Name: Myeloïde aangeboren signalering Pathway regelgeving door MALT1 Paracaspase activiteit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Ontdek hoe MALT1 paracaspase-activiteit de signalering van C-type lectine-achtige receptoren in myeloïde cellen reguleert met behulp van humane PBMC's en muizenmiltcellen. Deze methode onthult selectieve cytokineproductie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken voor hun vergunning (registratienummer 4334770630127) te reproduceren hier figuur 2A van Unterreiner et al. Elsevier (2017).

Experimenten werden uitgevoerd volgens de richtlijnen en normen van de ethische commissie voor Novartis menselijke onderzoek.
1. bereiding van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) uit menselijke Buffy Coats
Opmerking: Wij ontvangen buffy coats gezonde vrijwilligers een dag na het verzamelen, in zakken van 50 mL. Ze werden krachtens geïnformeerde toestemming en verzameld via het Interregionale Blutspende Schweizeriches Rotes Kreuz. We behandeld met behulp van de procedure hieronder, bij kamertemperatuur, tenzij anders is bepaald.
<ol><li>Bereiden een steriele en schone paar van schaar en een bekerglas van 1 L met een plastic zak (onder een lamina stroom).</li>
	<li>Breng de buffy coat in het bekerglas en zorgvuldig te openen met de schaar.</li>
	<li>Met behulp van een precisiepipet 25 mL, voeg 100 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing buffer/ethyleendiamminetetra zuur (PBS/EDTA: PBS 1 x pH 7.4 met geen CaCl2 en geen MgCl2, aangevuld met 2 mM EDTA pH 8,0). Opmerking: Met behulp van hetzelfde Pipetteer en na langzaam pipetteren de oplossing op en neer, breng 25 mL van de verdunde buffy coat in 6 conische centrifuge buizen van 50 mL vooraf gevuld met 15 mL polysaccharide gebaseerde dichtheid verloop.</li>
	<li>20 min op 800 x g centrifugeren met matige versnelling (vastgesteld op 4 van 9) en zonder de rem te voorzien in scheiding van cellen op basis van hun dichtheid. Opmerking: Na het centrifugeren zullen drie lagen zichtbaar; een pellet met rode bloedcellen en granulocyten, een bovenste laag gemaakt van plasma, en tussen een witte ring met perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs).</li>
	<li>Oogst de PBMC ring met behulp van een pipet 10 mL en overdracht aan de nieuwe 50 mL tubes. Opmerking: Twee tot drie 50 mL buizen zijn normaal vereist per buffy coat. In dit stadium vervuilt sommige waarschijnlijk plasma de verzamelde PBMCs, die geen effect op de latere verrijking stappen hebben moeten.</li>
	<li>Top van maximaal 50 mL elke buis met behulp van PBS/EDTA en overgaan tot drie opeenvolgende wast met afnemende centrifugeertijd en snelheid (15 min op 520 x g, 10 min op 330 x g, 8 min op 150 x g). Opmerking: Bij elke stap het supernatant wordt gegoten uit in een vloeibare afval container en geresuspendeerde pellet van de cel is in 50 mL PBS/EDTA (pellets mogen worden samengevoegd na de eerste wasbeurt).</li>
	<li>Na de definitieve wash, resuspendeer de pellet in een ijskoude lysis-buffermengsel 25 mL (Zie Tabel van materialen) lyse van de rode bloedcellen door de osmotische druk.</li>
	<li>Incubeer de oplossing pas duidelijk (≤5 min bij kamertemperatuur).</li>
	<li>Zet de reactie stop door toevoeging van 25 mL scheiding buffer (PBS 1 x pH 7.4 met geen CaCl2 en geen MgCl2, aangevuld met 2% warmte-geïnactiveerd foetale runderserum (FBS) en 1 mM EDTA pH 8.0).</li>
	<li>Nog een keer wassen bij 150 x g gedurende 8 min. Opmerking: In dit stadium PBMCs kunnen worden gebruikt als een bulk populatie (zie stap 3: PBMCs en monocyten behandelingen en stimulerend voorwaarden) of verwerkt voor monocyt verrijking (zie stap 2: bereiding van monocyten van PBMCs), of bevroren neer voor later gebruik (zie stap 5: Monocyten en PBMCs procedures invriezen/ontdooien).</li>
</ol>2. voorbereiding van de monocyten van PBMCs
<ol><li>Resuspendeer de PBMCs verkregen bij stap 1.10 in scheiding buffer en tellen ze om te bereiken van 5 x 10,7cellen/mL.</li>
	<li>Breng de celsuspensie in een tube conische centrifuge 14 mL met dop.</li>
	<li>Voeg 50 µL van monocyt verrijking antilichaam cocktail per mL celsuspensie, vortex, en incubeer 10 min bij 4 ° C.</li>
	<li>Voeg 50 µL van monocyt verrijking kralen per mL cellen. Opmerking: De kralen moet grondig vortexed om de homogeniteit van de schorsing.</li>
	<li>Na het toevoegen van de kralen, binnenkort de celsuspensie vortex en incubeer 5 min bij 4 ° C.</li>
	<li>Spoel het bovenste gedeelte van de buis met scheiding buffer totdat de buis gevuld is tot 10 mL.</li>
	<li>Meng de oplossing langzaam door pipetteren omhoog en omlaag.</li>
	<li>Plaats de buis zonder dop in een scheiding-magneet.</li>
	<li>Incubeer gedurende 2,5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Giet langzaam in een tube van 15 mL conische centrifuge.</li>
	<li>In dit stadium rechtstreeks monocyten gebruiken (zie stap 3: PBMCs en monocyten behandelingen en stimulerend voorwaarden) of ze verschillen in ikmmature Monocyte afkomstige Dendritic Cells (iMoDCs) (zie stap 4), of bevriezen ze af voor later gebruik (zie stap 5).</li>
</ol>3. PBMCs en monocyten behandelingen en stimulerend voorwaarden
<ol><li>Cellen tellen en vul ze in een kweekvloeistof (Roswell Park Memorial Instituut medium (RPMI) 10% FBS + 1 mM natrium pyruvaat 100 U/mL penicilline streptomycine (Pen/Strep) + 5 µM β-mercaptoethanol), tot 1.25 x 104 cellen per putje.</li>
	<li>Distribueren 30 µL celsuspensie per putje van de plaat van een 384-well.</li>
	<li>Voeg 15 µL van 4 x geconcentreerd samengestelde oplossingen en vooraf Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C, 5% CO2.</li>
	<li>Lipopolysaccharide (LPS) toevoegen om een eindconcentratie van 10 ng/mL, verarmd zymosan (DZ) tot een uiteindelijke concentratie van 100 µg/mL, of houden in gewone medium.</li>
	<li>Na een nacht bebroeden bij 37 ° C, 5% CO2.</li>
	<li>Neem 10 µL van het supernatans dat voor het meten secreted TNF-a (zie stap 7: Cytokines en levensvatbaarheid metingen).</li>
</ol>4. monocyten differentiatie in iMoDCs en stimulerend voorwaarden
<ol><li>Monocyten (verrijkt bij stap 2) tellen samen en centrifugeer de celsuspensie bij 520 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Pipetteer af het supernatant en voeg kweekmedium (RPMI + 10% FBS te verkrijgen van een definitieve celsuspensie van 0,4 x 106 cellen/mL.</li>
	<li>Voeg 80 ng/mL recombinante menselijke IL-4 + 100 ng/mL GM-CSF.</li>
	<li>Afzien van 5 mL celsuspensie per putje in een 6-well-plate.</li>
	<li>Incubeer gedurende 7 dagen bij 37 ° C, 5% CO2.</li>
	<li>Op dag 7, oogst cellen door pipetteren voorzichtig om te voorkomen dat hun activering.</li>
	<li>Centrifugeer bij 520 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Aspirate vacuüm en resuspendeer in 50 mL gestolde voedingsbodem zonder groeifactoren.</li>
	<li>Centrifugeer bij 520 x g gedurende 5 min en resuspendeer bij 1 x 106 cellen/mL in een cultuurmedium.</li>
	<li>Afzien 100 µL celsuspensie (105 cellen) per putje van een 96-Wells platte bodemplaat.</li>
	<li>Vooraf incubate gedurende 1 uur bij 37 ° C na het toevoegen van 50 µL van 4 x geconcentreerd samengestelde oplossingen, bereid zoals beschreven bij stap 8: verbindingen van voorbereiding.</li>
	<li>Voeg 50 µL van stimuli (4 x geconcentreerd), bereid zoals beschreven bij stap 9.</li>
	<li>Incubeer 24 uur bij 37 ° C.</li>
	<li>Meng elk goed en overdracht cellen en supernatant (SN) in een 96-Wells-V-bodemplaat.</li>
	<li>Spin down bij 475 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Pipetteer bovendrijvende substantie in een nieuwe 96-Wells platte bodemplaat, seal en bevriezen bij-20 ° C tot verder gebruik.</li>
</ol>5. monocyten en PBMCs invriezen/ontdooien Procedures
<ol><li>
Bevriezing
	<ol>
<li>Spin down PBMC of monocyt cel preparaten op 520 x g gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Vacuüm gecombineerd het supernatant en resuspendeer de cellen in de bevriezing van medium 1 x 107 cellen/ml.</li>
		<li>Afzien van 1 mL celsuspensie in cryotubes, de buizen overbrengt naar een specifieke koeling apparaat (Zie materialen tabel) en plaats deze bij-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ontdooien
	<ol>
<li>Ontdooi de cryotube en snel overbrengen van de inhoud in een 15 mL conische centrifugebuis met 9 mL gestolde voedingsbodem.</li>
		<li>Centrifugeer bij 520 x g gedurende 5 min.</li>
		<li>Vacuüm aspirate supernatant en resuspendeer de pellet cel in 5 mL gestolde voedingsbodem. Cellen zijn nu gereed voor verdere experimentele verwerking.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. muis milt cellen voorbereiding en behandeling
Opmerking: Wij uitgevoerd dierlijke offers volgens de richtlijnen en normen van de organisatie van Novartis Animal Welfare. Studies werden goedgekeurd door de ethische commissie van de regionale overheidsinstantie (Kantonales Veterinäramt der Stadt Basel). We dieren geofferd door Isofluraan overmatige blootstelling, met alle inspanningen om het lijden te minimaliseren.
<ol><li>Oogst van de milt en distantiëren van weefsel met behulp van een buis voorzien van een mechanische weefsel grinder apparatuur en gevuld met 5 mL koude RPMI voedingsbodem.</li>
	<li>Het programma van de milt van de dissociatie machine fijn organen te gebruiken.</li>
	<li>Filtreer de cellen door een 100 mm nylon cel zeef.</li>
	<li>Spoel de suspensie in 50 mL tubes en centrifugeer bij 4 ° C gedurende 10 minuten bij 320 x g.</li>
	<li>Vacuüm aspirate het supernatant, resuspendeer de pellet cel in 3 mL ijskoud lysis-buffermengsel en incubeer gedurende ≤2 min op ijs.</li>
	<li>Stop lysis door toevoeging van 7 mL van RPMI medium.</li>
	<li>Filtreer opnieuw door een 100 µm nylon cel zeef.</li>
	<li>Spin down celsuspensie bij 330 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.</li>
	<li>Vacuüm aspirate supernatant en resuspendeer de cellen bij 11 x 106 cellen/mL in volledige medium (RPMI aangevuld met 10% FBS, 100 U/mL Pen/stap en 5 µM β-Mercaptoethanol).</li>
	<li>Plaat 1 x 106 cellen/well (90 µL) in een 96-wells-plaat (platte bodem).</li>
	<li>Voeg 5 µL van 20 x geconcentreerd samengestelde oplossing eerder verdund in RPMI medium zoals beschreven in stap 8.3: seriële verdunning voor lymfkliertest milt cellen.</li>
	<li>Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C, 5% CO2.</li>
	<li>Voeg 5 µL van 20 x geconcentreerd DZ (eindconcentratie 30 µg/mL) of 20 x geconcentreerd LPS + IFN-g (TLR-4) (eindconcentratie 1 µM LPS en 10 ng/mL IFN-g).</li>
	<li>Na een nacht bebroeden bij 37 ° C, 5% CO2.</li>
	<li>Centrifugeer bij 330 x g gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Overdracht van supernatant in nieuwe platen, seal en bevriezen bij-20 ° C tot verder gebruik.</li>
</ol>7. Cytokines en levensvatbaarheid metingen
<ol><li>
Menselijke TNF-a meting door HTRF (homogene tijd opgelost fluorescentie) Opmerking: Het protocol gevolgd van de leverancier aanbevelingen, hieronder kort samengevat.<ol>
<li>Meng 1 deel van het gereconstitueerde reagens (anti-TNF-a-cryptate en anti-TNF-a-XL665) met 19 delen van reconstitutie buffer (50 mM fosfaatbuffer pH 7.0, 0,8 M kalium fluoride (KF), 0,2% bovien serumalbumine (BSA)).</li>
		<li>Meng de twee oplossingen voor kant-en-klare antilichaam 1:1 vlak voor de verstrekking van de reagentia.</li>
		<li>Afzien van 10 µL van supernatant van stap 3.6 in witte 384-Wells-platen.</li>
		<li>Afzien van 10 µL van het mengsel van antilichamen.</li>
		<li>De afdekplaat met een sealer en na een nacht bebroeden bij 4 ° C.</li>
		<li>Lees de plaat op een microplate-lezer (50 – 200 Flits).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Menselijke meting van de IL-23 door HTRF (homogene tijd opgelost fluorescentie) Opmerking: Het protocol gevolgd van de leverancier aanbevelingen, hieronder kort samengevat.<ol>
<li>Meng 1 volumedeel gereconstitueerde reagens (anti-IL-23-cryptate-antilichaam en anti-IL-23 D2-antilichaam) met 19 delen detectie buffer #3.</li>
		<li>Meng de twee oplossingen voor kant-en-klare antilichaam 1:1 vlak voor de verstrekking van de reagentia.</li>
		<li>Afzien van 10 µL van supernatant van stap 3.6 in witte 384-Wells-platen.</li>
		<li>Afzien van 10 µL van het mengsel van antilichamen.</li>
		<li>De afdekplaat met een sealer en na een nacht bebroeden bij 4 ° C.</li>
		<li>Lees de plaat op een microplate-lezer (50 – 200 nm flash).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Menselijke IL-6, IL-8, IL-1β en TNF-α metingen door electrochemiluminescence Opmerking: Alle monsters zijn verdund bij 1/150 in verdunningsmiddel 2 (eerste verdunning: 10 µL in 150 µL, dan 20 µL in 180 µL). Het protocol gevolgd van de leverancier aanbevelingen:<ol>
<li>Verdun monsters en standaard in verdunningsmiddel 2.</li>
		<li>Ga verder met de verdunning van de standaard in verdunningsmiddel 2 met behulp van een verdunning van 1/4 seriële vouwen.</li>
		<li>Spoel de platen driemaal met was buffer.</li>
		<li>Breng 50 µL van monsters of norm per putje.</li>
		<li>Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur onder agitatie.</li>
		<li>Wassen van de plaat viermaal met PBS + 0,05% Polysorbaat 20.</li>
		<li>25 µL van detectieantilichaam (60 µL van elke antilichamen tegen 3 mL definitieve) in verdunningsmiddel 3 toevoegen.</li>
		<li>Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur onder agitatie.</li>
		<li>Wassen van de plaat viermaal met PBS + 0,05% Polysorbaat 20.</li>
		<li>Het vermijden van bubbels, toevoegt 150 µL per putje van leesbuffer (Tris gebaseerde buffer met tripropylamine, verdund 2 x in ddH20) als een co reactieve voor lichte generatie in electrochemiluminescence immunoassay.</li>
		<li>Lees de plaat (onverwijld) op een multiplex-afleesapparaat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Muis TNF-a meting door ELISA volgens protocol van de leverancier
	<ol>
<li>Verdun supernatans 1:1 in assay verdunningsmiddel (klaar voor gebruik eiwithoudende buffer).<ol>
<li>Bereiden standaard verdunningen, reagentia en monsters als beschreven in de kit. Voeg 50 l assay verdunningsmiddel aan elk putje.</li>
			<li>Voeg 50 l standaard, het besturingselement of monster per putje.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Meng door zachtjes te tikken op het frame van de plaat voor 1 min.</li>
		<li>Dek af met de meegeleverde zelfklevende strip en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Gecombineerd elkaar goed en wassen met 400 μl per putje (Herhaal deze stap vijf keer in totaal).</li>
		<li>Na de definitieve wash, Verwijder eventuele resterende was buffer door zuigen.</li>
		<li>De plaat omkeren en vlek tegen schone papieren handdoeken.</li>
		<li>Voeg 100 μl van muis TNF-α conjugaat aan elk putje. Bedek met een nieuwe zelfklevende strip.</li>
		<li>Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Herhaal de aspiratie/wassen zoals in stap 7.4.4.</li>
		<li>Voeg 100 μl van substraat oplossing aan elk putje en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht.</li>
		<li>Voeg 100 μl van verdund zoutzuuroplossing (eindeoplossing) toe aan elk putje. Tik zachtjes op de plaat om ervoor te zorgen homogenisatie van het mengsel.</li>
		<li>Meten van de extinctie bij 450 nm (met de golflengte van de correctie vastgesteld op 560 nm) met behulp van een microplate-lezer (moet worden gedaan binnen 30 min).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Levensvatbaarheid van de cellen
	<ol>
<li>Na het verwijderen van supernatant van PBMC of monocyt preparaten, beoordelen de levensvatbaarheid van de cellen met behulp van een klaar om resazurin oplossing (oxidation-reduction indicator) toegevoegd rechtstreeks naar de celsuspensie aan eindconcentratie van 10% te gebruiken.</li>
		<li>Incubeer gedurende 1 tot 2 uur bij 37 ° C, 5% CO2.</li>
		<li>Lees de fluorescentie bij 590 nm (excitatie 540 nm) met behulp van een microplate-lezer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. samengestelde voorbereiding
<ol><li>
Seriële verwatering voor iMoDCs
	<ol>
<li>Verdun de stockoplossing MLT-827 (10 mM dimethylsulfoxide (DMSO) in medium om te bereiken van 8 µM in één keer (4 x geconcentreerd).</li>
		<li>Het uitvoeren van een zes-stap 1:5 seriële verdunning, met behulp van medium + 0,08% DMSO. Gebruik de hetzelfde medium + 0,08% DMSO oplossing voor de staat van het voertuig (geen verbinding).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Enkelvoudige dosis testen voor iMoDCs
	<ol>
<li>Verdun de voorraadoplossingen MLT-827, AFN700 en Cpd11 in medium om te bereiken 4 µM in één keer (4 x geconcentreerd).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Seriële verdunning voor lymfkliertest milt cellen
	<ol>
<li>Verdun een oplossing van 10 µM MLT-827 (verkregen uit een stamoplossing van 10 mM, na een een ga verdunning in medium) tot 0,01 µM, met een DMSO einde concentratie van 0,1%.</li>
		<li>Voor de verdunning stappen, neem 2 µL van elke verdunning, toevoegen van 38 µL RPMI en Pipetteer 5 µL in de put. Opmerking: Alle behandelingen worden uitgevoerd in drievoud.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. stimuli voorbereiding
<ol><li>
Verarmd zymosan (DZ)
	<ol>
<li>Voeg 2 mL steriele endotoxine-gratis water met 10 mg DZ.</li>
		<li>Vortex te homogeniseren van de stockoplossing, vortex ook voorafgaande elk gebruik.</li>
		<li>Aliquot oplossing en winkel aliquots bij-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Trehalose-6,6-dibehenate (TDB)
	<ol>
<li>Voeg 100 µL van DMSO tot 1 mg TDB, warmte bij 60 ° C in een waterbad voor 15 – 30 s.</li>
		<li>Vortex en onmiddellijk 900 µL van steriele PBS, vortex opnieuw toe te voegen.</li>
		<li>Verwarm gedurende 10-15 minuten bij 60 ° C en meng door vortexing vóór elk gebruik.</li>
		<li>Bewaar deze oplossing bij 4 ° C.</li>
		<li>Het uitvoeren van seriële verdunningen en enkelvoudige dosis voorbereiding wat betreft de MLT-827-compound. Opmerking: Omdat TDB worden voorbereid in DMSO moet, is een 1% DMSO eindconcentratie aanwezig tijdens de stimulatie van de cel.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Coornaert, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+antigen+receptor+stimulation+induces+MALT1+paracaspase-mediated+cleavage+of+the+NF-kappaB+inhibitor+A20%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">T cell antigen receptor stimulation induces MALT1 paracaspase-mediated cleavage of the NF-kappaB inhibitor A20.</a> Nature immunology. 9 (3), 263-271 (2008).</li>
<li>Rebeaud, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proteolytic+activity+of+the+paracaspase+MALT1+is+key+in+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">The proteolytic activity of the paracaspase MALT1 is key in T cell activation.</a> Nature immunology. 9 (3), 272-281 (2008).</li>
<li>Jaworski, M., Thome, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+paracaspase+MALT1%3A+Biological+function+and+potential+for+therapeutic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">The paracaspase MALT1: Biological function and potential for therapeutic inhibition.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (3), 459-473 (2016).</li>
<li>Meininger, I., Krappmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+signaling+and+activation+by+the+CARMA1-BCL10-MALT1+signalosome%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte signaling and activation by the CARMA1-BCL10-MALT1 signalosome.</a> Biological Chemistry. 397 (12), 1315-1333 (2016).</li>
<li>Qiao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+architecture+of+the+CARMA1%2FBcl10%2FMALT1+signalosome%3A+nucleation-induced+filamentous+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Structural architecture of the CARMA1/Bcl10/MALT1 signalosome: nucleation-induced filamentous assembly.</a> Molecular cell. 51 (6), 766-779 (2013).</li>
<li>Gross, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Card9+controls+a+non-TLR+signalling+pathway+for+innate+anti-fungal+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Card9 controls a non-TLR signalling pathway for innate anti-fungal immunity.</a> Nature. 442 (7103), 651-656 (2006).</li>
<li>Chiffoleau, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-type+lectin-like+receptors+as+emerging+orchestrators+of+sterile+inflammation+represent+potential+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">C-type lectin-like receptors as emerging orchestrators of sterile inflammation represent potential therapeutic targets.</a> Frontiers in Immunology. 9 (FEB), 1-9 (2018).</li>
<li>Taylor, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dectin-1+is+required+for+beta-glucan+recognition+and+control+of+fungal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dectin-1 is required for beta-glucan recognition and control of fungal infection.</a> Nature Immunology. 8 (1), 31-38 (2007).</li>
<li>Lanternier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+immunodeficiencies+underlying+fungal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+pediatrics%22%5BJournal%5D)">Primary immunodeficiencies underlying fungal infections.</a> Current opinion in pediatrics. 25 (6), 736-747 (2013).</li>
<li>Thome, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+roles+for+MALT1+in+T-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Multifunctional roles for MALT1 in T-cell activation.</a> Nature reviews. Immunology. 8 (7), 495-500 (2008).</li>
<li>Unterreiner, A., Stoehr, N., Huppertz, C., Calzascia, T., Farady, C. J., Bornancin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+MALT1+paracaspase+inhibition+does+not+block+TNF-%CE%B1+production+downstream+of+TLR-4+in+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">Selective MALT1 paracaspase inhibition does not block TNF-α production downstream of TLR-4 in myeloid cells.</a> Immunology Letters. , 48-51 (2017).</li>
<li>Strasser, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22265677">Syk Kinase-Coupled C-type Lectin Receptors Engage Protein Kinase C-δ to Elicit Card9 Adaptor-Mediated Innate Immunity.</a> Immunity. 36 (1), 32-42 (2012).</li>
<li>Jaworski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malt1+protease+inactivation+efficiently+dampens+immune+responses+but+causes+spontaneous+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Malt1 protease inactivation efficiently dampens immune responses but causes spontaneous autoimmunity.</a> The EMBO journal. 33 (23), 2765-2781 (2014).</li>
<li>Yu, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALT1+protease+activity+is+required+for+innate+and+adaptive+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">MALT1 protease activity is required for innate and adaptive immune responses.</a> PLoS ONE. 10 (5), 1-20 (2015).</li>
<li>Bardet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+T-cell+fingerprint+of+MALT1+paracaspase+revealed+by+selective+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The T-cell fingerprint of MALT1 paracaspase revealed by selective inhibition.</a> Immunology and Cell Biology. 96 (1), 81-99 (2018).</li>
<li>Thoma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+profiling+of+a+selective+and+efficacious+syk+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Discovery and profiling of a selective and efficacious syk inhibitor.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 58 (4), 1950-1963 (2015).</li>
<li>Bauer, B., Steinle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HemITAM%3A+A+single+tyrosine+motif+that+packs+a+punch%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">HemITAM: A single tyrosine motif that packs a punch.</a> Science Signaling. 10 (508), 1-10 (2017).</li>
<li>Gringhuis, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1001259">Selective c-Rel activation via Malt1 controls anti-fungal TH-17 immunity by dectin-1 and dectin-2.</a> PLoS Pathogens. 7 (1), (2011).</li>
<li>Dufner, A., Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+antigen+receptor-induced+activation+of+an+IRAK4-dependent+signaling+pathway+revealed+by+a+MALT1-IRAK4+double+knockout+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">B cell antigen receptor-induced activation of an IRAK4-dependent signaling pathway revealed by a MALT1-IRAK4 double knockout mouse model.</a> Cell Communication and Signaling. 9 (1), 6(2011).</li>
<li>Phelan, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiprotein+supercomplex+controlling+oncogenic+signalling+in+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A multiprotein supercomplex controlling oncogenic signalling in lymphoma.</a> Nature. , In press (2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In dit werk gebruikten we eenvoudige experimentele instellingen te bestuderen signaalroutes in mens en muis aangeboren cellen, en hun afhankelijkheid van MALT1 Proteolytische functie ondervragen. Uitbreiding op de eerdere werk11, onze studie toonde aan dat MALT1 paracaspase activiteit controles C-type lectine-achtige receptor geïnduceerde cytokine productie, met inbegrip van TNF-α. Daarentegen was de TLR-4-geïnduceerde TNF-α onafhankelijk van MALT1 in beide soorten. Deze gegevens bevestigd collect...

De activiteit van de paracaspase van MALT1 (Mucosa-geassocieerde lymfoïde weefsel lymfoom translocatie eiwit 1) werd geopenbaard in 20081,2. Sindsdien hebben een aantal studies zijn kritische bijdrage aan antigeen receptor reacties in lymfocyten gemeld. Genetische modellen in de muis, alsmede farmacologie gegevens ondersteunen een sleutelrol in de T-cellen, T-cel afhankelijke autoimmuniteit en B-cel lymfoom instellingen3,4. In lymfocyten, MALT1 paracaspase activering treedt op bij montage van een CARD11-BCL10-MALT1 complex5, die is veroorzaakt door antigeen-receptor proximale signalering stroomafwaarts van de T - of B-cel-receptoren. Er is ook voldoende bewijs dat een soortgelijke CARD9-BCL10-MALT1-complex belangrijk is voor het teeltmateriaal signalen stroomafwaarts van C-type lectine-achtige receptoren (CLLR), bijvoorbeeld, Dectin-1 en Dectin-2 MINCLE in myeloïde cellen6,7. Dectin-1 is bijzonder goed onderzocht omdat dit traject is van cruciaal belang voor de verdediging van de gastheer tegen schimmelinfecties8,9. Implicatie van MALT1 in de Toll-like receptor (TLR) wegen, is echter omstreden10gebleven. Recente gegevens in menselijke myeloïde cellen zijn uitgesloten van een directe rol voor MALT1 paracaspase activiteit in de regulering van de TNF-productie stroomafwaarts van TLR-411.
In het huidige werk, we gebruikten verschillende experimentele instellingen en stimulerend voorwaarden in mens en muis myeloïde cellen sonde aangeboren signaalroutes, afhankelijk van de specifieke farmacologische tool-remmers en meting van cytokine productie.

<table><tbody><tr><td>100 &micro;m nylon cell strainer</td><td>Sigma</td><td>CLS431752</td><td></td></tr><tr><td>14 mL Falcon tube</td><td>BD Falcon</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon tube</td><td>Falcon</td><td>352090</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon tube</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>6 well plates</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>96 well flat-bottom plate, with low evaporation lid</td><td>Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>96 well V-bottom plate</td><td>Costar</td><td>734-1798</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Chloride - NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Assay diluent RD1-W ELISA</td><td>R&amp;D</td><td>895038</td><td>Assay diluent</td></tr><tr><td>Cell culture microplate, 384 well, black</td><td>Greiner</td><td>781986</td><td></td></tr><tr><td>Depleted Zymosan</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-dzn</td><td>now: tlrl-zyd</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>EDTA-Na2</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate</td></tr><tr><td>ELISA muTNF-&alpha;</td><td>R&amp;D</td><td>SMTA00</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C tubes</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS dissociator</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Novartis</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Heat-inactivated Fetal bovine serum</td><td>Gibco</td><td>10082</td><td>FBS</td></tr><tr><td>HTRF hu IL-23</td><td>CisBio</td><td>62HIL23PEG</td><td></td></tr><tr><td>HTRF hu TNF-&alpha;</td><td>CisBio</td><td>62TNFPEC</td><td></td></tr><tr><td>HTRF reconstitution buffer</td><td>CisBio</td><td>62RB3RDE</td><td>50mM Phosphate buffer, pH 7.0, 0.8M KF, 0.2% BSA</td></tr><tr><td>IFN-&gamma;</td><td>R&amp;D</td><td>L4516</td><td></td></tr><tr><td>IL-4</td><td>Novartis</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbott</td><td>Forene</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides (LPS)</td><td>Sigma</td><td>L4391</td><td>LPS gebruikt in humane monsters</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides</td><td>Sigma</td><td>L4516</td><td>LPS gebruikt in muizen monsters</td></tr><tr><td>Lysis buffer</td><td>Zelfgemaakt</td><td>-</td><td>155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 1 mM EDTA, pH 7.4</td></tr><tr><td>Magnet</td><td>Stemcell</td><td>18001</td><td></td></tr><tr><td>Microplate, 384 well white</td><td>Greiner</td><td>784075</td><td></td></tr><tr><td>Monocytes enrichment kit</td><td>Stemcell</td><td>19059</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Mr. Frosty Cryo 1&deg;C Freezing Container</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>koelapparaat (met Propanol-2)</td></tr><tr><td>PBS 1x pH 7.4 [-] CaCl2 [-] MgCl2</td><td>Gibco</td><td>10010</td><td>Phosphate-buffered saline</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>Pen/Strep</td></tr><tr><td>Potassium bicarbonate - KHCO3</td><td>Sigma</td><td>P9144</td><td></td></tr><tr><td>PrestoBlue</td><td>Invitrogen</td><td>A13262</td><td>Resazurin oplossing voor levensvatbaarheidsbeoordeling</td></tr><tr><td>Propanol-2</td><td>Merck</td><td>1.09634</td><td></td></tr><tr><td>Read buffer</td><td>MesoScale Discovery</td><td>R92TC-3</td><td>Tris-gebaseerde buffer met tripropylamine</td></tr><tr><td>Recovery cell culture freezing medium</td><td>Gibco</td><td>12648-010</td><td>vriesmedium</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) met Glutamax</td><td>Gibco</td><td>61870</td><td>+ 10% FBS voor iMoDCs + 10% FBS + 1 mM Sodium Pyruvaat + 100 U/mL Pen/Strep + 5 &micro;M &beta;-mercaptoethanol voor humane PBMC's en monocyten + 10% FBS + Pen/Strep + 5 &micro;M &beta;-mercaptoethanol voor muis splenocyten</td></tr><tr><td>Separation buffer</td><td>Zelfgemaakt</td><td>-</td><td>PBS pH 7.4 + 2% FBS + 1 mM EDTA pH 8.0</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Gibco</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>Trehalose-6,6-dibehenate</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-tdb</td><td>TDB</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P7949</td><td>Polysorbaat 20</td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15675</td><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td></tr><tr><td>Viewseal sealer</td><td>Greiner BioOne</td><td>676070</td><td></td></tr><tr><td>V-PLEX Proinflammatory Panel 1 Human Kit</td><td>MesoScale Discovery</td><td>K15049D</td><td>elektrochemiluminescente multiplex assay (IL-1&beta;, TNF-&alpha;, IL-6, IL-8)</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>31350</td><td></td></tr></tbody></table>

myeloïde aangeboren signalering pathway regelgeving door malt1 paracaspase activiteit

Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity

Naast zijn functie in de lymfoïde cellen, die door tal van studies is gericht, speelt de paracaspase MALT1 ook een belangrijke rol bij aangeboren cellen stroomafwaarts van patroon erkenning receptoren. Beste studeerde zijn de Dectin-1 en Dectin-2 leden van de C-type lectine-achtige receptor familie die een Unnethes - en CARD9-afhankelijke signalering cascade die leiden tot activering van NF-recombination, in een MALT1-afhankelijke manier induceren. Door contrast, Toll-like receptors (TLR), zoals TLR-4, propageren NF-recombination activering maar signaal via een MYD88/IRAK-afhankelijke cascade. Toch, of MALT1 kunnen bijdragen aan de TLR-4 signalering bleef onduidelijk. Recente blijkt met MLT-827, een krachtige en selectieve remmer van MALT1 paracaspase activiteit, dat TNF-productie stroomafwaarts van TLR-4 in menselijke myeloïde cellen is onafhankelijk van de MALT1, in tegenstelling tot de TNF-productie stroomafwaarts van Dectin-1, die MALT1 afhankelijk. Hier, wij gericht de selectieve betrokkenheid van MALT1 in de patroonherkenning sensing verder, met behulp van een verscheidenheid van mens en muis cellulaire preparaten, en stimulatie van Dectin-1, MINCLE of TLR-4 trajecten. Wij voorzien ook aanvullende inzichten door het verkennen van cytokines beyond TNF- en door het vergelijken van MLT-827 een inhibitor van Unnethes (Cpd11) en een IKK-remmer (AFN700). Collectief, de verstrekte gegevens verder bewijs voor de MALT1-afhankelijkheid van C-type lectine-achtige receptor — signalering daarentegen aan TLR-signalering.

MALT1 Relais in myeloïde cellen, activering signalen stroomafwaarts van verschillende C-type lectine-achtige receptoren, zoals Dectin-1 en Dectin-2 MINCLE6. Deze trajecten afhankelijk (zoom) ITAM motief-bevattende receptoren (b.v., Dectin-1) of ITAM motief-bevattende co receptoren (b.v., FcRγ, voor Dectin-2 en MINCLE) die werven en activeren de Unnethes kinase (Figuur 1). Dit leidt tot activatie van een proteïne kinas...

MALT1 regelt aangeboren immuniteit, maar hoe dit gebeurt blijft vaag. We gebruikten de selectieve MALT1 paracaspase remmer MLT-827 te ontrafelen van de bijdrage van MALT1 aan het aangeboren signalering stroomafwaarts van Toll-like of C-type lectine-achtige receptoren, aan te tonen dat MALT1 de productie van myeloïde cytokines regelt, en "downstream" C-type lectine-achtige receptoren, selectief.

Myeloïde aangeboren signalering Pathway regelgeving door MALT1 Paracaspase activiteit

Besides its function in lymphoid cells, which has been addressed by numerous studies, the paracaspase MALT1 also plays an important role in innate cells ...

Het doel van de methode in ons manuscript is om vergelijkende analyse te geven van signaleringstrajecten in myeloïde cellen met behulp van mens- en muissystemen. Het helpt bij het definiëren van welke signaleringsroute betrokken is stroomafwaarts van geselecteerde patroonherkenningsreceptoren. Dus deze methode is eenvoudig te implementeren.Het is gebaseerd op primaire celpreparaten en gevalideerde referentieverbindingen, wat essentieel is voor de opheldering van signaleringsmechanismen. Het aantonen van de procedure zijn Ratiba Touil en Adeline Unterreiner, respectievelijk wetenschapper en onderzoeksmedewerker in onze groep. In een laminaire stroomkap uiteengezet een steriele schaar, een een liter beker, en een plastic zak.Plaats de eerder verkregen buffy jas in het bekerglas en gebruik de schaar om het zorgvuldig te openen. Voeg met een pipet van 25 mm 100 ml PBS toe, aangevuld met 2 millimolar EDTA. Meng door langzaam pipetting op en neer.En breng vervolgens 25 ml van de verdunde buffylaag over in zes kegelvormige centrifugebuizen die elk zijn voorgevuld met 15 ml polysaccharide gebaseerde dichtheidsgradiënt. Centrifugeren de buizen gedurende 20 minuten bij 800 g met matige acceleratie zonder de pauze om scheiding van cellen mogelijk te maken op basis van hun dichtheden. Na centrifugatie zullen drie lagen zichtbaar zijn, een pellet met rode bloedcellen en granulocyten, een bovenste laag gemaakt van plasma, en een witte ring met perifere bloedmononucleaire cellen.Gebruik een pipet van 10 ml om de PBMC-ringen te oogsten en ze over te brengen in een nieuwe buis van 50 ml. Vul aan met PBS en EDTA. Voer drie opeenvolgende wasbeurten uit met afnemende centrifugatietijd en -snelheid zoals beschreven in het tekstprotocol.Na de laatste wasbeurt, resuspend de pellet in 25 ml ijskoude lysis buffer om de rode bloedcellen lyse door osmotische druk. Broed de oplossing bij kamertemperatuur tot het duidelijk wordt. Voeg vervolgens 25 ml scheidingsbuffer toe om de reactie te stoppen.Centrifuge acht minuten op 150 g om de oplossing te wassen. Giet de supernatant af en verdaag de pellet met scheidingsbuffer. Na het tellen van de cellen, verdun ze in cultuurmedium tot 12.500 cellen per put.Verdeel 30 ml van deze celsuspensie in elke put van een 384 putplaat. Voeg vervolgens 15 microliter van vier keer geconcentreerde samengestelde oplossingen toe aan elke put en preincubaat de plaat bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide gedurende een uur. Voeg indien gewenst LPS toe aan de uiteindelijke concentratie van 1 ng per ml of uitgeput Zymosan tot een uiteindelijke concentratie van 100 mcg per ml.Dan incubeer de plaat 's nachts op 37 graden Celsius met 5%kooldioxide. De volgende dag neem 10 microliters van de supernatant om de afgescheiden TNF alpha niveaus te meten. Om te beginnen met de seriële verdunning, verdun de MLT-827 voorraadoplossing met medium om een concentratie van 8 micromolar in één keer te bereiken.Voer een zes-staps 1:5 seriële verdunning uit met medium met 0,08%DMSO. Om zich voor te bereiden op enkelvoudige dosistests, verdun de MLT-827, AFN700 en samengestelde 11 voorraadoplossingen met medium om in één keer een concentratie van 4 micromolar te bereiken. Voeg eerst 2 ml steriel endotoxinevrij water toe aan 10 mg uitgeputte Zymosan.Vortex deze voorraad oplossing om het te homogeniseren. Aliquot de oplossing en sla de aliquots op 20 graden Celsius. In deze studie worden menselijke PBMCs en muis miltcellen gestimuleerd met een uitgeputte Zymosan, een Dectin-1 agonist, of lipopolysaccharide, een TL4 agonist.NTNF alpha release in de supernatant wordt gemeten na 20 uur. In zowel de menselijke en muis testen de MLT-827 verbinding selectief blokkeert TNF alpha productie aangedreven door de Dectin-1 route, maar niet door de TLR4 route. In monocyten gestimuleerd met LPS, de productie van TNF alpha is bijna volledig ingetrokken door AFN700, maar het is niet gevoelig voor Cpd11, die in overeenstemming is met de afhankelijkheid van de TLR4 traject van NF-kappa B activiteit en de onafhankelijkheid van SIC activiteit.TNF-alfaproductie, aangedreven door Dectin-1 en MODC's, toont daarentegen gevoeligheid voor MLT-827, AFN700 en Cpd11. Dit levert verder bewijs voor de betrokkenheid van een SIC CBM signalering cascade in de Dectin-1 traject. De productie van IL-1 beta, IL-6 en IL-23 is ook gevoelig voor de drie remmers, wat duidt op regelgevende mechanismen die vergelijkbaar zijn met TNF alpha.Het beperkte effect op de productie van IL-8 wijst er echter op dat deze cytokine een duidelijk regelgevingsmechanisme heeft. Het verhogen van trehalose-dibehenaatconcentraties boven 50 mcg per ml leidt tot de productie van TNF alpha, IL-6 en IL-1 beta, die zich baseerde op MALT1 paracaspase activiteit volgens het blokkerende effect van MLT-827. Vergelijkbare resultaten werden gezien bij het uitdagen van de MODC's met toenemende concentraties van uitgeputte Zymosan om Dectin-1 te stimuleren.Deze methode maakte het mogelijk om aan te tonen dat de paracaspase MALT1 selectief C-type lectine-achtige receptorsignalering reguleert. Het is essentieel om goed gekarakteriseerde referentieverbindingen te gebruiken. Let op de procedure voor de verwatering van voorraadoplossingen.Dit is van cruciaal belang voor verbinding met beperkte oplosbaarheid.

myeloid-innate-signaling-pathway-regulation-malt1-paracaspase

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De sialidase test is een eenvoudige technische aanpak die nieuwe moleculaire mechanisme (s) van TLR sensoren van microbiële infecties en betrokkenheid bij inflammatoire ziekten op de receptor niveau op het celoppervlak van de live macrofagen zullen toelichten.

Detectie van Neu1 Sialidase activiteit in het reguleren van Toll-like receptor activering

Live-cell imaging van caspase-3-gemedieerde apoptose in vereeuwigd N19-oligodendrocyt celculturen met behulp van...

Monitoring gekliefde caspase-3 activiteit en apoptose van geïmmortaliseerde Oligodendrogliale cellen met behulp van live-cell imaging en Cleaveable fluorogene-dye Substraten Na Kalium-geïnduceerde membraandepolarisatie

Dit protocol beschrijft caspase Bimolecular fluorescentie complementatie (BiFC); een door de imaging gebaseerde methode die kan worden gebruikt voor het visualiseren van geïnduceerde nabijheid van initiatiefnemer caspases, die is de eerste stap in hun activering.

Verlichting van de trajecten voor Caspase activeren met behulp van fluorescentie Bimolecular complementatie

We beschrijven de detectie van NLRP3 inflammasome activering op cellulaire basis met behulp van fluorescentie microscopie en kleuring voor actieve caspase-1 en de adapter, ASC. Een lactaat dehydrogenase release assay wordt gepresenteerd voor het detecteren van lysis van de pyroptotic op basis van de bevolking. Deze technieken kunnen worden aangepast om te bestuderen van vele aspecten van inflammasome biologie.

Detectie van Inflammasome-activering en Pyroptotic celdood in lymfkliertest beenmerg-afgeleide macrofagen

Wij rapporteren methoden voor karakterisering van MLKL-gemedieerde plasmamembraan breuk in necroptosis met inbegrip van conventionele en confocal microscopie van live-cel imaging, scanning elektronen microscopie, en NMR gebaseerde lipide bindend.

Karakterisatie van MLKL-gemedieerde plasmamembraan Rupture in Necroptosis

Dit protocol beschrijft de workflow om monocyten-afgeleide macrofagen (MDM) te verkrijgen uit menselijke bloedmonsters, een eenvoudige methode om inflammatoire caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) -verslaggevers efficiënt in menselijke MDM te introduceren zonder de levensvatbaarheid en het gedrag van cellen in gevaar te brengen, en een op beeldvorming gebaseerde benadering om inflammatoire caspase-activering in levende cellen te meten.

Visualisatie van inflammatoire caspasen geïnduceerde nabijheid in menselijke monocyt-afgeleide macrofagen

Dit protocol beschrijft een uitgebreide methode voor het beoordelen van caspase-activering (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9 en caspase-11) in reactie op zowel in vitro als in vivo (bij muizen) modellen van infectie, steriele beledigingen en kanker om de initiatie van celdoodroutes te bepalen, zoals pyroptose, apoptose, necroptose en PANoptose.

Evaluatie van Caspase-activering om aangeboren immuunceldood te beoordelen

Het huidige protocol beschrijft twee methoden om caspase-activiteit te meten via een fluorogeen substraat met behulp van flowcytometrie of een spectrofluorometer.

Caspase-activiteit meten met behulp van een fluorometrische test of flowcytometrie

Hier wordt een op fosfoflowcytometrie gebaseerde methode beschreven om de signalering stroomafwaarts van de mTORC1-, JAK/STAT5- en MAPK-routes te analyseren in acute menselijke myeloïde leukemiecellen die xenotransplanteerd zijn in muizen en verkregen uit beenmergaspiraten. p-STAT5-, p-4EBP1-, p-RPS6- en p-ERK1/2-niveaus worden tegelijkertijd gemeten met behulp van een spectrale flowcytometer van de volgende generatie met hoge gevoeligheid.

Intracellulaire fosfoflowcytometrie van acute myeloïde leukemie Patiënt-afgeleide xenotransplantaties

Deze video toont de procedure voor de differentiatie van myeloïde dendritische cellen van de muis beenmerg. Isolatie van de muis scheenbeen en dijbeen, en verwerking van het beenmerg worden aangetoond. Foto's tonen celmorfologie voor en na de differentiatie, en figuren afbeelden cel fenotype en IL-12 productie na rijping met behulp van CpG worden weergegeven.

Cultuur van myeloïde dendritische cellen uit beenmerg precursors

Ontdek hoe MALT1 paracaspase-activiteit de signalering van C-type lectine-achtige receptoren in myeloïde cellen reguleert met behulp van humane PBMC's en muizenmiltcellen. Deze methode onthult selectieve cytokineproductie.

Myeloïde aangeboren signalering Pathway regelgeving door MALT1 Paracaspase activiteit

Meer video's verkennen