Isolatie, karakterisering en differentiatie van cardiale stamcellen van het hart volwassen muis

Het algemene doel van dit artikel, is het standaardiseren van het protocol voor de isolatie, karakterisering, en differentiatie van cardiale stamcellen, CSCs van de Adult Mouse Heart. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen, op het gebied van hart- en vaatziekten en regionale therapie zoals cardiale stamceltherapie en hartfalen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het kosteneffectief is, met hoge steun in een korte periode van tijd.

Begin dit experiment door alle benodigde materialen, instrumenten en isolatiebuffers in een gesteriliseerde toestand voor te bereiden, zoals beschreven in het protocol. Na het verwijderen van de huid uit de buik van een geëuthanaseerde muis, snijd de ribbenkast in de steriele kap om de borstholte te openen. Bloot het hart en verwijder het bloed in de buurt van het hart met behulp van een een milliliter spuit.

Om bloed in de buurt van het hart te verwijderen, was de omgeving met ijskoude PBS. Met behulp van chirurgische schaar en pincet om het hart te ontleden, plaats het in een 100 millimeter petrischaal met 10 milliliter ijskoude PBS. Gebruik gebogen schacht tangen om het hart hartpapillen, en verwijder het resterende bloed in het hart.

Breng vier tot vijf geïsoleerde harten over naar een petrischaaltje van 10 milliliter met 10 milliliter ijskoude Ham's Balanced Salt Solution. Palpate de harten weer om ze te wassen en verwijder alle resterende bloed in het hart. Om de volledige verwijdering van het bloed te garanderen, moet u de HBSS-oplossing na elke wasbeurt wijzigen.

Houd elk hart met een paar tangen en gebruik een chirurgisch mes om elk hart te snijden in twee tot vier millimeter stukken in een 100 millimeter petrischaal, met vijf tot zeven milliliter HBSS. Vaak veranderen de oplossing om volledige bloedverwijdering te garanderen. Tot slot, gehakt de harten in de HBSS oplossing.

Centrifugeer de gehakte harten geplaatst in een 50 milliliter conische buis op 500 keer G, op vier graden Celsius gedurende vijf minuten, en gooi de supernatant. Voeg vijf tot zes milliliter, 0,2%Collagenase II oplossing aan de pellet om het weefsel te verteren. Schors de pellet grondig door de buis op een shaker op 75 keer G te wiegen, bij 37 graden Celsius gedurende 45 tot 60 minuten.

Schud de buis elke 20 tot 30 minuten krachtig met de hand om de lyse te verbeteren. Triturate de lysed weefsel mix met behulp van vijf milliliter serologische pipet, en een een milliliter pipet tip om het weefsel knobbel in de enkele cel suspensie te scheiden. Om de enzymatische lyse van het weefsel te stoppen, voeg twee tot drie keer zoveel commercieel verkrijgbaar CSC-onderhoudsmedium toe als het volume van het gelyseerde weefsel.

Geef de verteerde celsuspensie door een 100 micrometer celzeef die op een 50 milliliter conische buis wordt geplaatst om onverteerd weefselstukken te verwijderen. Om de cellen te scheiden van dichtheidgradiënt centrifugatie, voeg 37 graden Celsius, voorverwarmde, polysucrose en natriumdiatrizoaat oplossing aan een 50 milliliter conische buis. Voeg vervolgens voorzichtig en langzaam een gelijk volume van filtraat over de oplossing, het vermijden van een vermenging van de twee oplossingen.

Het is van cruciaal belang om filtraat toe te voegen over polysucrose en natriumditrizoaatoplossing langzaam zonder te mengen door de buis op 45 graden en tegen de wand van de buis te kantelen. Voeg geen polysucrose en natriumditrizoaatoplossing toe boven het filtraat. Plaats de buis heel langzaam in een swing emmer centrifuge ervoor te zorgen niet om de oplossingen te verstoren.

Centrifuge op 500 keer G gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur ingesteld op een lagere versnelling en vertraging snelheid om te voorkomen dat het mengen van de twee oplossingen, en voor een goede scheiding van de cardiale stamcellen. Het is van cruciaal belang om de gradiëntoplossing zeer zorgvuldig te plaatsen zonder verstoring in de centrifuge. Zet de versnelling en vertraging van de centrifuge moet op laagste snelheid, zoals een of nul.

Gebruik een pipet van een millimeter om de buffy jas met de CSCs samen met extra oplossing van de bovenste laag naar een 15 milliliter gesteriliseerde buis over te brengen. Voeg een gelijk volume CSC-onderhoudsmedium toe en meng het goed om de resterende polysucrose- en natriumditrizoaatoplossing te neutraliseren. Centrifuge deze schorsing op 500 keer G gedurende vijf minuten op vier graden Celsius.

Gooi de supernatant weg. Herhaal het wassen van CSC's met onvolledige DMEM-oplossing ten minste twee keer. Centrifuge op 500 keer G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius om zich te ontdoen van eventuele resterende polysucrose en natriumtrizoaat oplossing.

Na het verwijderen van de supernatant, resuspend de pellet met gezuiverde CSCs in een milliliter CSC onderhoud medium, en vervolgens tellen de cellen. Zaad de CSC's in een zes-put cultuur plaat bekleed met een 0,02%gelatine oplossing met 0,5%fibronectin, en voeg twee milliliter van volledig onderhoud medium. Kweek de cellen op 37 graden Celsius in 5%CO2.

Wanneer de CSC-cultuur confluency bereikt, breng de cellen over naar een nieuwe gelatine en fibronectine gecoate plaat zoals beschreven in het tekstprotocol. Kweek deze P0 CCs in volledig CSC-onderhoudsmedium bij 37 graden Celsius in een CO2-incubator van 5%tot confluent. Herhaal de celoverdracht naar een nieuwe plaat om P1-cscs te maken die kunnen worden gebruikt voor verdere experimenten.

Om de CSC-cultuur in de beginfase te behouden, worden de cellen verder gezaaid zoals beschreven in het tekstprotocol. Om de gekweekte cellen te karakteriseren, plaatst u de CSC met plaat op het doel van een fluorescerende microscoop. Gebruik tien keer vergroting om de cellen te concentreren.

Als u de cellen wilt observeren, gebruikt u diafragmafasecontrast en verhoogt u de vergroting tot 20 keer door de objectieve lens te wijzigen en vervolgens de CSCs in beeld te brengen. Na het uitvoeren van de immunostaining, plaats de cultuur plaat onder de fluorescentie microscoop. Focus de cellen op verschillende vergrotingen en observeer de cellen onder fasecontrast en verschillende excitatiefilters en sla de afbeeldingen op.

Voor celdifferentiatie, groeien de CSCs in een zes-put plaat met twee milliliter van 37 graden Celsius, voorverwarmd CSC onderhoud medium. Wanneer de cellen bereiken 80 tot 95%samenvloeiing, vervang het onderhoudsmedium met twee milliliter, 37 graden Celsius, voorverwarmde cardiomyocyten differentiatie medium. Incubeer bij 37 graden Celsius, in een 5%CO2 voor maximaal twee tot drie weken.

Verander het differentiatiemedium om de twee tot drie dagen. Tijdens de middelgrote verandering, observeer de celmorfologie onder een microscoop om de goede cultuurvoorwaarden te verzekeren. Na 12 dagen, beeld de cellen voor differentiatie markers volgens een standaard immunostaining protocol.

Twee tot drie dagen gekweekte CSCs tonen een spindelvormige morfologie wanneer waargenomen onder een fase-contrast microscoop. Na zeven dagen van cultuur, tonen ze een verandering in de morfologie steeds langwerpig. Na immunostaining voor markers van pluripotentie, cscs tonen uitdrukkingen van OCT4, SOX2, en Nanog.

Bovendien, CSC's vermenigvuldigen zich in cultuur medium, en druk de proliferatie marker Ki67. Om de hartoorsprong van CSC's te karakteriseren, werd de expressie van cardiale markers onderzocht en bleken de cellen positief te zijn voor cardiale markers Sca-1, NKX2.5 en GATA4. Na het kweken in cardiomyocyte differentiatie medium voor 12 dagen, gedifferentieerde CSCs tonen expressie van cardiomyocyte markers ACTININ, en TROPONIN-I.

Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om het mengen van de gradiëntoplossing en het filtraat niet toe te staan. Het is ook belangrijk om de acceleratie en vertraging op de laagste snelheid in te stellen. Wie ze vervuilt, wordt aanbevolen om alle celisolatieproces in een bioveiligheidskast uit te voeren.

Na deze procedure kunnen andere methoden worden uitgevoerd, zoals op magnetische kraal gebaseerde scheiding of stromingscytometische celsorlingmethoden om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals hoe duidelijk is de homogene populatie van hartstamcellen? Crack radius in een cardiale stamcel is grote markers, en er zijn verschillen in de richting van cardiomyocyten. Na de ontwikkeling zal deze techniek de weg vrijmaken voor de onderzoekers op het gebied van hart- en vaatziekten die vaak een hoge opbrengst van cardiale stamcellen uit muishart hebben die belangrijk kunnen zijn voor regeneratieve therapie bij ischemische hartfalen.

Vergeet niet dat het werken met chirurgisch mes, bleekmiddel en DMSO gevaarlijk kan zijn, en voorzorgsmaatregelen zoals het gebruik van personeelsbeschermingsmiddelen, PPE, moeten altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.