Co-immunoprecipitation Assay voor het bestuderen van functionele interacties tussen receptoren en enzymen

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van celsignalering, zoals het belang van verschillende eiwitdomeinen in receptorenzyminteractie en enzymatische activering. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het gelijktijdig testen van receptorenzym interacties en de functionele gevolgen van deze interactie op de enzymactiviteit mogelijk maakt. Gebruik voor elke plaat 10 milliliter DMEM aangevuld met 10%FBS en 1%penicilline en streptomycine.

De dag voor transfectie, zaad menselijke embryonale nier 293-T cellen in 12 10-centimeter platen met behulp van een hemocytometer om de cellen te tellen. Incubeer bij 37 graden Celsius in 5%C02. Zodra de cellen zijn 80 tot 90%confluent, gebruik maken van een lipide-gebaseerde transfectie agent om vijf van de platen transfecteren.

Voer de transfectie uit volgens de instructies van de fabrikant voor hechtingscellen in platen van 10 centimeter. Transfect een identieke tweede set van vijf platen samen met een extra plaat die dient als een niet-onverleidingde controle voor de meting van de uitgedrukte eiwithoeveelheid vóór de immunoprecipitatie. Incubeer de doorgeïnfecteerde platen in een weefselkweek incubator bij 37 graden Celsius in 5%CO2 gedurende 48 uur.

Gebruik een fluorescerende microscoop om de cellen te onderzoeken op GFP-expressie en ervoor te zorgen dat de transfectie met succes is opgetreden. Meng 15 microliter van 100-millimolar natriumortovanadate met 50 microliter van 30% waterstofperoxide om een vers pervaniënaatmengsel te bereiden. Als u de getagde versies van PD-1 wilt fosforyleren, verwijdert u de media uit de transfected cellen PD-1-GFP.

Voeg 10 milliliter gewone DMEM en 10 microliter pervanadate toe aan elke plaat. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Daarna was je de cellen drie keer in ijskoude PBS met vijf milliliter PBS per wasbeurt.

Tijdens het uitvoeren van immunoprecipitatie moeten alle stappen worden uitgevoerd op ijs of bij vier graden Celsius. Vul de lysisbuffer aan met proteaseremmers door één tablet van de remmers op te lossen in 10 milliliter buffer. Voeg ook een millimolar natrium orthovanadate toe aan de buffer die zal worden gebruikt op de PD-1-GFP-transfected platen.

Voeg 500 microliters ijskoude lysebuffer toe aan de cellen, zorg ervoor dat de lysebuffer met de natriumortovanadate alleen wordt toegevoegd aan de platen die PD-1-GFP-transfected cellen bevatten. Gebruik een celschraper om de cellen onmiddellijk van de platen te verwijderen en op te halen. Breng de lysates in 1,5 milliliter koude buizen en draai ze op 0,005 keer de zwaartekracht en op vier graden Celsius gedurende 30 minuten.

Om de post-kernen supernatant van de lysates te verzamelen, draai ze naar beneden op 10,000 keer zwaartekracht en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Breng de supernatants in nieuwe buizen en gooi de pellet. Bewaar de supernatants voor de tweede set van zes platen op ijs voor latere WCL-analyse.

Om te beginnen met het voorbereiden van anti-GFP kralen, schud voorzichtig de fles met de kralen voor het openen om te voorkomen dat de afwikkeling. Verwijder 40 microliter van de anti-GFP kralen uit de drijfmest per aandoening. Centrifuge bij 500 keer zwaartekracht en vier graden Celsius gedurende drie minuten.

Verwijder de supernatant om de kralen te wassen, zorg ervoor dat het contact tussen de pipet en de kralen te minimaliseren om verlies te voorkomen. Resuspend de kralen in 80 microliter lysis buffer per monster. Voeg de gewassen kralen direct toe aan de cellysaat van de PD-1-GFP-uitdrukkende cellen van de eerste set van vier platen.

Draai bij 0,005 keer zwaartekracht gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius om de GFP-gelabelde eiwitten te immunoprecipitaten. Was de kralen drie keer met behulp van een milliliter koude lyse buffer die geen orthovanadate bevat voor elke wasbeurt. Dan centrifugeren op 2,500 keer zwaartekracht gedurende 10 seconden.

Verdeel het lysaat van de actieve SHP2 van de eerste set platen in drie gelijke porties en voeg een deel toe aan elk van de drie buizen met de gewassen PD-1-GFP-bevattende kralen. Voeg 1/3 van het lysaatvolume van de niet-getransfecteerde cellen toe aan de tweede buis van de wild-type PD-1-GFP kralen. Gooi de resterende 2/3 weg.

Broed de kralen vier uur lang bij vier graden Celsius met zachte rotatie bij 0,005 keer zwaartekracht. Na deze, was de kralen twee keer met behulp van een milliliter koude lyse buffer voor elke wasbeurt. Voeg 80 microliter lysebuffer toe aan elk monster, zodat het totale volume in elke buis 100 microliters is.

Met behulp van een gesneden pipet tip, pipet zachtjes op en neer te mengen. Breng vervolgens 50 microliter van elke buis over in twee, verse, 1,5 milliliter buizen. Was de kralen eenmaal met fosfatase wasbuffer.

Verwijder vervolgens de supernatant volledig. Voeg 100 microliter testbuffer toe aan de kralen en broed gedurende 30 minuten bij 30 graden Celsius onder zachte agitatie. Wanneer de buffer geel wordt, beëindigt u de reactie door 50 microliter van één molaire oplossing van natriumhydroxide toe te voegen.

Centrifuge bij 2,500 keer zwaartekracht gedurende 10 seconden. Breng hierna de supernatant over in twee putten van het halve gebied in een 96-putplaat. Lees de absorptiesten op 405 nanometer en druk de resultaten uit als relatieve optische dichtheid over de controle wild-type versie van PD-1-GFP.

Draai eerst de kralen naar beneden bij 2.000 keer zwaartekracht en vier graden Celsius gedurende 30 seconden en verwijder de supernatant. Voeg 20 microliter van twee keer Laemmli buffer en kook op 95 graden Celsius gedurende vijf minuten. Met behulp van een BCA kit meet u de eiwitconcentratie van de inputcontroles.

Breng 30 microliter van het meest verdunde monster over naar een nieuwe buis. Gebruik lysisbuffer om de rest van de inputbesturingselementen te verdunnen tot dezelfde concentratie als het meest verdunde monster. Breng vervolgens 30 microliter van elk van de verdunde inputregelaars over naar een nieuwe buis.

Voeg gelijke volumes van twee keer Laemmli buffer aan de lysates en kook ze 95 graden Celsius gedurende vijf minuten. Draai hierna gedurende 30 seconden de kralen op 2.000 keer zwaartekracht en vier graden Celsius af voordat u western blot-analyse uitvoert, zoals beschreven in het tekstprotocol. In deze studie wordt een gecombineerde co-immunoprecipitatie en enzymatische activiteitstest ontwikkeld voor de parallelle beoordeling van receptorenzyminteracties en -activering.

Het is dan ook niet verwonderlijk dat SHP2 zich niet aan PD-1 heeft gebonden toen ITSM werd gemuteerd. Opmerkelijk is dat de mutantversie van de ITIM SHP2-binding slechts in beperkte mate remde. Niettemin blijkt uit de SHP2-fosfatase-activiteitstest dat ITIM en ITSM even onmisbaar zijn voor de enzymatische activiteit.

Dit onthult een activeringsmodel in twee stappen waarin SHP2 onder rustomstandigheden is opgevouwen tot een autoinhibiteerde conformatie. Na activering van PD-1 wordt SHP2 aangeworven voor het fosforyleerde ITSM. Het ITIM moet echter ook worden gefossyleerd om SHP2 in zijn actieve conformatie te ontvouwen.

Na de ontwikkeling ervan kan deze techniek de weg vrijmaken voor onderzoekers op het gebied van celsignalering om de functie van eiwitdomeinen in receptor-enzyminteracties te verkennen.