Gebruik van Electron paramagnetisch resonantie in biologische monsters bij kamertemperatuur en 77 K

Gedysregeerde redox signalering is betrokken bij de pathogenese van diverse ziekten. De studie van redoxbiologie vereist de nauwkeurige detectie van reactieve zuurstofsoorten in verschillende cellulaire en weefselcompartimenten. EPR spectroscopie is de enige methode die vrije radicalen ondubbelzinnig meet.

Dit protocol toont een praktische methode voor het hanteren en opslaan van biologische monsters voor EPR-spectroscopie. Deze protocollen illustreren het gebruik van EPR- en spinsondes in twee representatieve modellen. Hoewel ze kunnen worden aangepast om de actieve soorten in andere biologische omgevingen te evalueren.

Het ontwerp van het experiment en de behandeling van het monster zijn van cruciaal belang voor de reproduceerbaarheid ervan. We raden u aan de celdichtheid te overwegen en te zorgen voor de juiste tijdcontroles. Begin door ruwe 264.7 cellen met één milliliter van Krebs-Henseleit Buffer of KHB, per goed voorzichtig te wassen.

En behandel de cellen met 500 microliters khb, aangevuld met 100 micromil DTPA per put. Om voorbehandeling met superoxide dismutase, voeg 15 microliter van superoxide dismutase voorraad, of voertuig, om elke put, en plaats de plaat op 37 graden Celsius gedurende 10 minuten. Voeg aan het einde van de voorbehandeling van superoxide dismutase toe, voeg 12,5 microliter van 10 millimolar CMH en 40 microliter van 125 micromolar PMA-werkoplossing toe aan de juiste putten en broed gedurende 50 minuten in de 37 graden Celsius.

Plaats onmiddellijk de platen op ijs en verzamel de buffer van elke put in individuele 1,5 milliliter buizen op ijs. Voeg vervolgens 100 microliter verse KHB plus DTPA toe aan elke put en schraap de cellen voorzichtig van de bodem van elke put. Dan resuspend de cel suspenen met pipetting en breng de cellen in individuele 1,5 milliliter buizen op ijs.

Voor superoxidedetectie bij kamertemperatuur laadt u eerst 50 microliter van één buffer of celmonster in een capillaire buis en sluit u de buis af. Plaats de buis onmiddellijk in de elektronenparamagnetische resonantie, of EPR, spectrometer en stel de EPR-acquisitieparameters in voor kamertemperatuurmetingen. Test altijd een leeg monster van buffer met dezelfde concentratie sonde behandeld onder dezelfde experimentele omstandigheden als een controle.

Voor superoxide detectie op 77 graden Kelvin, laad 150 microliter van een monster in een een tot twee inch stuk van rechte polytetrafluorethyleen, of PTFE, buizen, met een rubberen stop aan de ene kant. Sluit het andere uiteinde van de buis af met een tweede stop en bevries het monster in vloeibare stikstof. Verwijder vervolgens snel de stoppers en plaats de PTFE-slang in een gelabelde cryotube voor opslag van vloeibare stikstof.

Vul voor EPR-metingen de vingerdewar van de EPR-spectrometer met vloeibare stikstof en plaats de PTFE-buizen die het monster bevatten in de vloeibare stikstof. Plaats de vingerdewar in de EPR-spectrometer en stel de EPR-acquisitieparameters voor metingen in op 77 graden Kelvin. Voor ROS-detectie in bevroren longweefsel, plaats het weefsel op droog ijs en gebruik pincet om het flash-bevroren weefsel op droog ijs te stabiliseren.

Snijd het monster in vijf 15 milligram stukken, en weeg de stukken in een geterde 1,5 milliliter buis. Voeg 196 microliters khb plus DTPA en vier microliters cmh toe aan het monster en broed het longmonster gedurende een uur in een 37 graden Celsius waterbad voordat de weefselfragmenten met een korte centrifugatie worden gepeld. Plaats vervolgens het monster op ijs voordat u 150 microliter van het supernatant overzet in een stuk PTFE-buizen voor het bevriezen van de flitser ter voorbereiding van epr-meting, zoals zojuist is aangetoond.

Evaluatie van de totale productie van superoxide in ruwe 264,7 cellen gestimuleerd met PMA zoals aangetoond, toont aan dat de nitroxideconcentratie in zowel de celsuspensie als de buffer van de met PMA behandelde cellen vergelijkbaar is, vanwege de doorlaatbare aard en het snelle evenwicht van de spinsonde. De nitroxide radicalen signaal toeneemt in ruwe 264,7 cellen gestimuleerd met PMA, in vergelijking met controlecellen, maar niet in cellen voorbehandeld met cel-ondoordringbare superoxide dismutase. De concentratie nitroxide verkregen bij lage temperaturen in ruwe 264,7 cellen na stimulatie met PMA wordt ook verzwakt in aanwezigheid van superoxide dismutase in overeenstemming met de kamertemperatuurgegevens.

De nitroxideconcentratie wordt verhoogd in het bloed en bronchoalveolaire lavagevloeistof van bleomuizen en behandelde muizen, evenals in de supernatants van geoogste stukjes longweefsel van bleo muizen en gewonde dieren, in vergelijking met PBS-behandelde controles. Verder, na retro-orbitale spin sonde injectie, bleo muizen en behandelde dieren tonen een hogere spin sonde signaal in vergelijking met controles. Deze praktische protocollen zullen onderzoekers in staat stellen om vrije radicalenproductie te testen in verschillende cellulaire compartimenten en biologische monsters door EPR, inclusief metingen van lage temperaturen.