Name: Reverse transcriptie-lus-gemedieerde isotherme amplificatie (RT-LAMP) Assay voor Zika-Virus en huishouden genen in Urine, Serum en Mosquito monsters (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Leer RT-LAMP voor snelle detectie van Zika-virus in urine, serum en muggen zonder RNA-isolatie. Deze kosteneffectieve methode levert resultaten in ongeveer 30 minuten en ondersteunt surveillance van infectieziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de Maureen en Ronald Hirsch familie filantropische bijdrage en veld Neurosciences Institute, St. Mary's van Michigan. De financiers had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling en analyse, besloten tot bekendmaking of voorbereiding van het manuscript. Wij danken ook Dr. Bernadette Zwaans en Elijah Ward voor hun kritische evaluatie van het manuscript.

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Review Board (IRB) van Beaumont gezondheid. Alle experimenten werden uitgevoerd volgens de relevante richtlijnen en verordeningen.
Let op: Alle mogelijk besmettelijke materialen moeten worden behandeld volgens de normen van bioveiligheid niveau 2 met inbegrip van het gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen. Alle procedures die aërosols kunnen produceren moeten worden uitgevoerd in een kabinet bioveiligheid. Bovendien moet werken met levende muggen worden uitgevoerd in het hiervoor geschikte faciliteit Arthropod Containment Level 1-3. Gezien de vereniging van ZIKV besmetting met aangeboren afwijkingen, moeten vrouwen die zwanger zijn, proberen te bedenken, of de partners van deze vrouwen aanzienlijk beperken hun laboratorium blootstelling aan ZIKV. Transport van ZIKV monsters is ingedeeld in de Verenigde Staten als categorie B biologische stoffen overeenkomstig afdeling of vervoer gevaarlijke materialen Regulations (49 CFR Part 171-180) en daarom verzending monsters moet voldoen aan de richtsnoeren. Invoer in de Verenigde Staten van ZIKV biospecimens vereist een Centers voor Disease Control and Prevention (CDC) invoervergunning. Importeren van een geleedpotigen die dienen kunnen als een vector voor de ZIKV overdracht, zelfs als zij niet zijn besmet, een vergunning van het Amerikaanse ministerie van landbouw (USDA vereist). Deze informatie is bijgewerkt op het moment van publicatie. Actuele aanbevelingen kunnen gevonden worden op https://www.cdc.gov/zika/laboratories/lab-safety.html.
Opmerking: RT-LAMP reacties zijn onderhevig aan hogere tarieven van valse positieve reacties, dus voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen bij de planning van de experimentele. Alle opzet en uitvoering van RT-LAMP reacties moeten gebruiken aangewezen pipetten en tips van de filter. In het ideale geval moet een laterale werkstroom worden vastgesteld. Indien mogelijk, plaatsvindt analyse en beeldvorming (sectie 5) in een aparte afgesloten ruimte om verontreiniging te voorkomen. Opening van reageerbuisjes met RT-LAMP producten moet tot een minimum worden beperkt.
1. de RT-LAMP Primer voorbereiding
<ol><li>Reconstrueren elke gelyofiliseerd RT-LAMP primer in moleculaire rang water met een eindconcentratie van 100 µM (tabel 1). Kort vortex de primer oplossing kort spin down de oplossing bij maximale snelheid in een centrifuge tafelblad voor het verzamelen van alle primer oplossing te zorgen voor een homogene oplossing.</li>
	<li>Bereiden van een 10 x RT-LAMP Primer Mix van de inleidingen van het FIP, BIP F3, B3, LF en LB met behulp van de volumes in tabel 2. Kort vortex de primer oplossing te zorgen voor een homogene oplossing kort draaien onderaan de oplossing bij maximale snelheid in een tafelblad centrifuge om verlies te voorkomen. Opmerking: De primer van de RT-LAMP instellen voor Ae. aegypti actine (AEDAE) bevat geen een LB-primer (lus inleidingen is niet altijd noodzakelijk voor RT-LAMP reacties). In dit geval vervangen door het volume van de primer LB moleculaire rang water.</li>
	<li>Opslaan van de inleidingen bij-20 ° C tussen toepassingen en Vermijd gratis-dooi cyclus.</li>
</ol>2. de monstervoorbereiding
<ol><li>
Voor menselijke urine monsters: Gebruik verse urine, bevroren urine of urine in conserveermiddel. Voor verse of bevroren monster: onmiddellijk spin naar beneden van het monster na de collectie voor 10 min 700 x gen gebruiken van het supernatant voor analyse of bevriezen bij-80 ° C voor toekomstig gebruik. Ontdooi bevroren monsters op ijs vóór gebruik.</li>
	<li>
Voor menselijk serummonsters: Beide vers of bevroren serummonsters gebruiken</li>
	<li>
Voor ZIKV besmet cellijnen: geconditioneerde media of cel lysates gebruiken. Opmerking: Cel-vrije media van Ae geconditioneerd. albopictus C6/36 cellen 8 dagen na infectie kunnen als positieve controle worden gebruikt voor ZIKV RT-LAMP reacties.</li>
	<li>
Voor Ae. aegypti muggen: gebruiken beide hele vers of bevroren mug karkassen. Ontdooi bevroren muggen op het ijs. Een ruwe mug lysate bereiden door het plaatsen van een individuele mug in 100 µL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en meng door het pletten van de mug 10 keer met een P10 Pipetteer tip (Figuur 1). Kort centrifugeren van de ruwe lysate naar pellet puin. Gebruik het supernatant voor downstream RT-LAMP analyse. Opmerking: Positieve controles kunnen worden gegenereerd in een laboratorium-instelling door het infecteren van vrouwelijke muggen intrathoracale microinjection met ongeveer 103 genoom equivalenten van virus in een volume van 200 nL en het oogsten van de mug 5 dagen na infectie.</li>
</ol>3. voorbereiding van de RT-LAMP Master Mix
<ol><li>Een RT-LAMP master mix reactie op ijs bereiden voor elke primer ingesteld om te worden gebruikt met behulp van volume gids in tabel 3. Opmerking: Het gebruik van de thermolabile Uracil DNA Glycosylase (UDG) helpt bij het voorkomen van valse positieven.</li>
	<li>Vortex kort om ervoor te zorgen dat alle monsters goed vermengd zijn, draai vervolgens neer kort om volume verlies te voorkomen.</li>
</ol>4. RT-LAMP Assay
<ol><li>
Pipetteer 23,0 µL van de RT-LAMP master mix per reactie in een buis van 200 µL PCR. Voeg 2.0 µL van monster (urine, serum of ruwe mug lysate supernatant zoals beschreven in stap 2). Dit brengt het totale volume naar 25.0 µL per RT-LAMP reactie. Voor de negatieve controle, moleculaire rang water te gebruiken. Een positieve controle omvatten. Opmerking: Een PCR standard of virus voorraden van supernatant van besmette cellijnen kunnen als positieve controle worden gebruikt.<ol>
<li>Optioneel: Omvatten een specificiteit controle reactie van een verwante arbovirus zoals dengue virus (DENV). Voorbereiding van het monster zoals beschreven in stap 2 volgens monster type. 2.0 µL van het besturingselement specificiteit aan 23,0 µL van de RT-LAMP master mix in een buis van 200 µL PCR toevoegen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwarm de monsters bij 61 ° C gedurende 30 minuten met behulp van een blok van warmte, waterbad of thermocycler.</li>
	<li>De polymerase warmte deactiveren door verhitting tot 80 ° C gedurende 10 minuten.</li>
</ol>5. RT-LAMP analyse
Opmerking: RT-LAMP analyses uit te voeren in een apart, afgesloten ruimte.
<ol><li>
Na de incubatie, toegang tot RT-LAMP reacties visueel door te zoeken naar de aanwezigheid van een kleur te veranderen.
	<ol>
<li>Verdun het nucleïnezuur fluorescerende kleurstof 1:10 in TAE (40 mM Tris, azijnzuur 20 mM, 1 mM EDTA) buffer. Let op: Elke vlek van de nucleïnezuur bindt aan nucleïnezuren en daarom is een kankerverwekkende stof. Draag handschoenen bij hantering.</li>
		<li>Voeg aan 12 µL van de reactie van de RT-LAMP, 2 µL van nucleïnezuur fluorescerende kleurstof verdunning. Opmerking: Negatieve reacties worden oranje in kleur en positieve reacties zullen geel/groen van kleur.</li>
		<li>Optioneel: Neem foto's van RT-LAMP reacties op een witte achtergrond met behulp van een camera.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Leg de monsters onder 302 nm UV-licht om te bevestigen de aanwezigheid van RT-LAMP producten door fluorescentie. Maak foto van het resultaat met behulp van een camera. Opmerking: Positieve RT-LAMP reacties zal een fluorescerende uitgang hebben. Let op: Draag UV beschermende eye googles of gezicht schild bij het werken met UV-licht.</li>
	<li>
Optioneel: Bevestigen de aanwezigheid van RT-LAMP producten door te voeren van de Elektroforese van het gel op de monsters.
	<ol>
<li>Giet een 2% agarose gel in 1 x TAE buffer met een vlek van nucleic zuur voor visualisatie. Let op: Elke vlek van de nucleïnezuur bindt aan nucleïnezuren en daarom is een kankerverwekkende stof. Draag handschoenen bij hantering.</li>
		<li>Voeg 5 µL van een DNA-ladder in de eerste baan te vergelijken het molecuulgewicht.</li>
		<li>Meng 13 µL van het reactiemengsel RT-LAMP met 2 µL van DNA laden kleurstof voor elke reactie RT-LAMP. Het laden van het mengsel van de 15 µL met het DNA laden kleurstof.</li>
		<li>De gel bij 90 V gedurende 90 minuten of totdat de bands zijn gescheiden en afbeelding uitvoert met 302 nm UV-licht. Opmerking: Positieve RT-LAMP reacties zal hebben een laddering patroon. Negatieve reacties van de RT-LAMP moeten niet bevatten alle bands.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. de verwijdering
<ol><li>Beschikken over RT-LAMP reacties in dubbele verzegelde tassen. Doen niet autoclaaf als dit kan het aerosolize van de RT-LAMP producten, leiden tot valse positieve reacties in de toekomst.</li>
</ol>

<ol><li>Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. <a target="_blank" href="https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra1602113">Zika Virus.</a> New England Journal of Medicine. 374 (16), 1552-1563 (2016).</li>
<li>Francois, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustness+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+for+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+of+European+Microbiological+Societies+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications.</a> Federation of European Microbiological Societies Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).</li>
<li>Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29+of+gene+sequences+and+simple+visual+detection+of+products%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products.</a> Nature Protocols. 3 (5), 877-882 (2008).</li>
<li>Gandasegui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rapid-Heat+LAMPellet+Method%3A+A+Potential+Diagnostic+Method+for+Human+Urogenital+Schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">The Rapid-Heat LAMPellet Method: A Potential Diagnostic Method for Human Urogenital Schistosomiasis.</a> Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 9 (7), 0003963(2015).</li>
<li>Barkway, C. P., Pocock, R. L., Vrba, V., Blake, D. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25741643">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the species-specific detection of Eimeria that infect chickens.</a> The Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li>
<li>Lamb, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Detection+of+Zika+Virus+in+Urine+Samples+and+Infected+Mosquitos+by+Reverse+Transcription-Loop-Mediated+Isothermal+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rapid Detection of Zika Virus in Urine Samples and Infected Mosquitos by Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3803(2018).</li>
<li>Faye, O., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18674965">One-step RT-PCR for detection of Zika virus.</a> Journal of Clinical Virology. 43 (1), 96-101 (2008).</li>
<li>Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+inhibitors+-+occurrence%2C+properties+and+removal%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">PCR inhibitors - occurrence, properties and removal.</a> Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).</li>
<li>Poole, C. B., Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C., Carlow, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+brugian+filariasis+by+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of brugian filariasis by loop-mediated isothermal amplification.</a> Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 6 (12), 1948(2012).</li>
<li>Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+multiple+target+detection+in+real-time+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Simultaneous multiple target detection in real-time loop-mediated isothermal amplification.</a> Biotechniques. 53 (2), 81-89 (2012).</li>
<li>Chan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+Affordable+and+Portable+Medium-Throughput+Molecular+Device+for+Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rapid, Affordable and Portable Medium-Throughput Molecular Device for Zika Virus.</a> Scientific Reports. 6, 38223(2016).</li>
<li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+Highly+Sensitive+Molecular+Diagnosis+of+Zika+Virus+by+Lateral+Flow+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays.</a> Analytical Chemistry. 88 (24), 12272-12278 (2016).</li>
<li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-Cost+Detection+of+Zika+Virus+Using+Programmable+Biomolecular+Components%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li>
<li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instrument-Free+Point-of-Care+Molecular+Detection+of+Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus.</a> Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).</li>
<li>Yaren, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point+of+sampling+detection+of+Zika+virus+within+a+multiplexed+kit+capable+of+detecting+dengue+and+chikungunya%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Central+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya.</a> BioMed Central Infectious Diseases. 17 (1), 293(2017).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+detection+of+Zika+virus+by+reverse+transcription+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification.</a> Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).</li>
<li>Priye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+smartphone-based+diagnostic+platform+for+rapid+detection+of+Zika%2C+chikungunya%2C+and+dengue+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A smartphone-based diagnostic platform for rapid detection of Zika, chikungunya, and dengue viruses.</a> Scientific Reports. 7, 44778(2017).</li>
</ol>

LEL en MBC hebben intellectuele eigendom op Zika virus diagnose methoden. De resterende auteurs hebben geen concurrerende belangen.

De bepaling van ZIKV RT-LAMP in dit papier werkt met behulp van zowel de mens als de mug monsters6beschreven. De limiet van detectie was ongeveer 1 genoom gelijkwaardig6, dat voldoende moeten zijn zou aangezien de typische virale lading van een symptomatische patiënt van de ZIKV besmet 10 is3 te 106 PFU/mL7. Daarnaast kan deze methode ZIKV detecteren in monsters zonder eerste isoleren RNA en zonder versterking van vir...

In 2015, Zika-virus (ZIKV) die is opgedaan vooraanstaande wereldwijde aandacht als een besmettelijke ziekte van zorg omdat de infectie tijdens de zwangerschap was gekoppeld aan een miskraam, doodgeboorte, ernstige neurologische tekorten van de geboorte met inbegrip microcefalie, evenals andere aangeboren aangeboren afwijkingen1. In zeldzame gevallen geweest ZIKV geassocieerd met Guillain-Barré syndroom. ZIKV wordt vooral overgedragen door Aedes -muggen; het kan echter ook worden verspreid via seksueel contact1. Gezien het feit dat de infectie met ZIKV asymptomatisch in de meeste mensen of geschenken met milde griep-achtige symptomen die overlappen met de symptomen van infectie van andere arborviruses1, was er behoefte aan een verbeterde methoden voor snelle en kostenefficiënte detectie van ZIKV om het scherm zowel mensen als lokale mug populaties.
Kwantitatieve omgekeerde transcriptie PCR (qRT-PCR) is een betrouwbare test voor de opsporing van ZIKV; Deze techniek vereist echter duur gespecialiseerde apparatuur, opgeleid personeel en RNA isolatie uit de steekproef van belang. Omgekeerde transcriptie lus-gemedieerde isotherme amplificatie (RT-LAMP) is een one-step nucleïnezuur amplificatie methode gebaseerd op technologie van PCR die slechts één incubatietemperatuur als gevolg van het gebruik van een thermophilic polymerase van DNA met strand vereist de eigenschappen van de verplaatsing. Dit omzeilt de behoefte aan een thermocycler en vermindert de lengte van de tijd die nodig is voor het voltooien van de test. Extra voordelen van RT-LAMP zijn haar hoge specificiteit, de gevoeligheid en de robuustheid bij een bereik van pH niveaus en temperaturen en weerstand tegen vele PCR remmers2. Het heeft een relatief lage kostprijs en reagentia zijn stabiel bij kamertemperatuur. Gegeven deze kenmerken, kan RT-LAMP worden geïmplementeerd in een laboratorium of in het veld. Als zodanig, zijn LAMP reacties ontwikkeld voor het detecteren van een scala van ziekteverwekkers en andere soorten infectie3,4,5. Het doel van het protocol van de RT-LAMP in dit artikel wordt beschreven is om ZIKV detecteren zonder RNA isolatie in menselijk serum en de urine monsters zo goed als in een enkele geïnfecteerde mug binnen 30 min door RT-LAMP. Deze methode kan worden gebruikt ter vervanging van qRT-PCR, want het is een gevoelige en snelle diagnostische tool die snel en in instellingen buiten het laboratorium werkt.

<table><tbody><tr><td>Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0537S</td><td></td></tr><tr><td>Isothermal Amplification Buffer&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>B0537S</td><td></td></tr><tr><td>WarmStart RTx Reverse Transcriptase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0380S</td><td></td></tr><tr><td>Antarctic Thermolabile UDG</td><td>New England Biolabs</td><td>M0372S</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>New England Biolabs</td><td>B1003S</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dATP Solution</td><td>New England Biolabs</td><td>N0440S</td><td>Deoxynucleotide Set N0446S</td></tr><tr><td>100 mM dCTP Solution</td><td>New England Biolabs</td><td>N0441S</td><td>Deoxynucleotide Set N0446S</td></tr><tr><td>100 mM dTTP Solution</td><td>New England Biolabs</td><td>N0443S</td><td>Deoxynucleotide Set N0446S</td></tr><tr><td>100 mM dGTP Solution</td><td>New England Biolabs</td><td>N0442S</td><td>Deoxynucleotide Set N0446S</td></tr><tr><td>100 mM dUTP Solution</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0133</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S7563</td><td></td></tr><tr><td>Nancy-520</td><td>Sigma Aldrich</td><td>01494</td><td></td></tr><tr><td>Low DNA Mass Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>10-068-013</td><td></td></tr><tr><td>Zika Postive Control</td><td>Robert Koch Institute, Germany</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1600</td><td></td></tr><tr><td>BlueJuice Gel Loading Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>10816015</td><td></td></tr><tr><td>Primers</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Custom Oligo</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free Water</td><td>Ambion</td><td>AM9938</td><td></td></tr><tr><td>Urine Preservative</td><td>Norgen Biotek</td><td>18126</td><td></td></tr><tr><td>ZIKV PCR Standard</td><td>Robert Koch Institute</td><td>N/A</td><td>Vero E6 cell supernatants</td></tr><tr><td>DENV2 New Guinea C Control</td><td>Connecticut Agricultural Experiment Station</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

reverse transcriptie-lus-gemedieerde isotherme amplificatie (rt-lamp) assay voor zika-virus en huishouden genen in urine, serum en mosquito monsters

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Infectie met Zika-virus (ZIKV) kan asymptomatisch bij volwassenen, echter de infectie tijdens de zwangerschap kan leiden tot miskraam en ernstige neurologische tekorten van de geboorte. Het doel van dit protocol is te snel opsporen van ZIKV in zowel de mens als de mug monsters. De huidige gouden standaard voor ZIKV-detectie is kwantitatieve omgekeerde transcriptie PCR (qRT-PCR); omgekeerde transcriptie lus-gemedieerde isotherme amplificatie (RT-LAMP) kan toestemming geven voor een meer efficiënte en goedkope testen zonder de noodzaak voor dure apparatuur. In deze studie, wordt RT-LAMP gebruikt voor de detectie van de ZIKV in verschillende biologische monsters binnen 30 min, zonder eerste isoleren RNA van het monster. Deze techniek wordt aangetoond met behulp van ZIKV geïnfecteerde patiënt urine en serum, en besmette mug monsters. 18s ribosomal RNA zuur en actine worden gebruikt als besturingselementen in mens- en muskietenhuif monsters, respectievelijk.

RT-LAMP reacties kunnen worden geanalyseerd met behulp van drie verschillende methoden. Ten eerste, met de toevoeging van een nucleïnezuur fluorescerende kleurstof, positieve reacties zullen geel/groen van kleur waar negatieve reacties oranje in kleur met het blote oog wordt weergegeven. Ten tweede, de toevoeging van de fluorescerende nucleïnezuur kleurstof naar RT-LAMP reactie resulteert in een fluorescent signaal wanneer de monsters zijn opgewonden door UV-licht. Negatieve reacties zal ...

Dit protocol biedt een efficiënte en goedkope methode speurder Zika virus te bepalen van doelen in menselijke urine en serum monsters of muggen door omgekeerde transcriptie lus-gemedieerde isotherme amplificatie (RT-LAMP). Deze methode vereist geen RNA isolatie en kan worden gedaan binnen 30 min.

Reverse transcriptie-lus-gemedieerde isotherme amplificatie (RT-LAMP) Assay voor Zika-Virus en huishouden genen in Urine, Serum en Mosquito monsters

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

Deze methode kan snel bepalen of monsters zikavirus bevatten. Dit is handig voor zwangere vrouwen, koppels proberen zwanger te worden, of toezicht op de lokale muggenpopulaties die risico lopen op Zika-infectie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het snel, gemakkelijk, vereist geen dure apparatuur, en kan worden gedaan zonder een RNA isolatie stap.De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot de diagnose van Zika-infectie, omdat infectie tijdens de zwangerschap is gekoppeld aan een miskraam, doodgeboorte, en andere ernstige aangeboren, neurologische aangeboren afwijkingen. Hoewel deze methode inzicht kan geven in Zika, kan het ook worden toegepast op andere infectieziekten zoals dengue, chikungunya of West Nile virus met behulp van virus-specifieke primers. Om te beginnen reconstrueren elke RT-LAMP primer in moleculair water tot een uiteindelijke concentratie van 100 micromolar.Kort vortex de primer oplossing om ervoor te zorgen dat de oplossing homogeen is. Centrifuge ongeveer vijf seconden op maximale snelheid om de primer oplossing te verzamelen. Bereid vervolgens een 10x RT-LAMP primer mix zoals beschreven in tabel twee van het protocol van de tech.Vortex kort om homogeniteit te garanderen. En centrifuge kort op maximale snelheid om verlies te voorkomen. Bewaar de primers op min 20 graden Celsius, tussen het gebruik, het vermijden van eventuele vries-dooi cycli.Voor menselijke urinemonsters, gebruik ofwel verse urine, bevroren urine of urine in conserveermiddel. Ontdooi bevroren monsters op ijs voor gebruik. Menselijke serummonsters moeten vers of bevroren zijn, terwijl met ZIKV geïnfecteerde cellijnen geconditioneerde media of cellysaten moeten bevatten.Tot slot, voor Aedes aegypti muggen, gebruik hele karkassen, hetzij vers of bevroren. Ontdooi bevroren muggenkarkassen op ijs. Plaats een individuele mug in 100 microliter pbs.Met behulp van een P10 pipet tip verpletteren de mug 10 keer, en homogeniseren om een ruwe mug lysate te creëren. Vercentrifugeer het ruwe lysaat kort om vuil te pelleteren en gebruik de supernatant voor downstream RT-LAMP analyse. Om te beginnen, een RT-LAMP master mix reactie op ijs voor elke primer set worden gebruikt, zoals overzicht door tabel drie in het protocol van de tech.To begin, prepare a RT-LAMP master mix reaction on ice for each primer set to be used, as outline by table three in the tech's protocol.Vortex elk monster om ervoor te zorgen dat het goed gemengd. Draai ze vervolgens kort naar beneden om volumeverlies te voorkomen. Voor elke reactie, pipet 23.0 microliter van de RT-LAMP master mix in een 200 microliter PCR buis.Voeg vervolgens twee microliter van het monster toe om het totale volume op 25,0 microliter te brengen. Gebruik moleculair water voor de negatieve controle, en zorg ervoor dat een positieve controle op te nemen. Optioneel, omvatten een specificiteit controle reactie van een verwante arbovirus zoals dengue virus, zoals beschreven in het protocol van tech.Verwarm de monsters met behulp van een warmteblok, waterbad of een thermocycler gedurende 30 minuten op 61 graden Celsius. Verhoog hierna de warmte 10 minuten lang tot 80 graden Celsius om de polymerase te verwarmen. Voer de RT-LAMP-analyse uit in een aparte afgesloten ruimte.Verdun de fluorescerende nucleïnezuurverfstof een tot tien in de TAE-buffer. Voeg twee micorliters van de fluorescerende nucleïnezuurverfoplossing toe aan 12 micorliters van de RT-LAMP-reactie. Beoordeel de RT-LAMP reacties visueel door te zoeken naar de aanwezigheid van een kleurverandering.Optioneel gebruik maken van een camera om foto's van RT-LAMP reacties te nemen op een witte achtergrond. Plaats vervolgens de monsters onder een 302 nanometer UV-licht om de aanwezigheid van RT-LAMP producten door fluorescentie te bevestigen. Gebruik een camera om een foto van het resultaat te maken.Om te beginnen met het uitvoeren van elektroforese giet 2%agarose gel in 1x TAE buffer met een nucleïnezuur vlek voor visualisatie. Voeg vijf microliter van een DNA-ladder toe in de eerste rijstrook om de moleculaire gewichten te vergelijken. Meng voor elke RT-LAMP-reactie 13 microliters rt-lampreactiemengsel met twee microliters van DNA-ladingskleurstof.Laad dit mengsel van 15 microliter. Voer de gel op 90 volt gedurende 90 minuten of totdat de banden zijn gescheiden. Een beeld met 302 nanometer UV-licht.Gooi na afloop rt-lampreacties weg in dubbel verzegelde zakken. In deze studie worden drie verschillende methoden gebruikt om RT-LAMP reacties te analyseren. Bij het gebruik van fluorescerende nucleïnezuur kleurstof positieve reacties geel-groen van kleur, terwijl negatieve reacties oranje lijken.Deze kleurstof resulteert ook in een fluorescerend signaal wanneer monsters worden opgewekt door UV-licht. Ten slotte kunnen RT-LAMP reacties worden opgelopen op een agarose gel. Positieve RT-LAMP reacties zullen een banding patroon hebben, terwijl negatieve reacties geen DNA-banden zullen hebben.Deze methoden worden gebruikt om de specificiteit van de ZIKV RT-LAMP reactie aan te tonen. Alleen de ZIKV moleculaire controle heeft een positieve RT-LAMP reactie. Bovendien, terwijl ZIKV wordt gedetecteerd in zowel de urine en serum van een patiënt met een bekende ZIKV-infectie, wordt het niet gezien bij de asymptomatische controlepatiënt zonder ZIKV-infectie.De monsters worden vervolgens getest op menselijke 18S rRNA. Alleen de monsters van patiënten worden als positief beschouwd voor 18S rRNA. Muggenmonsters kunnen op dezelfde manier worden getest op ZIKV of de RT-LAMP kwaliteitscontrole AEDAE.Alleen de positieve moleculaire controle voor ZIKV en de met ZIKV geïnfecteerde mug worden als positief beschouwd voor ZIKV. Maar alle muggen zijn positief voor AEDAE door RT-LAMP. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek worden gedaan in minder dan 30 minuten als het goed wordt uitgevoerd.Het is belangrijk om te onthouden dat RT-LAMP reacties gevoelig zijn voor vals positieve reacties. Preventie stappen omvatten het gebruik van een thermolabiel uracil DNA glycosylase in reacties, met behulp van een laterale workflow, het uitvoeren van analyse in een aparte ruimte, en het verminderen van tijd post versterking buizen zijn open. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals QPCR worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals hoeveel kopieën het virus of andere doelen in het monster aanwezig zijn.Na het bekijken van deze video, moet u een goed begrip van hoe RT-LAMP te gebruiken om Zika virus en doel controles in menselijke urine en serum, evenals muggen te detecteren. Vergeet niet dat het werken met het Zika-virus en nucleïnezuurvlek zeer gevaarlijk kan zijn, en voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van handschoenen moeten altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure. Gezien de associatie van Zika virusinfectie met aangeboren afwijkingen, vrouwen die zwanger zijn, proberen op te vatten, of partners van deze vrouwen, moet aanzienlijk minimaliseren hun laboratorium blootstelling aan Zika virus.

reverse-transcription-loop-mediated-isothermal-amplification-rt-lamp

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

This video demonstrates a quantitative method for detecting viral infection using real-time reverse transcription PCR. The reverse transcription step converts the RNA to cDNA, which is then amplified via PCR cycles. The presence of viral RNA in the sample is confirmed by analyzing the amplification and dissociation curves of DNA obtained from the PCR.

Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR for Diagnosing Viral Infections

Zika Virus (ZIKV), een opkomend pathogeen, wordt in verband gebracht met foetale ontwikkelingsstoornissen en microcefalie. De oprichting van een effectief infectieus celkweeksysteem is cruciaal voor studies naar ZIKV-replicatie evenals voor de ontwikkeling van vaccins en geneesmiddelen. In deze studie worden verschillende virologische tests met betrekking tot ZIKV geïllustreerd en besproken.

Zika Virus Besmettelijke celcultuur en de<em&gt; In Vitro</em&gt; Profylactisch effect van interferonen

Huidige multiplexed diagnostiek te detecteren Zika, chikungunya, dengue virussen vereisen complexe monstervoorbereiding en dure instrumentatie en moeilijk te gebruiken in omgevingen met lage resource. Laten we een diagnose die gebruikmaakt van isotherme amplificatie met doelgroepen gerichte strand verschuifbare sondes op te sporen en deze virussen onderscheiden met hoge gevoeligheid en specificiteit.

Multiplexed isotherme amplificatie gebaseerd diagnostische Platform om te detecteren Zika, Chikungunya en Dengue 1

Voor een efficiënte controle van mug virusverspreiding gedragen, is de kennis van het potentieel van de vector van respectieve muggen van bijzonder belang. Beschrijven we gedwongen speekselvloed als een methode voor het analyseren van vector bevoegdheid van Aedes albopictus en drie verschillende Culex taxa voordeoverdracht van Zika-virus.

Gedwongen speekselvloed als een methode voor het analyseren van Vector bevoegdheid van muggen

Beschrijven we een methode om te evalueren van het effect van reeds bestaande immuniteit tegen dengue virus op de Zika-virus-infectie met behulp van menselijk serum, primaire menselijke cellen en kwantificering van de infectie door kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie.

Kwantificering van antilichaam-afhankelijke versterking van het Zika-Virus in primaire menselijke cellen

Het gepresenteerde protocol kan de vectorcompetentie van Aedes aegypti-muggenpopulaties voor een bepaald virus, zoals Zika, in een containmentomgeving bepalen.

Vectorcompetentieanalyses op Aedes aegypti-muggen met behulp van het Zika-virus

In dit werk beschrijven we de protocollen die worden gebruikt in op replicon gebaseerde en virale enzymgebaseerde testen om te screenen op remmers van Zika-virusreplicatie in een screeningsformaat met hoge doorvoer.

Antivirale testen met hoge doorvoer om te screenen op remmers van Zika-virusreplicatie

Toegang tot gedecentraliseerde, goedkope en hoogwaardige diagnostiek die in de gemeenschap kan worden ingezet voor gedecentraliseerde tests is van cruciaal belang voor het bestrijden van wereldwijde gezondheidscrises. Dit manuscript beschrijft hoe op papier gebaseerde diagnostiek kan worden gebouwd voor virale RNA-sequenties die kunnen worden gedetecteerd met een draagbare optische lezer.

Ontwerp-tot-implementatiestudie voor ontwikkeling en patiëntvalidatie van op papier gebaseerde sleufschakelaardiagnostiek

Hier presenteren we een protocol dat de middelmatige tot hoge doorvoer functionele karakterisering van gen- en promotorconstructies in secundair stamweefsel van bomen binnen relatief korte tijdsbestek mogelijk maakt. Het is efficiënt, gemakkelijk te gebruiken en breed toepasbaar op een reeks boomsoorten.

Het gebruik van Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) voor het bestuderen van genen en Promoters Betrokken bij Wood Vorming en secundaire Stem Development

De dood van eilandje-β-cellen gaat vooraf aan de ontwikkeling van type 1 diabetes, en het detecteren van dit proces kan vroege therapeutische interventie mogelijk maken. Hier bieden we een gedetailleerde beschrijving van hoe je differentieel gemethyleerde INS DNA-soorten in menselijk serum kunt meten als een biomarker van β-celdood.

Meting van differentieel gemethyleerde<em&gt; INS</em&gt; DNA-Species in monsters humaan serum als een Biomarker van Islet β Cell Death

Leer RT-LAMP voor snelle detectie van Zika-virus in urine, serum en muggen zonder RNA-isolatie. Deze kosteneffectieve methode levert resultaten in ongeveer 30 minuten en ondersteunt surveillance van infectieziekten.

Reverse transcriptie-lus-gemedieerde isotherme amplificatie (RT-LAMP) Assay voor Zika-Virus en huishouden genen in Urine, Serum en Mosquito monsters (Video) | JoVE Journal

Reverse transcriptie-lus-gemedieerde isotherme amplificatie (RT-LAMP) Assay voor Zika-Virus en huishouden genen in Urine, Serum en Mosquito monsters

Meer video's verkennen