefsels in ziekte staten of in reactie op spanning te bestuderen. Van deze methoden, één kern RNA sequencing (snRNA-Seq) is een veelbelovende aanpak die geen stress-inducerende cel dissociatie en kan gebruikt worden op de moeilijk te distantiëren van weefsel (zoals het ruggenmerg), evenals bevroren weefsel. 4 , 17 , 18 , 19 aangepast uit de vorige kernen isolatie methoden,20,21,22,23,25 snRNA-Seq meestal maakt gebruik van verstoring van de snelle weefsel en cel Lysis onder koude omstandigheden, centrifugeren en scheiding van de kernen van cellulaire puin. 4 kernen kunnen worden geïsoleerd voor de downstream sequencing van de volgende generatie op meerdere microfluidic druppel inkapseling platformen. 4 , 7 , 24 , 25 deze methode zorgt voor een momentopname van de transcriptionele activiteit van duizenden cellen op een moment.
Er zijn meerdere strategieën voor het vrijgeven van de kernen van cellen voor isolatie en sequencing, elk met hun eigen voor- en nadelen. Hier, we beschrijven en vergelijken van twee protocollen om te schakelen van de isolatie van de kernen van de volwassen ruggenmerg voor de downstream massively parallel snRNA-Seq: wasmiddel-mechanische lysis en hypotone-mechanische lysis. Wasmiddel-mechanische lysis biedt volledige weefsel verstoring en een hogere uiteindelijke opbrengst van kernen. Hypotone mechanische-lysis omvat een beheersbare mate van verstoring van de weefsel, een mogelijkheid voor het selecteren van een evenwicht tussen de hoeveelheid en de zuiverheid van het definitieve nucleaire rendement bieden. Deze benaderingen bieden vergelijkbare RNA opbrengst, gedetecteerde aantal genen per celkern, en celtype profilering en ook kunnen zowel worden gebruikt met succes voor snRNA-Seq.

<table><tbody><tr><td>Sucrose</td><td>Invitrogen</td><td>15503-022</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES (pH = 8.0)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td></td></tr><tr><td>MgAc</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5661-50G</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA (pH = 8.0)</td><td>Corning</td><td>MT-46034CI</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10197777001</td><td>Add DTT just prior to use</td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Crystalgen</td><td>221-238-10</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl (pH = 7.4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2194</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59222C</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate-A</td><td>Gibco</td><td>A12475-01</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>B27 (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Crystalgen</td><td>221-133-10</td><td></td></tr><tr><td>0.04% BSA</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>0.2 U/&mu;L RNAse Inhibitor</td><td>Lucigen</td><td>30281-1</td><td></td></tr><tr><td>Oak Ridge Centrifuge Tube</td><td>Thermo Scientific</td><td>3118-0050</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-8B</td><td></td></tr><tr><td>Glass Tissue Dounce (2 mL)</td><td>Kimble</td><td>885303-002</td><td></td></tr><tr><td>Glass large clearance pestle</td><td>Kimble</td><td>885301-0002</td><td></td></tr><tr><td>Glass small clearance pestle</td><td>Kimble</td><td>885302-002</td><td></td></tr><tr><td>T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer</td><td>IKA</td><td>3737001</td><td></td></tr><tr><td>Dispersing tool (S 10 N &ndash; 5G)</td><td>IKA</td><td>3304000</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu;m cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers, 30 &mu;m</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>Conical tubes</td><td>Denville Scientific</td><td>1000799</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR Centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004505</td><td></td></tr><tr><td>Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75003698</td><td></td></tr><tr><td>Sterological Pipettes: 5 mL, 10 mL</td><td>Denville Scientific</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Daigger Scientific</td><td>EF16034F</td><td></td></tr><tr><td>Chemgenes Barcoding Beads</td><td>Chemgenes</td><td>Macosko-2011-10</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 &mu;m)</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo Astrios Cell Sorter</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td></td></tr><tr><td>Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns</td><td>10X Genomics</td><td>120262</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Single Cell 3’&rsquo; Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns</td><td>10X Genomics</td><td>120267</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns</td><td>10X Genomics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Dish (60 mm x 15 mm)</td><td>Corning</td><td>353002</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie van volwassen ruggenmerg kernen voor massively parallel single-nucleus rna sequencing

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Een afzonderlijke cel genexpressie indringende maakt de identificatie van celtype en cel staat. Eencellige RNA sequencing heeft ontpopt als een krachtig hulpmiddel voor de studie van transcriptionele profielen van cellen, met name in heterogene weefsels zoals het centrale zenuwstelsel. Echter, dissociatie methoden die nodig zijn voor het eencellige rangschikken kunnen leiden tot experimentele wijzigingen in de gen-expressie en cel dood. Bovendien, deze methoden zijn over het algemeen beperkt aan verse weefsel, waarbinnen de studies over de archivering en bio-bank materiaal te beperken. Enkele kern RNA sequencing (snRNA-Seq) is een aantrekkelijk alternatief voor transcriptionele studies, gezien het feit dat het nauwkeurig identificeert celtypes, vergunningen van de studie van weefsel dat is bevroren of moeilijk te distantiëren, en vermindert dissociatie-geïnduceerde transcriptie. Hier presenteren we een protocol hoge gegevensdoorvoer voor snelle Isolatievan kernen voor downstream snRNA-Seq. Deze methode maakt Isolatievan kernen van vers of bevroren ruggenmerg monsters en kan gecombineerd worden met twee massaal parallelle druppel inkapseling platforms.

Hier, wij isolatie van kernen van de lumbale ruggemerg van volwassen muis voor downstream massaal parallelle RNA sequencing uitgevoerd. Het protocol betrokken drie hoofdonderdelen: weefsel verstoring en cellulaire lysis en homogenisering sacharose dichtheid centrifugeren (Figuur 1). Binnen seconden leverde het wasmiddel-mechanische lysis een ruwe kernen preparaat met een groot aantal kernen, alsmede op cellulair en weefsel puin (figuur 2A...

Hier presenteren we een protocol om snel isoleren kwalitatief hoogwaardige kernen uit de verse of bevroren weefsel voor downstream massaal parallelle RNA sequencing. Wij omvatten wasmiddel-mechanische en hypotone-mechanische weefsel verstoring en cel lysis van de opties, die beide kunnen worden gebruikt voor isolatie van kernen.

Isolatie van volwassen ruggenmerg kernen voor Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Single-cell RNA sequencing is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van transcriptieprofielen van cellen, met name in heterogeen weefsel, zoals het centrale zenuwstelsel. Dit protocol biedt een methode voor het isoleren van kernen voor single-nucleus RNA sequencing. Door het gebruik van kernen in plaats van cellen, kan deze methode worden toegepast op moeilijk te scheiden weefsels, evenals bevroren weefsel.Bovendien kan deze methode worden toegepast om celtypespecifieke veranderingen in cellen na ziekte of letsel te bestuderen. Begin deze procedure met muis euthanasie, zoals beschreven in het tekstprotocol. Maak vervolgens een incisie langs de lengte van het lichaam om de binnenorganen bloot te leggen.Ontmanten de muis door het trekken van de binnenste organen uit de lichaamsholte met behulp van tangen. Gebruik geen papieren handdoeken om het gebied schoon te maken of om organen te verwijderen, omdat dit verontreinigingen kan introduceren. Snijd met een schaar de wervelkolom tussen de L2- en L3-rugwervels.Om het ruggenmerg uit te werpen, past een drie milliliter spuit met ijskoude PBS met een 25 meter 1/4 inch naald. Plaats de punt van de naald in het sacrale uiteinde van de wervelkolom. Gebruik twee vingers om de wervels knijpen om een strakke afdichting rond het puntje van de naald te creëren, en druk op de zuiger om het ruggenmerg rostrally uitwerpen.Plaats het ruggenmerg in een petrischaaltje met ijskoude PBS. Als alleen het lendengedeelte van het koord nodig is, trim dan de sacrale en thoracale gedeelten van het ruggenmerg weg. Op dit punt, bevries het weefsel en bewaar op min 80 graden Celsius, of onmiddellijk te gebruiken voor een wasmiddel mechanische cel lysis zoals hier beschreven, of hypotonische mechanische lysis zoals beschreven in het tekstprotocol.Om wasmiddelmechanische cellyse te bepalen, plaatst u het lumbale ruggenmerg in een voorgekoelde Dounce-homogenisator en voegt u 500 microliters voorgekoelde wasmiddellysebuffer toe. Dounce met vijf slagen van de losse stamper, A, en vervolgens vijf tot 10 slagen van de strakke stamper, B.Vermijd het opheffen van de homogenisator buiten de lyse oplossing tussen slagen, en vermijd de invoering van bellen. Nu, plaats een 40 micron zeef over een voorgekoelde 50 milliliter conische buis en voorwet met een milliliter lage sacharose buffer.Voeg een milliliter lage sacharosebuffer toe aan de Dounce-homogenisator die de ruwe kernen in de lysebuffer bevat, en meng voorzichtig door twee tot drie keer te pipetten. Geef de ruwe kernen prep over de 40-micron zeef, in de voorgekoelde 50 milliliter conische buis. Geef een extra een milliliter lage sacharose buffer over de 40 micron zeef, waardoor het uiteindelijke volume tot drie milliliter van de lage sacharose buffer en 500 microliters van de lyse buffer.Herhaal deze stappen als u meerdere snoeren combineert, koeling in dezelfde conische buis. Dan, centrifuge het monster op 3200 keer G gedurende 10 minuten op vier graden Celsius. Zodra de centrifugatie is voltooid, decanteren de supernatant.We schorten het palet op met behulp van drie milliliter lage sacharose buffer. Draai voorzichtig om de pellet van de muur te verwijderen om de resuspensie te vergemakkelijken. Nadat u het monster twee minuten op ijs hebt laten zitten, brengt u de suspensie over naar een Oak Ridge-buis.Met behulp van de homogenisator bij het instellen van een, homogeniseren de kernen in lage sacharose buffer voor 15 tot 30 seconden, het houden van het monster op ijs. Gebruik vervolgens een serologische pipet om 12,5 milliliter dichtheidssucrosebuffer te leggen, onder het lage sacharosebufferhogeen, waarbij u ervoor zorgt dat er geen bel ontstaat die de dichtheidslagen verstoort. Centrifugeren de buizen op 3200 keer G, gedurende 20 minuten op vier graden Celsius.Zodra de centrifugatie is voltooid, onmiddellijk decanteren de supernatant in een flicking beweging. Tijdens een poging deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om onmiddellijk verwijderen van de Oak Ridge buis uit de centrifuge, en snel decanteren de supernatant. Met behulp van 100 microliter tot een milliliter resuspensieoplossing, schorten we de kernen op die op de muur blijven.Vermijd de myeline frons die blijft bij de wasmiddel gebaseerde voorbereiding. Als u deze stappen niet snel doet, kan dit resulteren in een preparaat van kernen met overtolligcellair puin, of myeline, dat downstream single-nucleus RNA-sequencing kan belemmeren. Filtreer de kernen door een zeef van 30 tot 35 micron porie en verzamel in een voorgekoelde buis.Bepaal de opbrengst van de kernen, met behulp van een hemocytometer om kernen onder een doelstelling van 10 x te tellen, voordat u overgaat tot RNA-sequencing met één kern, zoals beschreven in het tekstprotocol. Helder veld en epifluorescentie beelden van kernen, geïsoleerd met behulp van het wasmiddel mechanische lyse protocol, worden getoond op 10 x. Deze kernen worden op een onbevooroordeelde manier geïsoleerd, waardoor de studie van endogene genexpressieprofielen op het niveau van een enkele cel mogelijk is.Hier getoond, is een representatieve tSNE plot van single-nucleus RNA sequencing, van een muis lumbale ruggenmerg, met behulp van een massaal parallelle druppel inkapseling platform. Kernen geïsoleerd van vers of bevroren weefsel kunnen worden gebruikt voor sequencing op zowel commerciële als academische platforms. Deze techniek stelt onderzoekers in staat om transcriptieprofielen op eencellig niveau te verkennen, met behulp van moeilijk te scheiden weefsels, zoals het ruggenmerg, of zelfs bevroren weefsel, zoals biobankmateriaal.Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om de hoeveelheid tijd tussen euthanasie en cellulaire lyse te verminderen. Verder is het belangrijk om bellen geïntroduceerd in oplossingen van cellulaire lyse tot resuspensie te minimaliseren, en om petkernen met zorg te kopen. Na deze procedure kunnen kernen worden gebruikt voor alternatieve toepassingen, zoals facs sortering, om specifieke celtypen te isoleren.

isolation-adult-spinal-cord-nuclei-for-massively-parallel-single

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We bieden een protocol voor isolatie van Microglia uit verschillende ontleed gebieden van een volwassen muis hersen halfrond, gevolgd door semi-geautomatiseerde bibliotheek voorbereiding voor diepe eencellige RNA-sequencing van volledige lengte transcriptomes. Deze methode zal helpen om functionele heterogeniteit van Microglia in gezondheid en ziekte te verhelmaken.

Isolatie van regiospecifieke Microglia van één volwassen muis hersen halfrond voor diepe eencellige RNA-sequencing

Deze publicatie beschrijft een protocol voor de isolatie van kernen van volwassen adipocyten, zuivering door fluorescentie-geactiveerde sortering en transcriptie op eencellig niveau.

Isolatie van vetweefselkern voor eencellige genomische toepassingen

Enkele kernisolatie is afhankelijk van dissociatie en detergent-gebaseerde permeabilisatie van het celmembraan, stappen die optimalisatie nodig hebben en gevoelig zijn voor de invoering van technische artefacten. We demonstreren een wasmiddel- en enzymvrij protocol voor snelle isolatie van intacte kernen rechtstreeks uit hele weefsel, wat kernen oplevert die geschikt zijn voor single-nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) of ATAC-seq.

Nuclei isolatie van hele weefsel met behulp van een wasmiddel en enzym-vrije methode

Intratumorale heterogeniteit is een inherent kenmerk van tumoren, waaronder gliomen. We ontwikkelden een eenvoudig en efficiënt protocol dat een combinatie van buffers en gradiëntcentrifugatie gebruikt om enkele kernen te isoleren uit vers bevroren glioomweefsels voor single nucleus RNA en ATAC-sequencingstudies.

Kernisolatie van vers bevroren hersentumoren voor single-nucleus RNA-seq en ATAC-seq

Hier presenteren we een protocol om hoogwaardige kernen uit bevroren muizennieren te isoleren die de representatie van medullaire nierceltypen verbeteren en de genexpressieartefacten van enzymatische weefseldissociatie vermijden.

Nuclei-isolatie van volwassen muizennier voor single-nucleus RNA-sequencing

Dit protocol beschrijft de gedetailleerde, low-input monstervoorbereiding voor single-nucleus sequencing, inclusief de dissectie van muis superieure cervicale en stellate ganglia, celdissociatie, cryopreservatie, nucleus isolatie en hashtag barcoding.

Low-input Nucleus Isolation and Multiplexing with Barcoded Antibodies of Mouse Sympathetic Ganglia for Single-nucleus RNA Sequencing

Hier presenteren we een protocol voor het isoleren van kernen uit flash-bevroren, gearchiveerde leverweefsels voor single-nucleus RNA-seq, ATAC-seq en gezamenlijke multiomics (RNA-seq en ATAC-seq).

Isolatie van kernen uit flash-bevroren leverweefsel voor eencellige multiomics

Hier presenteren we een protocol dat de voorbereiding van celkernen beschrijft. Na microdissectie en enzymatische dissociatie van hartweefsel in afzonderlijke cellen, werden de voorlopercellen bevroren, gevolgd door isolatie van zuivere levensvatbare cellen, die werden gebruikt voor single-nucleus RNA-sequencing en de single-nucleus assay voor transposase-toegankelijk chromatine met high-throughput sequencing-analyses.

Kernisolatie van hartvoorlopercellen van muizen voor epigenoom- en genexpressieprofilering met eencellige resolutie

De studie beschrijft een eenvoudig, snel en gedeeltelijk geautomatiseerd protocol om kernen van hoge kwaliteit te isoleren uit bevroren zoogdierweefsels voor stroomafwaartse RNA-sequencing met één kern.

Een eenvoudig, snel en gedeeltelijk geautomatiseerd protocol voor de isolatie van afzonderlijke kernen uit ingevroren zoogdierweefsels voor sequencing van één kern

Het protocol biedt een betrouwbare en geoptimaliseerde benadering voor de isolatie van kernen uit solide tumormonsters voor multioomsequencing met behulp van het 10x Genomics-platform, inclusief aanbevelingen voor weefseldissociatieomstandigheden, cryopreservatie van eencellige suspensies en beoordeling van geïsoleerde kernen.

Geoptimaliseerde kernisolatie van verse en diepgevroren solide tumormonsters voor multioomsequencing

De biologie van intermusculair vetweefsel (IMAT) is grotendeels onontgonnen vanwege de beperkte toegankelijkheid van menselijk weefsel. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor kernisolatie en bibliotheekvoorbereiding van bevroren menselijke IMAT voor sequencing van enkelvoudige kernen RNA om de cellulaire samenstelling van dit unieke vetdepot te identificeren.

Isolatie van kernen uit menselijk intermusculair vetweefsel en stroomafwaartse RNA-sequencing met één kern

Leer de isolatie van kernen uit volwassen ruggenmerg voor single-nucleus RNA-sequencing. Deze methode maakt transcriptoomanalyse van moeilijk te dissociëren weefsels mogelijk en helpt onderzoekers bij het bestuderen van ziekte- en letselreacties.

Isolatie van volwassen ruggenmerg kernen voor Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Meer video's verkennen