Reverse transcriptie-lus-gemedieerde isotherme amplificatie (RT-LAMP) Assay voor Zika-Virus en huishouden genen in Urine, Serum en Mosquito monsters

Deze methode kan snel bepalen of monsters zikavirus bevatten. Dit is handig voor zwangere vrouwen, koppels proberen zwanger te worden, of toezicht op de lokale muggenpopulaties die risico lopen op Zika-infectie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het snel, gemakkelijk, vereist geen dure apparatuur, en kan worden gedaan zonder een RNA isolatie stap.

De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot de diagnose van Zika-infectie, omdat infectie tijdens de zwangerschap is gekoppeld aan een miskraam, doodgeboorte, en andere ernstige aangeboren, neurologische aangeboren afwijkingen. Hoewel deze methode inzicht kan geven in Zika, kan het ook worden toegepast op andere infectieziekten zoals dengue, chikungunya of West Nile virus met behulp van virus-specifieke primers. Om te beginnen reconstrueren elke RT-LAMP primer in moleculair water tot een uiteindelijke concentratie van 100 micromolar.

Kort vortex de primer oplossing om ervoor te zorgen dat de oplossing homogeen is. Centrifuge ongeveer vijf seconden op maximale snelheid om de primer oplossing te verzamelen. Bereid vervolgens een 10x RT-LAMP primer mix zoals beschreven in tabel twee van het protocol van de tech.

Vortex kort om homogeniteit te garanderen. En centrifuge kort op maximale snelheid om verlies te voorkomen. Bewaar de primers op min 20 graden Celsius, tussen het gebruik, het vermijden van eventuele vries-dooi cycli.

Voor menselijke urinemonsters, gebruik ofwel verse urine, bevroren urine of urine in conserveermiddel. Ontdooi bevroren monsters op ijs voor gebruik. Menselijke serummonsters moeten vers of bevroren zijn, terwijl met ZIKV geïnfecteerde cellijnen geconditioneerde media of cellysaten moeten bevatten.

Tot slot, voor Aedes aegypti muggen, gebruik hele karkassen, hetzij vers of bevroren. Ontdooi bevroren muggenkarkassen op ijs. Plaats een individuele mug in 100 microliter pbs.

Met behulp van een P10 pipet tip verpletteren de mug 10 keer, en homogeniseren om een ruwe mug lysate te creëren. Vercentrifugeer het ruwe lysaat kort om vuil te pelleteren en gebruik de supernatant voor downstream RT-LAMP analyse. Om te beginnen, een RT-LAMP master mix reactie op ijs voor elke primer set worden gebruikt, zoals overzicht door tabel drie in het protocol van de tech.To begin, prepare a RT-LAMP master mix reaction on ice for each primer set to be used, as outline by table three in the tech's protocol.

Vortex elk monster om ervoor te zorgen dat het goed gemengd. Draai ze vervolgens kort naar beneden om volumeverlies te voorkomen. Voor elke reactie, pipet 23.0 microliter van de RT-LAMP master mix in een 200 microliter PCR buis.

Voeg vervolgens twee microliter van het monster toe om het totale volume op 25,0 microliter te brengen. Gebruik moleculair water voor de negatieve controle, en zorg ervoor dat een positieve controle op te nemen. Optioneel, omvatten een specificiteit controle reactie van een verwante arbovirus zoals dengue virus, zoals beschreven in het protocol van tech.

Verwarm de monsters met behulp van een warmteblok, waterbad of een thermocycler gedurende 30 minuten op 61 graden Celsius. Verhoog hierna de warmte 10 minuten lang tot 80 graden Celsius om de polymerase te verwarmen. Voer de RT-LAMP-analyse uit in een aparte afgesloten ruimte.

Verdun de fluorescerende nucleïnezuurverfstof een tot tien in de TAE-buffer. Voeg twee micorliters van de fluorescerende nucleïnezuurverfoplossing toe aan 12 micorliters van de RT-LAMP-reactie. Beoordeel de RT-LAMP reacties visueel door te zoeken naar de aanwezigheid van een kleurverandering.

Optioneel gebruik maken van een camera om foto's van RT-LAMP reacties te nemen op een witte achtergrond. Plaats vervolgens de monsters onder een 302 nanometer UV-licht om de aanwezigheid van RT-LAMP producten door fluorescentie te bevestigen. Gebruik een camera om een foto van het resultaat te maken.

Om te beginnen met het uitvoeren van elektroforese giet 2%agarose gel in 1x TAE buffer met een nucleïnezuur vlek voor visualisatie. Voeg vijf microliter van een DNA-ladder toe in de eerste rijstrook om de moleculaire gewichten te vergelijken. Meng voor elke RT-LAMP-reactie 13 microliters rt-lampreactiemengsel met twee microliters van DNA-ladingskleurstof.

Laad dit mengsel van 15 microliter. Voer de gel op 90 volt gedurende 90 minuten of totdat de banden zijn gescheiden. Een beeld met 302 nanometer UV-licht.

Gooi na afloop rt-lampreacties weg in dubbel verzegelde zakken. In deze studie worden drie verschillende methoden gebruikt om RT-LAMP reacties te analyseren. Bij het gebruik van fluorescerende nucleïnezuur kleurstof positieve reacties geel-groen van kleur, terwijl negatieve reacties oranje lijken.

Deze kleurstof resulteert ook in een fluorescerend signaal wanneer monsters worden opgewekt door UV-licht. Ten slotte kunnen RT-LAMP reacties worden opgelopen op een agarose gel. Positieve RT-LAMP reacties zullen een banding patroon hebben, terwijl negatieve reacties geen DNA-banden zullen hebben.

Deze methoden worden gebruikt om de specificiteit van de ZIKV RT-LAMP reactie aan te tonen. Alleen de ZIKV moleculaire controle heeft een positieve RT-LAMP reactie. Bovendien, terwijl ZIKV wordt gedetecteerd in zowel de urine en serum van een patiënt met een bekende ZIKV-infectie, wordt het niet gezien bij de asymptomatische controlepatiënt zonder ZIKV-infectie.

De monsters worden vervolgens getest op menselijke 18S rRNA. Alleen de monsters van patiënten worden als positief beschouwd voor 18S rRNA. Muggenmonsters kunnen op dezelfde manier worden getest op ZIKV of de RT-LAMP kwaliteitscontrole AEDAE.

Alleen de positieve moleculaire controle voor ZIKV en de met ZIKV geïnfecteerde mug worden als positief beschouwd voor ZIKV. Maar alle muggen zijn positief voor AEDAE door RT-LAMP. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek worden gedaan in minder dan 30 minuten als het goed wordt uitgevoerd.

Het is belangrijk om te onthouden dat RT-LAMP reacties gevoelig zijn voor vals positieve reacties. Preventie stappen omvatten het gebruik van een thermolabiel uracil DNA glycosylase in reacties, met behulp van een laterale workflow, het uitvoeren van analyse in een aparte ruimte, en het verminderen van tijd post versterking buizen zijn open. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals QPCR worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals hoeveel kopieën het virus of andere doelen in het monster aanwezig zijn.

Na het bekijken van deze video, moet u een goed begrip van hoe RT-LAMP te gebruiken om Zika virus en doel controles in menselijke urine en serum, evenals muggen te detecteren. Vergeet niet dat het werken met het Zika-virus en nucleïnezuurvlek zeer gevaarlijk kan zijn, en voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van handschoenen moeten altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure. Gezien de associatie van Zika virusinfectie met aangeboren afwijkingen, vrouwen die zwanger zijn, proberen op te vatten, of partners van deze vrouwen, moet aanzienlijk minimaliseren hun laboratorium blootstelling aan Zika virus.