Name: Zuivering van extracellulaire trypanosomen, met inbegrip van Staten in Afrika, van bloed door Anion-wisselaars (Diethylaminoethyl-gemengd met cellulose kolommen) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 26 s
Description: Leer de zuivering van Afrikaanse trypanosomen uit bloed met behulp van DEAE-cellulose anion-wisselaars. Deze methode verbetert de diagnostiek van slaapziekte en levert zuivere parasieten voor immunologisch en biochemisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken alle leden van UMR 177 INTERTRYP IRD CIRAD Université de Bordeaux. Dit onderzoek werd gesteund door interne financiering van de Universiteit van Bordeaux en steun van de ANR, LABEX ParaFrap ANR-11-LABX-0024, en van de Association pour le développement de la recherche nl Parasitology et médecine tropicale en de Service Coopération et d'action culturelle de ambassade de France à Bangui (Centrafrique).

Onderzoek voldaan aan de richtsnoeren voor de zorg en het gebruik van proefdieren (NIH publicatie No. 85±23, herziene versie van 1996). Protocollen werden goedgekeurd door onze lokale ethische commissie.
1. dieren
<ol><li>Houden vrouwelijke Swiss (van-1) muizen leeftijd van acht tot tien weken oud, 20-25 g, in een dier huisvesting faciliteit vijftien dagen vóór elk experiment. Huis hen in geventileerde vakken die worden bewaard in een beveiligde, temperatuur (22 ° C) en luchtvochtigheid (50%) kamer, met 12 uur aan/uit lichte cyclus gecontroleerd.</li>
	<li>Dieren gratis toegang geven tot voedsel en water. Minimaliseren van pijn, lijden en ongemak en verrijking van het milieu te bieden.</li>
	<li>Gebruik voor het omkasten, duidelijk Meerwandig kooien, verrijking met houten stokken en kartonnen tunnels. Zachtjes trekken een dier in een tunnel voor het overbrengen van de kooi naar de palm van de hand.</li>
	<li>Het uitvoeren van dagelijkse controle om te beoordelen van tekenen van prostration, sociaal isolement, lichaam schade, gegolfde haren of gebrek aan verzorging.</li>
	<li>Wegen elk dier eenmaal per week. Het uitvoeren van regelmatige inspecties door een dierenarts.</li>
	<li>Voor natuurlijke parasieten, verzamelen van bloed op het hoogtepunt van parasitemia en voor parasieten die dieren dood veroorzaakt, het verzamelen van bloed eergisteren veronderstelde dood. Opmerking: Alle experimenten met infectieuze agentia worden uitgevoerd in speciale kamers, volgens de richtlijnen van de Universiteit goedgekeurd.</li>
</ol>2. buffers, media preparaten
<ol><li>Weeg van elke stof en Voeg gedistilleerd water voor de volgende buffers:<ol>
<li>Bereiden van geconcentreerde-fosfaatgebufferde zoutoplossing (2 x): NB2HPO4 (watervrij) (MW 141.96 g) 10.14 g NaH2PO4∙2H2O (MW 156.01 g) 0.62 g NaCl (MW 58.44 g) 2.55 g Gedistilleerd H2O tot 1 L</li>
		<li>Bereiden-fosfaatgebufferde zoutoplossing-Glucose: NB2HPO4 (watervrij) (MW 141.96 g) 5.39 g NaH2PO4∙2H2O (MW 156.01 g) 0.31 g NaCl (MW 58.44 g) 1.70 g Glucose (MW 180 g) 10 g Gedistilleerd H2O tot 1 L</li>
		<li>1 M KH2PO4voor te bereiden.</li>
		<li>Bereiden elutie Buffer: Met fosfaat gebufferde zoutoplossing-Glucose aanvulling Penicilline (100 U/mL), streptomycine (100 µg/mL), en fenol rood (5 µg/mL).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. bereiding van DEAE-gemengd met cellulose
<ol><li>Plan rond 5 uur voor de voorbereiding van de DEAE-gemengd met cellulose.</li>
	<li>100 g DEAE-gemengd met cellulose met gedestilleerd water in een maatkolf met een smalle nek wassen en laten regelen, dan verwijderen van fijne deeltjes. Herhaal wast totdat het supernatans helder is.</li>
	<li>Voeg 3 L geconcentreerde 2 x Phosphate-Buffered zout toe en roer.</li>
	<li>Breng pH op 8.0 met 1 M KH2PO4 en weggeworpen.</li>
	<li>Spoel tweemaal met gedestilleerd water en laten regelen.</li>
	<li>Wassen en laat regelen tweemaal met 3 liter Phosphate-Buffered Saline-Glucose en negeren het supernatant.</li>
	<li>Meten van de omvang van de cellulose en voeg een gelijk volume van Phosphate-Buffered Saline-Glucose, verdelen over plastic flessen en opslaan bij-20 ° C.</li>
</ol>4. parasieten
<ol><li>Verzamelen van trypanosoom stammen in gebieden endemisch voor mens en dier van trypanosomiasis. Houd parasieten ingevroren in vloeibare stikstof. Opmerking: Trypanosoma musculi is niet pathogeen voor de mens en een extracellulair trypanosoom gebruikt ter vervanging van pathogene trypanosomen in verschillende laboratoriumexperimenten veilig.</li>
	<li>In het geval van laboratoriumonderzoek waarvoor menselijke pathogenen, omgaan met experimenten met zorg in specifieke passende biohazard veiligheidsvoorwaarden niveau (BSL) en voorzorgsmaatregelen; BSL2 voor t.b. gambiense en BSL3 voor T. b. rhodesiense. In veldomstandigheden, standaard microbiologische praktijk is gevestigd: secure bemonstering, mechanische pipetteren, regelmatige ontsmetting van oppervlakken en sterilisatie van afval.</li>
</ol>5. muis infectie
<ol><li>Snel ontdooien van parasieten in een waterbad bij 37 ° C.</li>
	<li>Observeer een druppel ontdooide besmette bloed met een microscoop. Levensvatbaarheid van de parasiet door meting van het percentage van motile formulieren17te beoordelen.</li>
	<li>Injecteren parasieten intraperitoneally muizen (0,5 mL per muis). Elke dag, na infectie, verzamelen van 20 µL van staart bloed door naald punctie en observeren onder een microscoop. Parasitemia volgens Herbert en Lumsden18 evalueren door het tellen van parasieten in verschillende velden van de Microscoop, of met behulp van een haemocytometer.</li>
	<li>Wanneer de parasitemia een drempel die is gedefinieerd voor elke stam bereikt, verzamelen van het bloed (1 mL/muis) in de elutie buffer (5 mL/muis) met heparine (10 U/mL). Opmerking: Het oorspronkelijke en het nieuwe werk van Lanham en Godfrey gemeld dat de optimale Ionische sterkte van fosfaat gebufferde zoutoplossing glucose voor verschillende soorten van de gastheer/parasiet van een stamoplossing pH 8,0.</li>
</ol>6. parasiet scheiding
Opmerking: Alle experimenten vanaf dat moment moeten gebeuren in de kap van een weefselkweek dragen van handschoenen. De kamer temperatuur en vochtigheid in de laboratoria die gebruikt waren 22 ° C en 45% respectievelijk. In veldomstandigheden, is parasiet scheiding met succes uitgevoerd bij 34 ° C.
<ol><li>Plaats van een 10 mL spuit in een verticale steun en voeg een eerder gesneden circulaire, stukje filtreerpapier, glaswol of spons van cellulose.</li>
	<li>Giet de cellulose Gebondenkleurstof in de spuit totdat de 8 mL-niveau wordt bereikt en daarna wassen met 25 mL van elutie buffer.</li>
	<li>Voeg voorzichtig 2 mL verdunde bloed op de top van de kolom en vervolgens voegt elutie medium. Regelmatig voegen elutie buffer volgens de doorvoer van de trypanosomen.</li>
	<li>Verzamelen van afvalwater druppels uit de kolommen in een centrifugebuis en regelmatig controleren op de aanwezigheid van parasieten met een microscoop.</li>
	<li>Wanneer er parasieten zijn niet meer gedetecteerd in de kolom afvalwater, centrifugeer de buis (1800 x g, 10 minuten, bij 4 ° C in het laboratorium en bij kamertemperatuur in veldomstandigheden).</li>
	<li>Verwijder het supernatant en Suspendeer de parasieten in 1 mL van het betrokken medium nodig is voor de volgende stap van onderzoekend.</li>
	<li>Tellen van parasieten met een hemocytometer en vul ze in geschikte voedingsbodem indien nodig.</li>
</ol>

<ol><li>Büscher, P., Cecchi, G., Jamonneau, V., Priotto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+African+trypanosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Human African trypanosomiasis.</a> Lancet. 390 (10110), 2397-2409 (2017).</li>
<li>Lejon, V., Bentivoglio, M., Franco, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+African+trypanosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Clinical+Neurology%22%5BJournal%5D)">Human African trypanosomiasis.</a> Handbook of Clinical Neurology. 114, 169-181 (2013).</li>
<li>Giordani, F., Morrison, L. J., Rowan, T. G., De Koning, H. P., Barrett, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+animal+trypanosomiases+and+their+chemotherapy%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">The animal trypanosomiases and their chemotherapy: a review.</a> Parasitology. 143 (14), 1862-1889 (2016).</li>
<li>Aksoy, S., Buscher, P., Lehane, M., Solano, P., Van Den Abbeele, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+African+trypanosomiasis+control%3A+Achievements+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Human African trypanosomiasis control: Achievements and challenges.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (4), e0005454(2017).</li>
<li>Büscher, P., Deborggraeve, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+can+molecular+diagnostics+contribute+to+the+elimination+of+human+African+trypanosomiasis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">How can molecular diagnostics contribute to the elimination of human African trypanosomiasis?</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (5), 607-615 (2015).</li>
<li>Truc, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atypical+human+infections+by+animal+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Atypical human infections by animal trypanosomes.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (9), e2256(2013).</li>
<li>Lumsden, W. H., Kimber, C. D., Evans, D. A., Doig, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+brucei%3A+miniature+anion-exchange+centrifugation+technique+for+detection+of+low+parasitaemias%3A+adaptation+for+field+use%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Society+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma brucei: miniature anion-exchange centrifugation technique for detection of low parasitaemias: adaptation for field use.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (3), 312-317 (1979).</li>
<li>Büscher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Models+of+Mini+Anion+Exchange+Centrifugation+Technique+%28mAECT%29+and+Modified+Single+Centrifugation+%28MSC%29+for+sleeping+sickness+diagnosis+and+staging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Improved Models of Mini Anion Exchange Centrifugation Technique (mAECT) and Modified Single Centrifugation (MSC) for sleeping sickness diagnosis and staging.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (11), e471(2009).</li>
<li>Lanham, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+trypanosomes+from+the+blood+of+infected+rats+and+mice+by+anion-exchangers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Separation of trypanosomes from the blood of infected rats and mice by anion-exchangers.</a> Nature. 218 (5148), 1273-1274 (1968).</li>
<li>Lanham, S. M., Godfrey, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+salivarian+trypanosomes+from+man+and+other+mammals+using+DEAE-cellulose%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Isolation of salivarian trypanosomes from man and other mammals using DEAE-cellulose.</a> Experimental Parasitology. 28 (3), 521-534 (1970).</li>
<li>Humphrey, P. A., Ashraf, M., Lee, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+trypanosomes+in+vivo%2C+host+body+weight+gains%2C+and+food+consumption+in+zinc-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Growth of trypanosomes in vivo, host body weight gains, and food consumption in zinc-deficient mice.</a> Journal of the National Medical Association. 89 (1), 48-56 (1997).</li>
<li>Lowry, J. E., Leonhardt, J. A., Yao, C., Belden, E. L., Andrews, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+C57BL%2F6+mice+by+Trypanosoma+musculi+modulates+host+immune+responses+during+Brucella+abortus+cocolonization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wildlife+Diseases%22%5BJournal%5D)">Infection of C57BL/6 mice by Trypanosoma musculi modulates host immune responses during Brucella abortus cocolonization.</a> Journal of Wildlife Diseases. 50 (1), 11-20 (2014).</li>
<li>Vincendeau, P., Daëron, M., Daulouede, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+antibody+classes+and+Fc+receptors+responsible+for+phagocytosis+of+Trypanosoma+musculi+by+mouse+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Identification of antibody classes and Fc receptors responsible for phagocytosis of Trypanosoma musculi by mouse macrophages.</a> Infection and Immunity. 53 (3), 600-605 (1986).</li>
<li>Vincendeau, P., Daëron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+musculi+co-express+several+receptors+binding+rodent+IgM%2C+IgE%2C+and+IgG+subclasses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma musculi co-express several receptors binding rodent IgM, IgE, and IgG subclasses.</a> Journal of Immunology. 142 (5), 1702-1709 (1989).</li>
<li>Holzmuller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+and+pathogenicity+patterns+of+Trypanosoma+bruceigambiense+field+isolates+in+experimentally+infected+mouse%3A+differences+in+host+immune+response+modulation+by+secretome+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infections%22%5BJournal%5D)">Virulence and pathogenicity patterns of Trypanosoma bruceigambiense field isolates in experimentally infected mouse: differences in host immune response modulation by secretome and proteomics.</a> Microbes and Infections. 10 (1), 79-86 (2008).</li>
<li>Holzmuller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+parasites+and+their+excreted-secreted+factors+modulate+the+inducible+metabolism+of+L-arginine+in+macrophages%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">How do parasites and their excreted-secreted factors modulate the inducible metabolism of L-arginine in macrophages?</a> Frontiers in Immunology. 9, 778(2018).</li>
<li>Abrahamson, I. A., Da Silva, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-dependent+cytotoxicity+against+Trypanosoma+cruzi%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Antibody-dependent cytotoxicity against Trypanosoma cruzi.</a> Parasitology. 75 (3), 317-323 (1977).</li>
<li>Herbert, W. J., Lumsden, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+brucei%3A+a+rapid+%26%2334%3Bmatching%26%2334%3B+method+for+estimating+the+host%27s+parasitemia%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma brucei: a rapid &#34;matching&#34; method for estimating the host's parasitemia.</a> Experimental Parasitology. 40 (3), 427-431 (1976).</li>
<li>Dauchy, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+brucei+CYP51%3A+Essentiality+and+Targeting+Therapy+in+an+Experimental+Model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma brucei CYP51: Essentiality and Targeting Therapy in an Experimental Model.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (11), e0005125(2016).</li>
<li>Raz, B., Iten, M., Grether-Bühler, Y., Kaminsky, R., Brun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Alamar+Blue+assay+to+determine+drug+sensitivity+of+African+trypanosomes+%28T.+b.+rhodesiense+and+T.+b.+gambiense%29+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Tropica%22%5BJournal%5D)">The Alamar Blue assay to determine drug sensitivity of African trypanosomes (T. b. rhodesiense and T. b. gambiense) in vitro.</a> Acta Tropica. 68 (2), 139-147 (1997).</li>
<li>Albright, J. W., Albright, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+growth+of+Trypanosoma+musculi+in+cell-free+medium+conditioned+by+rodent+macrophages+and+mercaptoethanol%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">In vitro growth of Trypanosoma musculi in cell-free medium conditioned by rodent macrophages and mercaptoethanol.</a> International Journal for Parasitology. 10 (2), 137-142 (1980).</li>
<li>Gobert, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-Arginine+availability+modulates+local+nitric+oxide+production+and+parasite+killing+in+experimental+trypanosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">L-Arginine availability modulates local nitric oxide production and parasite killing in experimental trypanosomiasis.</a> Infection and Immunity. 68 (8), 4653-4657 (2000).</li>
<li>De Muylder, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Trypanosoma+brucei+kinesin+heavy+chain+promotes+parasite+growth+by+triggering+host+arginase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A Trypanosoma brucei kinesin heavy chain promotes parasite growth by triggering host arginase activity.</a> PLoS Pathogens. 9 (10), e1003731(2013).</li>
<li>Nzoumbou-Boko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+musculi+Infection+in+Mice+Critically+Relies+on+Mannose+Receptor-Mediated+Arginase+Induction+by+a+TbKHC1+Kinesin+H+Chain+Homolog%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma musculi Infection in Mice Critically Relies on Mannose Receptor-Mediated Arginase Induction by a TbKHC1 Kinesin H Chain Homolog.</a> Journal of Immunology. 199 (5), 1762-1771 (2017).</li>
<li>Bonhivers, M., Nowacki, S., Landrein, N., Robinson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+the+trypanosome+endo-exocytotic+organelle+is+cytoskeleton+mediated%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of the trypanosome endo-exocytotic organelle is cytoskeleton mediated.</a> PLoS Biology. 6 (5), e105(2008).</li>
<li>Albisetti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+the+flagellar+pocket+collar+and+the+hook+complex+via+a+novel+microtubule-binding+protein+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Interaction between the flagellar pocket collar and the hook complex via a novel microtubule-binding protein in Trypanosoma brucei.</a> PLoS Pathogens. 13 (11), e1006710(2017).</li>
<li>Cross, G. A. M., Klein, R. A., Linstead, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+amino+acids+by+Trypanosoma+brucei+in+culture%3A+L-threonine+as+a+precursor+for+acetate%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Utilization of amino acids by Trypanosoma brucei in culture: L-threonine as a precursor for acetate.</a> Parasitology. 71 (2), 311-326 (1975).</li>
<li>Bringaud, F., Rivière, L., Coustou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+metabolism+of+trypanosomatids%3A+adaptation+to+available+carbon+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 149 (1), 1-9 (2006).</li>
<li>Mazet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+the+central+metabolism+of+the+bloodstream+forms+of+Trypanosoma+brucei%3A+production+of+acetate+in+the+mitochondrion+is+essential+for+the+parasite+viability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Revisiting the central metabolism of the bloodstream forms of Trypanosoma brucei: production of acetate in the mitochondrion is essential for the parasite viability.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (12), e2587(2013).</li>
<li>Coutton, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+CFAP43+and+CFAP44+cause+male+infertility+and+flagellum+defects+in+Trypanosoma+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mutations in CFAP43 and CFAP44 cause male infertility and flagellum defects in Trypanosoma and human.</a> Nature Communications. 9 (1), 686(2018).</li>
<li>Cnops, J., Magez, S., De Trez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escape+mechanisms+of+African+trypanosomes%3A+Why+trypanosomosis+is+keeping+us+awake%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Escape mechanisms of African trypanosomes: Why trypanosomosis is keeping us awake.</a> Parasitology. 142 (3), 417-427 (2015).</li>
<li>Barrett, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics-Based+Approaches+to+the+Isolation+of+African+Trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Microfluidics-Based Approaches to the Isolation of African Trypanosomes.</a> Pathogens. 6 (4), (2017).</li>
<li>Taylor, A. E., Lanham, S. M., Williams, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+methods+of+preparation+on+the+infectivity%2C+agglutination%2C+activity%2C+and+ultrastructure+of+bloodstream+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Influence of methods of preparation on the infectivity, agglutination, activity, and ultrastructure of bloodstream trypanosomes.</a> Experimental Parasitology. 35 (2), 196-208 (1974).</li>
<li>Gutteridge, W. E., Cover, B., Gaborak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+blood+and+intracellular+forms+of+Trypanosoma+cruzi+from+rats+and+other+rodents+and+preliminary+studies+of+their+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Isolation of blood and intracellular forms of Trypanosoma cruzi from rats and other rodents and preliminary studies of their metabolism.</a> Parasitology. 76 (2), 159-176 (1978).</li>
<li>Cruz-Saavedra, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Trypanosoma+cruzi+metacyclic+trypomastigotes+by+ion+exchange+chromatography+in+sepharose-DEAE%2C+a+novel+methodology+for+host-pathogen+interaction+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification of Trypanosoma cruzi metacyclic trypomastigotes by ion exchange chromatography in sepharose-DEAE, a novel methodology for host-pathogen interaction studies.</a> Journal of Microbiological Methods. 142, 27-32 (2017).</li>
<li>Lemesre, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+protection+against+canine+visceral+leishmaniasis+using+the+LiESAp-MDP+vaccine+in+endemic+areas+of+France%3A+double-blind+randomised+efficacy+field+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Long-lasting protection against canine visceral leishmaniasis using the LiESAp-MDP vaccine in endemic areas of France: double-blind randomised efficacy field trial.</a> Vaccine. 25 (21), 4223-4234 (2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Gezuiverde trypanosomen vertegenwoordigen een krachtig instrument om te studeren, immunologie, biochemie, cellulaire en moleculaire biologie. Grote delen van de gegevens en resultaten zijn verkregen van trypanosomen, die vervolgens geholpen om informatie te verkrijgen van andere eukaryotische cellen30. Trypanosomen zijn ook het onderwerp van belangrijke en interessante onderzoek omdat zij talrijke mechanismen waarmee ze te overleven en te groeien in twee zeer verschillende omgevingen hebben bedach...

De methode voorgesteld beschreven hier kunnen de scheiding van trypanosomen, parasieten die verantwoordelijk is voor mens en dier Afrikaanse trypanosomiasis (hoed), uit bloed. Dit is de beste methode voor diagnose van eerste fase hoed en bovendien deze parasiet reiniging methode vergunningen robuuste serologische en onderzoek onderzoek.
HOED wordt veroorzaakt door de tseetseevlieg verzonden Trypanosoma brucei gambiense en T. b. rhodesiense1. Deze eencellige parasieten vermenigvuldigen extracellularly in de bloedsomloop, lymfe en interstitiële vocht tijdens de eerste fase van de ziekte (hemolymphatic fase). De tweede fase (meningoencephalitic fase) begint als parasieten over de bloed-hersenbarrière; neurologische symptomen, met inbegrip van een wanorde van de slaap, die haar naam "slaapziekte" aan deze ziekte heeft gegeven, zijn typerend voor deze tweede fase2. Verwante trypanosomen (T. b. brucei, T. vivax, T. congolense, T. evansi) zijn de causatieve agenten van dier Afrikaanse trypanosomosis (AAT)3.
De World Health Organization (WHO) wil elimineren hoed als een probleem voor de volksgezondheid in 2020 en stoppen van de transmissie door 20304. De recente invoering van snelle diagnose tests heeft verbeterde serologische diagnose1,4,5. Verschillende moleculair diagnostische tests zijn ontwikkeld, maar hun rol in de diagnostische gegevens van het veld nog niet is vastgesteld5. Ze worden gebruikt voor het identificeren van de sub-soorten van de brucei groep en atypische trypanosomiase veroorzaakt door parasieten die verantwoordelijk zijn voor dierlijke trypanosomosis6.
De detectie van de parasiet is essentieel voor de diagnose, de behandeling en de follow-up, zoals serologie kan valse positieve en helaas valse negatieve resultaten1geven. De directe microscopische observatie van de protisten van deze hemoflagellate is moeilijk in HAT gevallen die worden veroorzaakt door t.b. gambiense, (meer dan 95% van de gevallen) als lage parasitemias de regel zijn, terwijl voor hoed veroorzaakt door t.b. rhodesiense, een grote aantal parasieten zijn vaak aanwezig in het bloed. Verschillende concentratie technieken zijn gebruikt, zoals de daling van de dikke en capillair centrifugeren (CTC), maar de scheiding van parasieten van bloed door een kolom van anionenwisselaar (cellulose Gebondenkleurstof) gevolgd door centrifugatie en microscopische observatie van de pellet, is de meest gevoelige methode (ongeveer 50 parasieten/mL bloed kunnen worden gedetecteerd)1,7. Bijgevolg, de zuivering van trypanosomen door deze methode anion-wisselaars (cellulose Gebondenkleurstof) is de beste en, tot op heden, de referentiemethode voor het visualiseren en isoleren van parasieten uit bloed voor hoed diagnose. In veldomstandigheden, een mini kolom van cellulose Gebondenkleurstof is succesvol gebruikt en verschillende verbeteringen hebben vergemakkelijkt microscopische observatie7,8.
De methode van trypanosoom scheiding van bloed, hieronder beschreven, hangt af van parasiet oppervlakte heffing, welke minder negatief dan bloed zoogdiercellen9is. Interessant is dat deze methode 50 jaar geleden, in 1968 door Dr. Sheila Lanham werd ontwikkeld, en blijft de gouden standaard voor detectie en voorbereiding van de bloedbaan trypanosomen. Het is snel en reproduceerbare voor salivaria trypanosomen uit een breed scala van zoogdieren, de diagnose van zowel mens en dier van trypanosomiasis10het toelaat.
Met het oog op een levend, gezuiverde parasieten, wordt geïnfecteerd bloed op een anionenwisselaar kolom toegevoegd. Chromatografie voorwaarden (voornamelijk pH, Ionische sterkte van buffers/media) hebben elk trypanosoom soorten, en meer in het algemeen, worden aangepast aan elke mix van zoogdieren bloed cellen en de trypanosomen10. Elutie buffer wordt juist ingesteld op pH 8 voor de meeste Afrikaanse trypanosomen10. Deze methode geeft voorrang aan de concentratie van parasieten gevonden in het bloed van patiënten, omdat parasitemias kan te laag worden gedetecteerd door microscopische observatie alleen, en hierdoor ook laboratoriumonderzoek. Werken met vers geïsoleerde trypanosomen en op het bloed van besmette dieren, met behulp van deze techniek, is meer relevant voor verschillende onderzoeken dan studies met parasieten die in een van de omstandigheden in het laboratorium hebben zijn gekweekt voor onbepaalde tijd.
Gastheer-parasiet-relaties worden best bestudeerd met een parasiet infecteren de natuurlijke gastheer, daarom, T. musculi, een natuurlijke lymfkliertest parasiet, die representatief is voor de extracellulaire trypanosomen, heeft vele voordelen zoals lymfkliertest infectie gaat in een kleine proefdier en vereist geen biohazard veiligheidsvoorwaarden niveau (BSL). T. musculi doodt niet immunocompetent muizen, in tegenstelling tot vele andere soorten van Trypanosoma , waaronder de menselijke pathogenen. T. musculi zijn in T-cel-beroofd muizen niet geëlimineerd en parasitemias bij besmette muizen kan worden verhoogd door het wijzigen van voedsel en voedingsstoffen inname11. Deze parasiet moduleert de immuunrespons bij co-infecties met andere ziekteverwekkers12. T. musculi van geïnfecteerde muizen vertonen verschillen van gekweekte T. musculi, bijvoorbeeld de uitdrukking van membraan Fc receptoren is verloren gegaan in T. musculi Axenische culturen, in vergelijking met parasieten gezuiverd van geïnfecteerde muizen13 , 14. Excreted-uitgescheiden factoren (ESF) zijn ook kwalitatief en kwantitatief minder uitgesproken in een trypanosoom culturen en verschillen tussen stammen geïsoleerd in endemische gebieden15. ESF zijn de eerste antigenen om te worden weergegeven om het immuunsysteem van de gastheer en dus spelen een belangrijke rol in de oorspronkelijke host immuunrespons16.
In experimenteel geïnfecteerde dieren voor laboratoriumonderzoek vergemakkelijkt dit protocol experimenten met een groter aantal parasieten, minimaliseren van het aantal muizen vereist vooral bij gebruik van immunosuppressie dieren. De variant oppervlakte glycoproteïnen (VSGs) die worden gebruikt in de Card Agglutination Test for Trypanosomiasis (CATT) in mass screening zijn nog gezuiverd van trypanosomen die worden doorgegeven bij ratten. De twee snelle diagnostische tests (individueel verpakt cassettes) die nu beschikbaar zijn voor gebruik in het veld zijn nog steeds met een besmettelijk model bron van inheemse VSGs en niet in vitro gekweekt trypanosomen1,4, 5. de vooruitgang in de studie van de trypanosoom immunologie en celbiologie heeft bevorderd aangezien deze parasieten van de gezuiverde cellulose Gebondenkleurstof gemakkelijk worden in grote hoeveelheden van nature of experimenteel geïnfecteerde hosts, en met name knaagdieren verkregen kunnen.

<table><tbody><tr><td>10 mL Pipettes&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>357.551</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Pipettes&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>352.507</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugation tube 50 mL</td><td>Falcon</td><td>352.070</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Sigma Aldrich</td><td>4K15</td><td></td></tr><tr><td>DEAE cellulose</td><td>Santa Cruz</td><td>s/c- 211213</td><td>100 G</td></tr><tr><td>filter paper&nbsp;</td><td>Whatman</td><td>1.001.125</td><td></td></tr><tr><td>Flat bottom flask narrow neck</td><td>Duran</td><td>21 711 76</td><td>6000 mL</td></tr><tr><td>Glucose&nbsp;</td><td>VWR</td><td>101174Y</td><td>500 G</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149-50KU</td><td>5 000 U</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>VWR</td><td>120 26936.260</td><td>500 G</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>CH-20</td><td></td></tr><tr><td>Microscope coverslips</td><td>Thermofisher scientific</td><td>CB00100RA020MNT0</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Thermofisher scientific</td><td>AGAA000001</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp;</td><td>VWR</td><td>100 28026;260</td><td>500 G</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR</td><td>27800.291</td><td>1 KG</td></tr><tr><td>NaH2PO4&nbsp;</td><td>VWR</td><td>110 33616;262</td><td>500 G</td></tr><tr><td>Nalgene Plastic Media Bottles size 125 mL</td><td>Thermofisher scientific</td><td>342024-0125</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Plastic Media Bottles size 500 mL</td><td>Thermofisher scientific</td><td>342024-0500</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipette</td><td>VWR</td><td>BRND125400</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin 10.000 UI/Streptomycin 10.000 &micro;g</td><td>EUROBIO</td><td>CABPES01 OU</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Phenol red</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0290</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Syringue&nbsp;</td><td>Dutscher</td><td>SS+10S21381</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture hood</td><td>Thermoelectro Corporation</td><td>MSC-12</td><td></td></tr><tr><td>Trypanosoma brucei brucei</td><td>Institute of Tropical Medicine (Antwerpen, België).</td><td></td><td>ANTAT 1.1</td></tr><tr><td>Trypanosoma brucei gambiense</td><td>Institute of Tropical Medicine (Antwerpen, België).</td><td></td><td>ITMAP 1893</td></tr><tr><td>Trypanosoma musculi</td><td>London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK)</td><td></td><td>Partinico II</td></tr></tbody></table>

zuivering van extracellulaire trypanosomen, met inbegrip van staten in afrika, van bloed door anion-wisselaars (diethylaminoethyl-gemengd met cellulose kolommen)

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers (Diethylaminoethyl-cellulose Columns)

Met deze methode kunt de scheiding van trypanosomen, parasieten die verantwoordelijk is voor mens en dier Afrikaanse trypanosomiasis (hoed), van besmet bloed. Dit is de beste methode voor diagnose van eerste fase hoed en bovendien deze parasiet reiniging methode toelaat serologische en onderzoek van onderzoeken.
HOED wordt veroorzaakt door de tseetseevlieg verzonden Trypanosoma brucei gambiense en T. b. rhodesiense. Verwante trypanosomen zijn de causatieve agenten van dierlijke trypanosomiasen. Opsporing van trypanosoom is essentieel voor de diagnose, de behandeling en de follow-up van de hoed. De hier beschreven techniek is de meest gevoelige parasiet detectie techniek, aangepast aan de veldomstandigheden voor de diagnose van T. b. gambiense hoed en binnen een uur kan worden voltooid. Bloed is gelaagd op een anionenwisselaar kolom (cellulose Gebondenkleurstof) eerder aangepast aan de pH 8, en elutie buffer wordt toegevoegd. Zeer negatief geladen bloedcellen zijn geadsorbeerde op de kolom, terwijl de minder negatief geladen trypanosomen passeren. Verzamelde trypanosomen zijn Ingehuld door centrifugeren en waargenomen door microscopie. Parasieten zijn bovendien bereid zonder cellulaire schade met behoud van hun infectiviteit.
Gezuiverde trypanosomen zijn vereist voor immunologische testen; ze worden gebruikt in de trypanolyse test, de gouden standaard in HAT serologie. Gekleurd parasieten worden gebruikt in de kaart agglutinatietest (CATT) voor veld serologie. Antigenen van gezuiverde trypanosomen, zoals variant oppervlakte glycoproteïne, exoantigens, worden ook gebruikt in verschillende immunoassay. De hier beschreven procedure is ontworpen voor Afrikaanse trypanosomen; chromatografie voorwaarden hebben bijgevolg elk trypanosoom-stam, en meer in het algemeen, worden aangepast aan het bloed van elke soort host zoogdier.
Deze fascinerende ziekteverwekkers zijn gemakkelijk gezuiverde en beschikbaar voor gebruik biochemische, moleculaire en cel biologie studies, met inbegrip van co cultuur met cellen van de gastheer om gastheer-parasiet-relaties op het niveau van de membraan receptoren, signalering en gene te onderzoeken expressie; drug testen in vitro; onderzoek van gene schrapping, mutatie of overexpressie stofwisselingsprocessen, cytoskeletal biogenese en parasiet overleven.

Gezuiverde trypanosomen werden gebruikt in farmaceutische proeven. Parasieten worden overgebracht naar cultuur putten met seriële verdunningen van bepaalde drugs, hetzij alleen of gemengde19. Microscopische opmerkingen, evaluatie van de motiliteit is een marker van levensvatbaarheid kan worden uitgevoerd wanneer slechts een paar dugs worden getest, overwegende dat de AlamarBlue cel levensvatbaarheid assay is een uitstekende methode voor grote beweeglijkheid testen ...

Deze methode van trypanosoom afscheiding van bloed is afhankelijk van hun oppervlakte lading minder negatief dan bloed zoogdiercellen. Geïnfecteerd bloed is geplaatst en worden behandeld op een anionenwisselaar kolom. Deze methode, de meest passende diagnose voor slaapziekte, biedt gezuiverde parasieten voor immunologische, biologische, biochemische, farmaceutische en moleculaire biologie onderzoek.

Zuivering van extracellulaire trypanosomen, met inbegrip van Staten in Afrika, van bloed door Anion-wisselaars (Diethylaminoethyl-gemengd met cellulose kolommen)

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is ...

Afrikaanse trypanosomen zijn verantwoordelijk voor menselijke Afrikaanse trypanosomiasis, of slaapziekte en dierlijke Afrikaanse trypanosomiasis. De trypanosomen die slaapziekte veroorzaken zijn tseetsevlieg overgedragen protist parasieten aanwezig in veel geografische foci in Afrika bezuiden de Sahara. De detectie van de parasiet is essentieel voor de diagnose, behandeling en follow-up.Een serologie kan geven vals positief en helaas, valse negatieve resultaten. Om detectie in het bloed te helpen, moeten trypanosomen geconcentreerd zijn. Verschillende parasiet concentratie technieken zijn gebruikt.De meest gevoelige methode is de scheiding van parasieten uit bloed door een kolom van anionwisselaar, DEAE cellulose gevolgd door centrifugatie en microscopische observatie. Bijgevolg is de DEAE cellulose methode de beste en blijft tot op heden, de referentiemethode voor het visualiseren en isoleren van parasieten uit bloed voor menselijke Afrikaanse trypanosomiasis diagnose, vooral in veldomstandigheden. Deze methode, de meest passende diagnose voor Afrikaanse trypanosomiasis biedt ook gezuiverde parasieten voor immunologische, biologische, biochemische, farmaceutische en moleculaire biologische onderzoeken.Alle onderzoeken in overeenstemming met de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en de overeenkomst is verkregen door de Franse autoriteiten en alle gebruikte protocollen zijn goedgekeurd door onze lokale ethische commissie. Weeg elke stof af volgens het geschreven protocol. Voeg gedestilleerd water toe en pas nauwkeurig aan op pH 8 met kaliumdihydrogenfosfaat om de volgende gebufferde oplossingen te maken, geconcentreerde fosfaatbuffer zoutoplossing 2X.Voeg gedestilleerd water en glucose toe voor fosfaatgebufferde zoutglucose. Voor 100 milliliter elutie buffer, voeg 100 eenheden per milliliter penicilline, 100 microgram per milliliter streptomycine, en vijf microgram milliliter fenol rood aan fosfaat gebufferde zoutgluurglucose. 100 gram DEAE cellulose wordt eerst gewassen met drie liter gedestilleerd water en vervolgens overgelaten om zich te vestigen.Fijne deeltjes worden weggegooid. De wasbeurten worden herhaald totdat de supernatant duidelijk is. Geconcentreerde fosfaatgebufferde zoutoplossing 2X wordt toegevoegd en de DEAE cellulose wordt geroerd.De pH wordt aangepast aan acht met één molair kaliumfosfaat. De cellulose wordt vervolgens twee keer gewassen met gedestilleerd water en twee maal met fosfaatgebufferde zoutglucose. De DEAE cellulose en fosfaat gebufferde zoutgluurglucose worden gemengd in gelijke volumes.Legering gevierendeeld en opgeslagen bij kamertemperatuur of vier graden Celsius of bij min 20 graden Celsius voor langdurige opslag. Trypanosoom besmet bloed wordt opgeslagen in vloeibare stikstof. Een legeringskwart van één milliliter wordt ontdooid bij kamertemperatuur.Parasieten worden zorgvuldig verzameld uit de cryotube met behulp van een naald en een een milliliter spuit. De levensvatbaarheid van ontdooide parasieten wordt beoordeeld door de beweeglijkheid zoals gevisualiseerd door lichtmicroscopie observatie vóór infectie. Parasieten worden geïnjecteerd in de buikholtes van twee muizen, 500 microliter per muis.Elke dag na infectie wordt parasitemie beoordeeld door een druppel bloed uit de staart te verzamelen met een naald en gecontroleerd door microscopie. Wanneer de parasiet op een geschikt niveau is, wordt besmet bloed verzameld. Een spuit van 10 milliliter wordt ondersteund in een klem of houder en er wordt een voorgesneden stukje filterpapier toegevoegd.Bereide DEAE cellulose wordt gegoten in de spuit tot de acht of negen milliliter niveau. De kolom wordt gewassen met de elutiebuffer. Twee milliliter besmet bloed wordt zorgvuldig geplaatst op de top van de kolom en trypanosomen worden verzameld in de kolom eluaat in een 50 milliliter centrifugatie buis.Elution buffer wordt regelmatig toegevoegd volgens de doorvoer van trypanosomen. De doorvoer van trypanosomen door de kolom wordt gecontroleerd door het nemen van een druppel kolom eluate op regelmatige tijdstippen en observeren voor trypanosomen met behulp van lichte microscopie. Wanneer trypanosomen niet meer worden waargenomen in het eluaat, wordt de conische buis gecentrifugeerd op 1, 800 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.De supernatant wordt weggegooid en trypanosomen in de pallet worden geteld met een hemocytometer. Verzamelde trypanosomen worden vervolgens verdund in het medium dat nodig is voor het geplande onderzoek. Deze methode, de meest passende diagnose voor Afrikaanse trypanosomiasis biedt gezuiverde parasieten voor immunologische, biologische, biochemische, farmaceutische en moleculaire biologische onderzoeken.Deze studies zijn ontwikkeld omdat DEAE cellulose gezuiverde parasieten gemakkelijk kunnen worden verkregen in grote hoeveelheden van natuurlijk of experimenteel geïnfecteerde gastheren en in het bijzonder knaagdieren. Trypanosoom levensvatbaarheid in aanwezigheid van farmaceutische middelen wordt beoordeeld door microscopische observatie. Parasiet levensvatbaarheid wordt geassocieerd met beweeglijkheid en daarom kan worden gecontroleerd door het oog onder een lichtmicroscoop op 40 keer of hogere vergroting.De levensvatbaarheid van parasieten wordt beoordeeld door het percentage motilevormen te meten. Verdunningen van testverbindingen worden toegevoegd in elke put van een 96 goed weefsel kweekplaat, terwijl controle putten worden bespot. Elke concentratie wordt beoordeeld in drievoud.Het aantal levensvatbare parasieten voor elke verdunning wordt vergeleken met het aantal parasieten in controleputten. De effecten van Pentamidine, een referentiemedicijn, gebruikt in menselijke Afrikaanse trypanosomiasis therapie wordt weergegeven in deze figuur. Trypanosoom macrofaag co-culturen maken het onderzoek van gastheer parasiet interactie op cellulair niveau.In macrofaagparasiet co-culturen, extra cellulaire trypanosomen induceren de productie van macrofaag arginase dat hydrolyginine tot ornithine hydrolyzes. Ornithine is de voorloper van polyamines en trypanothione, essentieel voor het overleven en groeien van parasieten. Bovendien vermindert arginine-uitputting de productie van trypanocidal stikstofmonoxide.Vervolgens vermindert toevoeging van een arginase-remmer, S-L-cysteïne aan coculturen de macrofaag geïnduceerde parasietgroei drastisch. Arginase inductie wordt bemiddeld door trypanosoom uitgescheiden en of uitgescheiden factoren. Deze arginase inducerende factor is geïdentificeerd als een orthine kinesine.De kinesine bindt zich aan C-type lectine mannose bindingsreceptoren. Arginase wordt geïnduceerd en produceert ornithine die de groei van parasieten bevordert. Arginase wordt niet veroorzaakt door kinesine in macrofagen gekweekt met 12,5 millimolar mannose of in macrofagen van muizen waar de macrofaag mannose receptoren zijn verwijderd.Verdere voorbeelden van celbiologie en biochemische experimenten met DAEA cellulose gezuiverde trypanosomen worden aangetoond in studies waar nieuwe cytoskeletale eiwitten zoals BILBO1 is geïdentificeerd. BILBO1 is vereist voor de biogenese van belangrijke cytoskeletale structuren en parasiet overleving. Bilbo1 is dus een belangrijk doel voor interventie in pathogene trypanosomen.Een beeld dat immunoflourescence het etiketteren van een bloedbaancultuurvorm toont, trypanosoma brucei cel die met een anti-BILBO1 antilichaam wordt onderzocht wordt getoond in dit cijfer. Bovendien, glucose en threonine metabolisme zijn beschreven met behulp van DEAE cellulose gezuiverde trypanosomen en de enzymen die betrokken zijn bij deze processen zijn experimenteel gevalideerd. Een schematische weergave van glucose en threonine metabolisme in de bloedbaan-gevormde trypanosomen wordt weergegeven in deze figuur.Zuivering van Afrikaanse trypanosomen uit bloed door anionuitwisselingen DEAE cellulosekolommen met recente verbeteringen blijft de gouden standaard voor trypanosoomdetectie, niet alleen bij natuurlijke gastheren met lage parasieten in endemische gebieden, maar ook voor de eis van parasieten in grote aantallen voor experimentele onderzoeken. Onderzoeken hebben het mogelijk toegestaan de identificatie van trypanosoom moleculen spelen essentiële rollen in parasiet overleving en groei. Geïdentificeerde doelen kunnen de basis vormen voor een toekomstig vaccin met potentiële antigenen voor zowel mensen als dieren in een één-gezondheidsbenadering.

purification-extracellular-trypanosomes-including-african-from-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Mama is een uniek Magnetosome geassocieerd eiwit dat werd aangetoond dat het betrokken is bij magnetosome activering. Hier presenteren we de zuivering protocol van Mama deletiemutant (MamAΔ41)...

Zuivering van het M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome geassocieerd eiwit MamAΔ41

In this video, we demonstrate an anion-exchange chromatography technique to purify human calcium-binding protein S100A12 based on the net surface charge of the protein from an Escherichia coli culture.

Anion-Exchange Chromatography-Based Protein Purification: A Separation Technique to Isolate a Protein of Interest From Dialyzed Bacterial Lysate Based on Net Charge

This video demonstrates the cation exchange chromatography technique to isolate recombinant protein from the insect cell protein lysate.

Cation Exchange Chromatography: A Technique to Isolate Target Recombinant Protein from Insect Cell Lysate Based on Net Surface Charge

This video demonstrates the size exclusion chromatography (SEC) technique for purifying bacterial extracellular vesicles (EVs) from the culture filtrate of Mycobacterium tuberculosis (Mtb). The technique utilizes a porous resin-packed column to obtain purified fractions of EVs. The porous particles selectively allow smaller proteins to enter the pores, resulting in slower elution. At the same time, EVs are excluded from entering the pores due to their larger size and are eluted first.

A Size Exclusion Chromatography Technique to Purify Mycobacterial Extracellular Vesicles

Het meten van antilichaam-functie is de sleutel tot het begrijpen van immuniteit tegen Plasmodium falciparum malaria. Deze methode beschrijft de zuivering van levensvatbare merozoïeten en meting van opsonisatie-afhankelijke fagocytose door flowcytometrie.

High Yield Zuivering van<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoïeten Voor gebruik in opsoniserende antilichaamassays

De Tandem Affinity Purification (TAP) methode is veel gebruikt om native complexen te isoleren uit cellulaire extracten, voornamelijk eukaryotisch, voor proteomics. Hier presenteren we een TAP-methodeprotocol dat is geoptimaliseerd voor de zuivering van native complexen voor structurele studies.

Zuivering van Inheemse Complexen voor de structurele studie Met behulp van een Tandem Affinity Tag Method

Dit protocol beschrijft de zuivering van F1-ATPase van de gekweekte insecten fase van Trypanosoma brucei. De procedure levert een zeer zuivere, homogene en actieve complex geschikt voor structurele en enzymatische studies.

Isolatie van F1-ATPase van de parasitaire Protist Trypanosoma brucei

Dit protocol isoleert extracellulaire blaasjes (Ev's) uit de buurt van virionen met hoge efficiëntie en opbrengst door het opnemen van EV-neerslag, dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie en deeltjes opname om een gestroomlijnde workflow en een reductie van start volume vereisten, resulterend in reproduceerbare preparaten voor gebruik in alle EV-onderzoek.

Zuivering van extracellulaire vesikel preparaten met hoge opbrengst uit de buurt van het virus

Dit protocol beschrijft een zuiveringsmethode voor recombinant tag-vrij calcium bindend proteïne S100A12 en de ionen-geïnduceerde oligomeren voor humane monocyt stimulatie testen.

Zuivering van de menselijke S100A12 en de ionen-geïnduceerde oligomeren voor Immuuncelstimulatie

Het protocol beschrijft de bereiding van celmembraanaffiniteitschromatografie (CMAC) kolommen met geïmmobiliseerde celmembraanfragmenten die functionele transmembraantropomyosinekinasereceptor B-eiwitten bevatten. Het gebruik van CMAC-kolommen bij de identificatie van gespecialiseerde plantenmetabolieten die interageren met deze receptoren en aanwezig zijn in complexe natuurlijke mengsels wordt ook uitgelegd.

Cellulaire membraanaffiniteitschromatografiekolommen om gespecialiseerde plantenmetabolieten te identificeren die interageren met geïmmobiliseerde tropomyosinekinasereceptor B

Bacteriën scheiden nanometergrote extracellulaire blaasjes (EV's) af die bioactieve biologische moleculen dragen. EV-onderzoek richt zich op het begrijpen van hun biogenese, rol in microbe-microbe en gastheer-microbe interacties en ziekte, evenals hun potentiële therapeutische toepassingen. Een workflow voor schaalbare isolatie van EV's van verschillende bacteriën wordt gepresenteerd om standaardisatie van EV-onderzoek te vergemakkelijken.

Schaalbare isolatie en zuivering van extracellulaire blaasjes van Escherichia coli en andere bacteriën

Leer de zuivering van Afrikaanse trypanosomen uit bloed met behulp van DEAE-cellulose anion-wisselaars. Deze methode verbetert de diagnostiek van slaapziekte en levert zuivere parasieten voor immunologisch en biochemisch onderzoek.

Zuivering van extracellulaire trypanosomen, met inbegrip van Staten in Afrika, van bloed door Anion-wisselaars (Diethylaminoethyl-gemengd met cellulose kolommen) (Video) | JoVE Journal

Zuivering van extracellulaire trypanosomen, met inbegrip van Staten in Afrika, van bloed door Anion-wisselaars (Diethylaminoethyl-gemengd met cellulose kolommen)

Meer video's verkennen