Eiwit invoer in chloroplasten met behulp van protoplasten studeren
10 december 2018
Hier beschrijven we een protocol om het uiten van eiwitten in protoplasten met behulp van PEG-gemedieerde transformatie methode. De methode biedt eenvoudige uitdrukking van proteïnen van belang, en efficiënte opsporing van eiwit lokalisatie en het importproces voor verschillende experimentele omstandigheden in vivo.
Dit mysterie kan helpen bij het beantwoorden van een paar vragen op het gebied van celbiologie, zoals eiwitinput in chloroplasten. Het belangrijkste voordeel van deze technologie is dat eiwitinput in chloroplasten onder en vivo omstandigheden kan worden bestudeerd. Het aantonen van de procedure zal Junho Lee en Hyangju Kang, twee post outs van mijn laboratorium.
Om te beginnen, oogst intacte bladweefsels van twee weken oude planten van een tot twee B5 platen. Gebruik een chirurgisch mes om de bladeren te oogsten en plaats ze in een 50 milliliter conische buis met 25 milliliter enzymoplossing. Plaats de buis horizontaal op een roterende shaker en broed met zachte agitatie bij 22 graden Celsius in het donker gedurende acht tot 12 uur totdat alleen bloemblaadjes en stengels in de oplossing blijven.
Na het voltooien van incubatie, filter de enzymoplossing met vrijgegeven protoplasten door een 140 micrometer porie grootte gaas in een verse petrischaal. Leg vervolgens voorzichtig de oplossing op 15 milliliter van 21%sucroseoplossing in een conische buis van 50 milliliter. Centrifugeer de buis in een swingende emmerrotor van 98 gs gedurende 10 minuten met de laagste acceleratie- en vertragingsinstellingen.
Gebruik daarna patura pipet om de protoplasten zorgvuldig te verwijderen uit de bovenste laag met enzymoplossing en uit de interface tussen de enzymoplossing en sacharoseoplossing. Breng deze oplossing over naar een 50 milliliter conische buis met 30 milliliter W5-oplossing en keer de buis om te mengen. Centrifuge de buis op 51 gs gedurende zes minuten.
Gebruik een pipet om deze supernatant voorzichtig weg te gooien zonder de protoplasten in de pellet te verstoren. Voeg 25 milliliter W5-oplossing toe en schort de protoplasten voorzichtig opnieuw op. Voor stabilisatie, incubeer in een vier Celsius koelkast voor een minimum van een uur.
Na vier graden Celsius incubatie, pellet de protoplasten volledig door centrifugeren ze op 46 gs gedurende twee minuten. Verwijder de supernatent voorzichtig volledig en voeg MANG-oplossing toe aan de protoplastpellet om vijf keer tien tot zes tot zes per milliliter te bereiken. Gebruik een pipet om 10 microgram van het plasma-DNA en 300 microliter protoplastoplossing toe te voegen aan een verse 13 milliliter ronde buis met bodem.
Meng door de buizen voorzichtig met de hand te draaien en voeg dan onmiddellijk 300 microliters vers bereide 40%PEG-oplossing toe. Meng volledig door het kantelen van de buis bijna horizontaal en draaien het zacht meerdere malen met de hand. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
Voeg vervolgens een milliliter W5-oplossing toe en meng volledig door de buis zoals voorheen voorzichtig met de hand te draaien. Incubeer het monster gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal nog twee keer met het toevoegen van eerst 1,5 milliliter en vervolgens twee milliliter W5 en na de uiteindelijke toevoeging en het mengen, incubeer gedurende 30 minuten.
Centrifuge de buis op 46 gs gedurende vier minuten en gooi de supernatant. Voeg twee milliliter W5-oplossing toe aan de pellet en meng zachtjes, maar volledig, op dezelfde manier als voorheen. Broed op 22 graden Celsius in een donkere kamer gedurende 18 uur.
Om de eiwitimport met behulp van florescencemicroscopie te analyseren, gebruikt u een pipet met een bijgesneden tip om 10 microliter van de protoplastoplossing op een glazen glijbaan te plaatsen. Gebruik een afdeksel om de oplossing zorgvuldig te bedekken om beschadiging van de protoplasten te voorkomen. Plaats de dia op het podium van een fluorescentiemicroscoop met een excitatie-toelatingsfilter dat is ingesteld voor het observeren van groen fluorescerend eiwit en chlorofyl autofluorescentie.
Gebruik een gekoelde camera voor het koppelen van een lading om beelden vast te leggen en te verwerken met behulp van een imagine-bewerkingssoftware om pseudo-kleurenbeelden te produceren. Voor totale eiwitextractie en immunoblotting, verwijder een milliliter uit de protoplast oplossing en meng de resterende een milliliter. Breng deze protoplastoplossing gedurende vier minuten over in een centrifugebuis en centrifuge op 46 gs.
Verwijder de supernatant na het voltooien van centrifugatie en voeg 80 microliter denaturatiebuffer toe. Vortex krachtig voor vijf seconden. Voeg vijf XDS monster buffer, meng goed en kook gedurende 10 minuten tot denature.
Ga verder met de standaard STS-pagina en immunoblotting met anti-GFP-antilichaam. RbcS en TGFT, een fusieconstructie die de 79 eindeindige aminozuurresten van RBCS met de doorvoerpeptide bevat die tot GFP is gesmolten, werd gebruikt om de invoer van eiwitten in chloroplasten te bestuderen door florescentiemicroscopie en immunoblotting. Wanneer onderzocht door florescence microscopie, groene fluorescerende signalen van het doel eiwit samengevoegd met de rode fluorescerende signalen van chlorofyl autoflores die eiwit importeren in chloroplasten.
Na het isoleren van het totale eiwit worden twee eiwitbanden waargenomen in de immunoblot, waaruit blijkt dat een eiwit goed werd geïmporteerd in chloroplasten. De bovenste band komt overeen met de volledige lengteprecursor en de onderste band met de verwerkte vorm na invoer in chloroplasten. De hoeveelheid van de verwerkte vorm van het eiwit steeg op een tijd-afhankelijke manier, wat suggereert dat het eiwit wordt ingevoerd in chloroplasten.
Bij deze ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van celbiologie om eiwitbiedige of membraandraadplukjes in Arabidopsis te onderzoeken.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een PEG-gemedieerde transformatiemethode voor het tot expressie brengen van eiwitten in protoplasten, waardoor de studie van eiwitlokalisatie en importprocessen in vivo mogelijk wordt. Het protocol wordt gedemonstreerd door Junho Lee en Hyangju Kang, en geeft inzicht in eiwitinput in chloroplasten.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Plantenbiologie
- Eiwitexpressie
Achtergrond
- Het begrijpen van eiwitlokalisatie is cruciaal in de celbiologie.
- Chloroplasten spelen een belangrijke rol in de plantenmetabolisme.
- Het bestuderen van eiwitimportprocessen kan onze kennis van cellulaire functies verbeteren.
- PEG-gemedieerde transformatie is een veel gebruikte techniek voor protoplasten.
Doel van de studie
- Om een protocol te bieden voor eiwitexpressie in protoplasten.
- Om eiwitlokalisatie onder in vivo condities te onderzoeken.
- Om onderzoek naar eiwitimportprocessen in chloroplasten te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Oogsten van intacte bladweefsels van twee weken oude planten.
- Gebruik van een chirurgisch mes om bladmonsters voor te bereiden.
- Incuberen van bladweefsels in een enzymoplossing voor protoplastisolatie.
- Gebruik van PEG-gemedieerde transformatie voor eiwitexpressie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle expressie van eiwitten in protoplasten.
- Efficiënt onderzoek naar eiwitlokalisatie.
- Demonstratie van het protocol door getrainde onderzoekers.
- Inzichten in het importproces van eiwitten in chloroplasten.
Conclusies
- De PEG-gemedieerde transformatiemethode is effectief voor eiwitexpressie.
- Deze aanpak maakt de studie van eiwitdynamiek in vivo mogelijk.
- Verder onderzoek kan de implicaties van eiwitimport in chloroplasten uitbreiden.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding protein import mechanisms into chloroplasts provides foundational insights for target validation in plant-based bioproduction systems. This protoplast-based assay enables mechanistic de-risking of nuclear-encoded protein trafficking pathways, supporting predictive confidence in chloroplast engineering for therapeutic protein expression. The method offers a disease-relevant system for evaluating targeting signal functionality and import efficiency under near-physiological conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates chloroplast targeting signal functionality and import kinetics for nuclear-encoded proteins.
- Operational Value: Enables rapid assessment of protein localization using fluorescence microscopy and immunoblotting readouts.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing of transit peptide efficacy and import machinery engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative immunoblot data showing precursor-to-processed protein conversion over time.
- Operational Value: Provides a reproducible protoplast isolation and transfection workflow using PEG-mediated transformation.
- Assay Readiness: Delivers dual-readout capability (fluorescence and immunoblot) for import validation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage targeting signal analysis to preclinical evaluation of chloroplast-expressed biologics.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed protein accumulation results from proper import versus cytosolic aggregation.
- Predictive Confidence: Time-dependent increase in processed protein band correlates with functional import progression.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where target validation precedes lead identification, particularly for chloroplast-directed expression systems. It supports screening campaigns by providing import-competent biological systems ready for effector protein testing. Analytics derived from the assay include fluorescence co-localization metrics and immunoblot-based quantification of import efficiency.
- Discovery Biology: Tests whether candidate proteins achieve proper subcellular localization via endogenous import pathways.
- Screening: Delivers standardized protoplast preparations suitable for high-content localization screening.
- Analytics: Enables quantification of import kinetics through precursor/product band ratios in immunoblots.
- Translational Research: Informs construct design for chloroplast expression vectors by validating transit peptide functionality.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating multiple targeting signals across protein therapeutics candidates.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in protein targeting hypotheses through direct visualization of import.
- Operational Value: Delivers a standardized, scalable protoplast isolation protocol with defined centrifugation and resuspension steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for chloroplast expression constructs by confirming import competence.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targeting sequences based on empirical import data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant protoplast isolation, PEG-mediated transfection, and fluorescence microscopy.
- Dependent on enzymatic tissue digestion equipment, sucrose gradient centrifugation, and PEG solution preparation.
- Necessitates standardization of protoplast density (5×10⁶/mL) and DNA input (10 µg) for reproducible expression.
- Involves adaptation considerations when extending to non-Arabidopsis species or alternative chloroplast transformation systems.
- Practical limitations include protoplast viability window post-isolation and sensitivity to osmotic stress during PEG incubation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:33
Protoplast Isolation
2:19
Protoplast Transformation using Polyethylene Glycol
3:53
Analysis of the Protein Import into Chloroplasts
5:10
Results: Fluorescence Microscopy and Immunoblotting to Analyze the Import of Proteins into Chloroplasts
6:07
Conclusion
