Controle van Hippo signalering Pathway activiteit met behulp van een Biosensor Luciferase gebaseerde grote Tumor Suppressor (LATS)

Mijn lab heeft de rol van Hippo pad in borst-en longkanker bestudeerd, en onlangs hebben we een nieuwe biosensor ontwikkeld om Hippo signalering activiteit te controleren. Deze methode kan worden gebruikt om belangrijke vragen over cellulaire signalering netwerken te beantwoorden, zoals hoe de Hippo route reageert op factoren en hoe het interageert met andere signalering trajecten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is de grote gevoeligheid en ook het grote aantal monsters kan snel en gelijktijdig worden verwerkt.

Deze techniek heeft diverse toepassingen in fundamenteel en translationeel onderzoek om regelgevers van de Hippo signaleringsroute zowel in vitro als in vivo te onderzoeken. Om te beginnen, mini-prep LATS-BS plasmiden vers van DH5-Alpha bacteriën vloeibare cultuur. Een uur voor de transfectie, aspirate het medium van de plaat, en voeg 500 microliters van groeimedium aan elke put.

Een belangrijk punt is dat LATS biosensor vers moet worden bereid om maximale expressie en activiteit te krijgen. Ook wordt aanbevolen om altijd een upstream regulator van de Hippo-route, zoals MSD, te gebruiken als een positieve controle bij het uitvoeren van luciferase-test. Breng hierna de cellen terug naar de couveuse.

Bereid vervolgens oplossing A, een DNA-oplossing en oplossing B, een verdund polymeer-gebaseerde transfectiereagensage, zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg hierna onmiddellijk oplossing B toe aan oplossing A enpipet voorzichtig op en neer om te mengen. Incubeer het monster 15 minuten op kamertemperatuur om de transfectiecomplexen te laten ontstaan.

Voeg vervolgens het totale volume van transfectie complexen drop-wise aan elke put van de plaat met zachte wervelende. Broed de cellen 's nachts bij 37 graden Celsius. De volgende dag verwijdert u de transfectiecomplexhoudende media en vervangt u deze door verse volledige media.

Dan cultuur de cellen op 37 graden Celsius voor een dag. Verdun een passende hoeveelheid 5x Passieve lysebuffer met gedestilleerd water. Dan, volledig aspirate de media van de plaat.

Voeg een milliliter PBS aan elke put, en draai de plaat zachtjes om losstaande cellen en resterende groeimedia te verwijderen. Dan aspirate de PBS volledig. Voeg vervolgens 250 microliter van 1xPLB toe aan elke put.

Plaats de kweekplaat gedurende 15 minuten op een schommelplatform om een gelijkmatige dekking van de celmonolaag met PLB te garanderen. Breng hierna het lysaat over naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Verwijder de LAR-2 uit de 80 graden Celsius opslag, en equilibrate het op kamertemperatuur.

Bereid vervolgens renilla-detectiereagens voor op een geschikte hoeveelheid tests. Voeg het Renilla detectiereagens toe aan 50x substraat en de buffer. Vervolgens 10 microliter van elke cel lysaat in 1,5 milliliter buizen.

Programmeer vervolgens een luminometer om een vertraging van twee seconden voor de meting uit te voeren, gevolgd door een meetperiode van 10 seconden. Breng voorzichtig 20 microliter LAR-2-reagens in één buis en snel op en neer om te mengen. Plaats vervolgens onmiddellijk de buis in de luminometer en start de meting.

Na de meting, verwijder de monsterbuis van de luminometer, voeg 20 microliter renilla reagens, en pipet op en neer te mengen. Plaats vervolgens het monster in de luminometer en start de volgende meting. Ten eerste, cultuur, loskoppelen, tellen, en plaat HEK293 Ad-cellen zoals beschreven in het tekstprotocol.

Dan, een uur voor transfectie, aspirate de media van de plaat en vervang het door vijf milliliter verse volledige groeimedia. Voeg ten slotte verdunde oplossing B toe aan oplossing A en pipet op en neer om te mengen. Vervolgens, incubeer het monster op kamertemperatuur gedurende 15 minuten voor het toevoegen van het totale volume van de transfectie complexen aan de plaat, terwijl zachtjes wervelen.

Broed de cellen 's nachts bij 37 graden Celsius. De volgende dag, trypsinize en tel de cellen. Plaat 10, 000 tot 20.000 cellen in elke put van een 96-put plaat in een totaal volume van 100 microliters van media per put.

Daarna, incubeer de cellen voor een dag. Een tot vier uur voorafgaand aan het uitvoeren van de luciferase test, voeg middelen mogelijk reguleren van de Hippo pad, bij een uiteindelijke concentratie van 10 micromolar per put. Vervolgens, aspirate de media volledig uit de cellen en was de cellen in elke put met 100 microliters van PBS.

Voeg vervolgens 20 microliter PLB toe aan elke put. Plaats de cultuurplaat 15 minuten op een schommelplatform. Breng vervolgens 20 microliter LAR-2-reagens over op elke put van de plaat en pipet op en neer om te mengen.

Plaats de plaat onmiddellijk na deze in een plaat-reading luminometer en start de meting. In het eerste deel van dit protocol werd de LATS-BS gecotransfecteerd met verschillende genen om hun effect op LATS kinase activiteit te evalueren. In het tweede protocol werd LATS-BS omgezet in HEK293-Ad, en de cellen werden doorgegeven in 96-put platen.

40 uur na de transfectie werden de cellen behandeld met verschillende bekende kleine moleculen van Hippo signalering, gevolgd door een luciferase test. Bij de interpretatie van de resultaten van deze tests moet worden opgemerkt dat eiwitten en medicamenteuze behandelingen feedbacktrajecten kunnen activeren die de activiteit van biosensoren beïnvloeden. Verdere experimenten zullen nodig zijn om een relatie tussen de kandidaat en de Hippo signalering route te bevestigen.

Na deze procedure kunnen andere methoden zoals kwantitatieve Real-Time PCR, of Western Blot, worden gebruikt om aanvullende vragen over LATS kinase activiteit te beantwoorden. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor de onderzoekers op het gebied van kankerbiologie om de dynamiek en activiteit van LATS kinase en Hippo signaleringstraject in vele biologische en biochemische processen te verkennen. Vergeet niet dat geneesmiddelen voor screening zeer gevaarlijk kunnen zijn, en passende voorzorgsmaatregelen moeten altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.