Generatie van menselijke 3D longweefsel culturen (3D-LTCs) voor ziekte modelleren
12 februari 2019
Hier presenteren we een protocol voor de bereiding van menselijke precisie-cut-Long agarose gevulde segmenten van patiënten weefsel gereseceerd die geschikt zijn voor het genereren van 3D Long weefselcultures naar model menselijke longziekten in de biologische en biomedische studies.
Deze methode maakt onderzoek van levend menselijk weefsel in zijn natuurlijke 3D-structuur en samenstelling voor de vertaling van belangrijke laboratoriumbevindingen naar potentiële therapieën mogelijk. Deze techniek maakt het specifiek mogelijk de generatie van weefselculturen uit chirurgisch gereseceerd of geëxplanteerd menselijk longweefsel voor de visualisatie van individuele overleden patiënt longweefsel monsters. Ziektevrij longweefsel kan worden gebruikt als 3D-weefselculturen om longziekten ex vivo te modelleren, waardoor vroege pathomechanismen in een hoge spatiotemporale resolutie kunnen worden geanalyseerd.
Begin met het plaatsen van de resected long monster in 15 milliliter van teeltmedium in een steriele 15 centimeter cultuur schotel en steriele metalen lade bedekt met tissue papier, en vul een 30 milliliter spuit met 42 graden Celsius laag smeltpunt agarose. Verwijder de obturator van een perifere veneuze katheter en bevestig de katheter aan de 30 milliliter spuit. Identificeer een bronchus met een diameter van 0,5 tot 3 millimeter in het ventilerende weefsel in een intact deel van het weefsel en steek de canula zo veel mogelijk in bronchus.
Gebruik tangen om de bronchiole wand rond de canula te comprimeren, idealiter vastklemmen elke aangrenzende longslagader op hetzelfde moment, om de bronchus rond de canula te verzegelen en gebruik een chirurgische klem om andere extra luchtwegen occlude, om agarose lekkage te voorkomen. Gebruik vervolgens de tangen om het longweefsel uit de kweekschotel te tillen en gebruik de spuit om de agarose handmatig door de canula te brengen, niet sneller dan 0,3 milliliter per seconde. Wanneer het longweefsel volledig wordt gevuld zonder het weefsel te overpompen, moet u de canula onmiddellijk verwijderen en de bronchus klemmen.
Dompel het weefsel in kweekmedium op vier graden Celsius gedurende 30 minuten om agarose verharding te vergemakkelijken, en herhaal de agarose vulprocedure voor eventuele extra bronchiole openingen. Bewaar vervolgens de met agarose gevulde longweefselsecties in vier graden Celsius medium tot het snijden. Voor precisie gesneden long snijden, identificeren van de stevig agarose gevulde regio's binnen het longweefsel, die niet instorten wanneer zachtjes gedrukt met een pincet tegen de bodem van de cel cultuur schotel.
Accijns een 1 tot 1,5 kubieke centimeter blok van stevig gevulde regio met een kant nog steeds bedekt met pleura, en gebruik cyanoacrylaat lijm om het meervoud kant van elk weefsel blok hechten aan de vibratome houder. Snijd de hele weg door het lange weefselblok, totdat slechts twee tot drie milometers weefsel zonder licentie worden achtergelaten. Met behulp van tangen om elke 500 micrometer sectie over te brengen in een put van een twaalf-put plaat met teeltmedium, zoals ze worden verkregen.
Wanneer al het weefsel is geneusd, breng de monsters van elke put in individuele tien centimeter cultuur schotels en plaats een vier millimeter biopsie puncher orthogonaal aan het bovenste oppervlak van de precisie-gesneden long slice. Dan, het verplaatsen van de puncher in de klok mee en tegen de klok in rotaties, verkrijgen weefsel stoten van het longmonster. Het plaatsen van elke punch in verse cel cultuur medium in individuele putten van een 96-put plaat als ze worden verkregen.
Wanneer alle weefselstoten zijn verkregen, plaatst u de plaat maximaal vijf dagen in de couveuse van de celkweek. Immunolabeling van fibronectine in celkernen met immunofluorescentie in menselijke 3D-longweefselculturen maakt beeldvorming van de bewaarde alveolaire structuur ex vivo mogelijk. Behandeling van de menselijke precisie gesneden long slice stoten met een profibrotische cytokine cocktail voor 48 uur resulteert in fibrose-achtige veranderingen in de menselijke long 3-D weefsel culturen, met inbegrip van de significante inductie van de fibrose relevante extracellulaire matrix componenten, collageen Type One, en fibronectin genen.
Bovendien, eiwitniveaus van de mesenchymale marker vimentine zijn geregeld in drie van de vier patiënten na de behandeling van 3-D longweefsel cultuur stoten. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals RNA-analyse door kwantitatieve real-time PCR, of eiwitanalyse door westerse blotting, worden uitgevoerd om respectievelijk gen- en eiwitexpressie in het weefsel te evalueren. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoeken op het gebied van experimentele longologie, om longbiologie uit te zetten en toxicologische en farmacologische studies uit te voeren in menselijke weefselmonsters.
Vergeet niet dat levend menselijk weefsel potentieel besmettelijk is en dat voorzorgsmaatregelen zoals het gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen en de juiste weefselopslag, transport en afvalverwerking altijd moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het bereiden van met agarose gevulde, precisie-gesneden menselijke longplakjes uit geresecteerd patiëntweefsel. Deze plakjes zijn geschikt voor het genereren van 3D-longweefselculturen om menselijke longziekten te modelleren in biologische en biomedische studies.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Biomedisch onderzoek
- Modellering van longziekten
- 3D-weefselkweektechnieken
Achtergrond
- Menselijk longweefsel kan worden gebruikt om ziekten in een natuurlijke 3D-structuur te bestuderen.
- Deze methode maakt de visualisatie van longmonsters van individuele patiënten mogelijk.
- Het maakt de analyse van vroege pathomechanismen met een hoge spatiotemporele resolutie mogelijk.
- Voorzorgsmaatregelen zijn noodzakelijk vanwege het infectieuze karakter van levend menselijk weefsel.
Doel van de studie
- Om een protocol te ontwikkelen voor het creëren van 3D-longweefselculturen.
- Om de studie van longziekten ex vivo te vergemakkelijken.
- Om de analyse van gen- en eiwitexpressie in menselijk longweefsel mogelijk te maken.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van longweefselmonsters met behulp van laagsmeltende agarose.
- Precieze versnijding van agarose-gevulde longsecties.
- Immunolabelingstechnieken voor de visualisatie van de weefselstructuur.
- Analyse van gen- en eiwitexpressie met behulp van PCR en western blotting.
Belangrijkste resultaten
- Inductie van fibrose-achtige veranderingen in longweefselkweken na cytokinebehandeling.
- Opregulatie van genen voor collageen type I en fibronectine.
- Verhoogde proteïneniveaus van de mesenchymale marker vimentine in behandelde monsters.
- Potentieel voor verder onderzoek in de experimentele pulmonologie en farmacologie.
Conclusies
- Deze techniek bevordert het begrip van de longbiologie.
- Het biedt een platform voor toxicologische en farmacologische studies.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze methode voor een betere ziektemodellering.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Managers
Menselijke 3D-longweefselkweken, afgeleid van precisie-gesneden longplakjes, bieden een fysiologisch relevant ex vivo model voor het bestuderen van ziektemanisemen en medicijnresponsen in de natuurlijke menselijke weefselarchitectuur. Deze benadering ondersteunt doelwitvalidatie en mechanische risicovermindering door directe beoordeling van de effecten van verbindingen in zieke of peritumorale longmonsters van individuele patiënten mogelijk te maken. Het model vergroot het voorspellend vertrouwen bij preklinische evaluatie door cellulaire diversiteit, de samenstelling van de extracellulaire matrix en biomechanische eigenschappen te behouden die cruciaal zijn voor translationele relevantie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken in intact menselijk longweefsel met behoud van de 3D-structuur en celtype-diversiteit.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele target-validatie door het meten van door geneesmiddelen geïnduceerde veranderingen in fibrose-gerelateerde biomarkers, zoals collageen type I en fibronectine.
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert pathway-verduidelijking via spatiotemporele analyse van vroege pathomechanismen in ziekterelevant menselijk weefsel.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde, reproduceerbare weefselponsjes die geschikt zijn voor compound-screening in multi-well platen.
- Operationele waarde: Maakt kwantitatieve read-outs mogelijk via immunofluorescentie, qPCR en western blotting voor dosis-respons- en tijdreeksanalyses.
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de weefselopbrengst uit beperkte patiëntmonsters door middel van biopsieponsjes, waardoor de schaalbaarheid van assays en de replicatiecapaciteit worden verbeterd.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Modelleert mensspecifieke fibrotische processen op subcellulair niveau met behulp van cytokinen-geïnduceerde fibrose-achtige veranderingen in precisie-gesneden longplakjes.
- Operationele waarde: Biedt een ziekterevant systeem voor het evalueren van target engagement en het werkingsmechanisme in menselijk weefsel voorafgaand aan in vivo-studies.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de translationele afstemming van biomarkers door correlatie van moleculaire readouts met functionele uitkomsten op weefselniveau mogelijk te maken.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van vroege toetsing van hypotesen over targets via lead-identificatie tot preklinische validatie, waardoor iteratieve verfijning op basis van reacties in menselijk weefsel mogelijk is.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten door visualisatie van de alveolaire structuur en cellulaire responsen in intacte menselijke long-explantaten mogelijk te maken.
- Screening: Levert assay-klare weefselstansen met een consistente grootte en levensvatbaarheid voor compound-libraryscreening in 96-wells formats.
- Analytics: Maakt multiplexed read-outs mogelijk, waaronder genexpressie (qPCR), eiwitniveaus (western blot) en structurele beeldvorming (immunofluorescentie) om behandelcondities te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen discovery-onderzoek en preklinisch werk door de complexiteit van menselijk weefsel te behouden en patiëntgestratificeerde responsanalyse mogelijk te maken.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor de modellering van longziekten dat kan worden toegepast in meerdere projecten en therapeutische gebieden.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen door translatiekloven tussen soorten te verkleinen door direct gebruik van menselijk longweefsel.
- Operationele waarde: Standaardiseert de weefselpreparatie via agarose-inbedding en precisiesnijden, wat de reproduceerbaarheid tussen gebruikers en locaties verbetert.
- Strategische waarde: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door vroege signalen van effectiviteit en toxiciteit in menselijk weefsel te verschaffen.
- Impact op portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van mechanistische effecten in menselijke longmonsters van zieke weefsels of peritumorale weefsels.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de omgang met menselijk weefsel, steriele techniek en sectieerwerk met een vibratoom.
- Afhankelijk van toegang tot chirurgisch geresecteerd longweefsel en agarose met een laag smeltpunt voor structurele preservatie.
- Necessiteert gestandaardiseerde kweekcondities en contaminatiecontroles vanwege het infectiepotentieel van levend menselijk weefsel.
- Omvat optimalisatie van de grootte van de biopsiepunch en de rotatietechniek om uniformiteit van monsters over de herhalingen te waarborgen.
- Beperkt door het venster van weefsellevensvatbaarheid, wat tijdige verwerking en het starten van de kweek na resectie vereist.
